Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

Resumo

Um protocolo de triagem eficiente é apresentado para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de Ralevic em células-tronco glioblastoma (GSCs). O ensaio baseia-se em um repórter de diferenciação de células-tronco no qual a expressão da GFP reforçada (eGFP) é conduzida pelo promotor GFAP humano.

Resumo

Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e mais letal em adultos, causando cerca de 14.000 mortes a cada ano só nos EUA. Sobrevida média após o diagnóstico é menor que 15 meses com quimioterapia máxima de temozolomide, radiação e ressecção cirúrgica. Os desafios inerentes ao desenvolvimento de tratamentos mais eficazes de GBM tornaram-se cada vez mais claros e incluem sua invasividade inflexível, sua resistência aos tratamentos padrão, sua complexidade genética e molecular adaptabilidade e subpopulações de GBM células com semelhanças fenotípicas de células-tronco normais, doravante conhecido como glioblastoma as células-tronco (GSCs). Porque GSCs são necessários para o crescimento do tumor e progressão, terapia baseada em diferenciação representa uma modalidade de tratamento viável para estas Neoplasias incuráveis.

O seguinte protocolo descreve uma coleção de procedimentos para estabelecer um alto throughput plataforma vista a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de GSC Ralevic de triagem. No núcleo do sistema é uma proteína ácida fibrilar glial (GFAP) repórter-construção de diferenciação. O protocolo contém os seguintes procedimentos gerais: (1) estabelecer linhas de repórter GSC diferenciação; (2) testar/validar a relevância do repórter, a capacidade de autorenovação / clonogenic GSC; e triagem de drogas de alta capacidade-citometria de fluxo com base (3).

A plataforma de triagem fornece uma abordagem simples e barata para identificar pequenas moléculas que promovem a diferenciação de GSCs. Além disso, a utilização de bibliotecas de drogas FDA-approved possui o potencial para a identificação dos agentes que pode ser reaproveitado mais rapidamente. Também, terapias que promovem a diferenciação de células-tronco de câncer são esperadas para trabalhar em sinergia com a atual terapias "padrão de cuidados" que foram mostradas para atacar e eliminar as células do câncer diferenciado principalmente mais.

Introdução

Estudos recentes têm mostrado que os tumores contêm uma pequena população de células, denominadas células-tronco câncer (CSCs) ou células de tumor-iniciando, que são responsáveis pela progressão do tumor, metástase e resistência à quimioterapia e radio-terapias ^{1, 2}. a presença de câncer células-tronco e suas progênies mais diferenciados dentro de tumores é considerada fator importante promover a heterogeneidade intratumoral e, portanto, representa um grande obstáculo no tratamento de câncer³. Hierarquia de células de tumor, fornecida pela teoria de células-tronco do câncer, inspirou o desenvolvimento de novas estratégias para tratar cancros ⁴. Uma abordagem para o direcionamento de câncer células-tronco é identificar e inibir vias de sinalização que são conhecidas por serem necessárias durante o desenvolvimento embrionário do órgão afetado. Na verdade, nós e os outros anteriormente publicaram vários artigos descrevendo a exigência em curso para as células-tronco-relevantes sinalização vias neurais Sonic Hedgehog e entalhe em glioblastoma^5,6,7. Este trabalho tem ajudado no solidificando a justificativa para vários ensaios clínicos de GBM. Uma segunda abordagem para o direcionamento de câncer células-tronco é promover a sua diferenciação. Esta abordagem tem recebido muito apoio devido os resultados favoráveis de estudos pré-clínicos e clínicos no tratamento da leucemia promielocítica aguda com ácidos retinoico (ATRA, um análogo da vitamina A). Aqui ATRA foi encontrado para remover o bloco de maturação e promover câncer de diferenciação celular⁸. Mais recentemente, Piccirillo e colegas elegantemente mostraram que BMP-4 promove a diferenciação de GSC em astrócitos com anti-GBM significativos efeitos in vitro e in vivo⁹.

A justificativa para o estudo atual é baseada em uma abordagem de "engenharia invertida" para segmentação GSCs. Dada a vasta heterogeneidade presente em GBM e com pobre diferenciação, sendo uma das marcas registradas do câncer, pedimos que se nós poderia promover um fenótipo mais favorável - diferenciação em um estado de astrocyte. Aqui, não temos conhecimento prévio dos caminhos sinalização que manter GSCs em uma amostra de determinado tumor mas prefiro visam alcançar um fenótipo desejado (por exemplo, positividade GFAP).

Este relatório descreve os procedimentos utilizados para estabelecer o GSC diferenciação repórter-linhas da transdução de culturas GSC-enriquecido a Seleção clonal de GSC. Estabeleceram-se as linhas de neurosphere de glioblastoma usadas no laboratório do Professor Angelo Vescovi de pacientes com diagnóstico de glioblastoma primário no Hospital San Raffaele - Milano, Itália. Estas linhas têm sido muito estudadas em várias publicações ^{6,10,11,12,13,14}. É altamente recomendado que os indivíduos que estão interessados em implementar estas técnicas em seu laboratório determinam a relevância do repórter, a capacidade de auto-renovação de células-tronco de câncer nas células eles planejam estudar (isto é verdadeiro para qualquer repórter). Um protocolo detalhado para um dos ensaios clonogenic em vitro aceitados no campo é fornecido para realizar este^15,16. Finalmente, um protocolo detalhado descrevendo a utilização das linhas de repórter de diferenciação em um teste de drogas baseada em citometria de fluxo é fornecido no final. Da nota, da mesma forma para o sistema de diferenciação de Ralevic descrito aqui, nós temos com sucesso estabelecido e validado linhas de repórter GSC integrando um repórter (diferenciação neuronal) de MAP2:GFP. Portanto, as metodologias descrevem neste livro pode ser aplicado para estudar a diferenciação celular em várias linhagens de células.

Algumas das figuras neste relatório podem ser encontradas em uma recente publicação: "Atracurium Besylate e outro agentes de bloqueio neuromuscular promover a diferenciação de Ralevic e empobrecem o glioblastoma as células-tronco¹⁸.

Protocolo

Nota: Sistemas de repórter de lentivirus neuronal e Ralevic foram comprados como preparações de Lentivirus pré-embalados, concentradas. Conhecimento básico da técnica de citometria de fluxo é necessário. Também, para um uso completo do presente protocolo o usuário terá acesso a um citômetro de fluxo com capacidade de produção elevada (aceita placas de 96 poços como fonte de exemplo).

1. Lentivirus repórter Transcriptional sistema

Nota: Em todas as análises de fluxo cytometric, use células parentais, não-transfectadas, ou vetor-transfectadas (não fluorescente) para o estabelecimento da fluorescência de base. Além disso, observe que em todas as etapas onde a trituração mecânica é chamada para, seja gentil. Trituração dura pode matar um número significativo dos GSCs frágil e influenciar os resultados de citometria de fluxo.

1. Placa 1 x 10⁶ células em 2 mL do meio de crescimento de células-tronco neurais completa em uma placa de 6-multiwell.
2. Transduce células adicionando repórter lentivirus em uma multiplicidade de infecção (moi) igual a 5.
3. Adicione 2 µ l de polybrene para uma concentração final de 8 µ g/mL.
4. Incube as celulas em 37 ° C e 5% de CO₂ durante a noite.
5. No dia seguinte, substitua o meio de crescimento para remover vírus desacoplado. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ e incubar por 24 h.
6. Colheita de 0,5 mL do volume total; Gire para baixo as células a 360 x g durante 5 min à temperatura ambiente em um tubo cônico de 15 mL e remover o sobrenadante por aspiração. Adicionar 0,5 mL do meio de crescimento de novas células-tronco neurais para as células restantes e devolve a chapa para a incubadora para expansão contínua.
7. Acrescente 200 µ l de reagente de dissociação e incube por 5 min a 37 ° C.
8. Dissocia as células pipetando delicadamente acima e para baixo.
   Nota: Trituração dura pode resultar em morte significativa de GSCs, dissociação completa é geralmente alcançada após 20 - 30 vezes.
9. Para minimizar a fixação da célula ou agregação, adicione 800 µ l de Hank está equilibrado sal solução (HBSS) para um volume final de 1 mL.
10. Transferi 200 µ l de cada suspensão de células para um poço de uma placa de 96-multiwell.
11. Para este procedimento, use um citômetro de fluxo de bancada com capacidade de placa de 96 poços, equipada com um laser azul para excitação e com a capacidade de detectar a proteína verde fluorescente. Realizar análise de fluxo cytometric pelo menos 10.000 células viáveis para cada aquisição.
12. Determine a porcentagem de células GFP-positivo por citometria de fluxo.

2. subclone seleção, expansão e validação

1. Células de placa em 100 µ l de células-tronco neurais médio em uma densidade de 0,7 células por poço de uma placa de 96-multiwell.
2. Cultura de clones durante 11 dias a 37 ° C e 5% de CO₂. Esta etapa é altamente dependente do tipo de célula e provavelmente exigirá um ajuste com base na linha de celulares usada. Como regra geral, uma esfera de diâmetro ≥ 100 µm é uma boa indicação da presença de clonogenic GSCs no neurospheres.
3. Usando um microscópio fluorescente, equipado com um filtro FITC, marca os poços que contêm uma única neurosphere onde ~ 1-5% das células é GFP-positivo.
   Nota: Determinar o percentual exato de células GFP-positivo não é demasiado crítico neste ponto. Cada um dos subclones mais tarde será avaliado por citometria de fluxo. Esta etapa é realizada para reduzir o total número de clones a serem analisados com ênfase na neurospheres que se originam por indiferenciado, GFAP-negativo, GSC.
4. Expanda o repórter selecionado clones até que haja um número suficiente de células para análise por citometria de fluxo. Um poço sub confluente da placa contendo ≤ 1.5x10⁵ células/mL 6-multiwell deve fornecer um número suficiente de células.
   Nota: Um procedimento detalhado para o isolamento e a expansão de GSCs é disponível ¹⁷.

3. a determinação da expressão GFAP:GFP por citometria de fluxo

1. Recolher uma alíquota de células (0,5 mL) de cada clone de repórter e controles não-transfectadas para determinar o percentual exato de células GFP-positivo. Considerando os clones de repórter que contêm as células GFP-positivo de ~ 1-5%.
2. Girar as células a 360 x g durante 5 min à temperatura ambiente e retire o sobrenadante por aspiração.
3. Cada pellet, adicionar 200 µ l de reagente de dissociação de célula e incubar os tubos num banho de água situado a 37 ° C.
4. Triture as células delicadamente para obter uma suspensão de célula única (geralmente entre 20 a 30 vezes).
5. Para minimizar a fixação da célula ou agregação, adicione 800 µ l HBSS até um volume final de 1 mL.
6. Transferi 200 µ l por alvéolo de uma placa de 96-multiwell de cada suspensão de células.
7. Para este procedimento, use um citômetro de fluxo de bancada com capacidade de placa de 96 poços. Realizar análise de fluxo cytometric pelo menos 10.000 células viáveis para cada aquisição.

4. ELDA auto-renovação ensaio para avaliar a capacidade de Clonogenic

Nota: Para controles, tanto dos pais, não transfectadas, bem como expressando GFP células transfectadas de lentivirus, deve ser usado para determinar o potencial de clonogenic relativa das linhas repórter GSC diferenciação para as culturas de GSC originais do qual foram derivada.

1. Dissocia a diferenciação-repórter subclones em suspensões de célula única conforme descrito acima.
2. Células de placa em placas de 96-multiwell em 100 µ l de meio de crescimento de células-tronco neurais completa em densidades de célula variando entre 5 e 500 células por poço.
3. Incube as células 9 a 11 dias a 37 ° C e 5% de CO₂.
4. Ponto positivos poços por visualização direta dos neurospheres sob um microscópio de luz. Um bem deve ser considerado "positivo" se ele contém pelo menos um único grande neurosphere.
5. Conecte os dados: total poços analisados e o número de poços positivos usando a interface online de ELDA disponível em http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5. drogas biblioteca diluição preparação

1. Remover placas de biblioteca de armazenamento a-80 ° C, cubra com papel alumínio (proteger compostos sensíveis à luz). Descongelar por aproximadamente 30 min a uma hora em temperatura ambiente.
2. Use uma pipeta multicanal 12 canais para diluir os compostos de biblioteca para 0,2 mM no meio de células-tronco neurais completa. DMSO diluído a 10% em média de crescimento
   Nota: A concentração final de DMSO deve ser 0,1% quando adicionada às células. Uma maior concentração de DMSO na cultura pode resultar em toxicidade. Por este motivo, é aconselhável testar a sensibilidade de DMSO em linhagem celular usada, antes do tratamento.
3. Usar o DMSO como controle de veículo para tratar células encontradas nas colunas esquerdas e direita de cada placa (colunas 1 e 12; Poços da a H).
4. Cobrir as placas de biblioteca diluídos com folha de alumínio e retornar as chapas originais da biblioteca para o freezer-80 ° C para armazenamento a longo prazo.

6. drug Screen

Nota: Células tratada com DMSO devem ser usadas para definir a fluorescência de base e ajustar gating.

1. Placa de 5 x 10³ células em uma placa de 96-multiwell em 99 µ l de meio de cultura de células-tronco neurais completa.
2. Usando uma pipeta multicanal 12 canais, trate as células com compostos de biblioteca diluído a uma concentração final de 2 µM (1 µ l de droga de 0,2 mM em 99 µ l de suspensão de células) ou com DMSO (controle). Incube as placas por 72 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
3. Usando uma pipeta multicanal 12 canais adicionar 150 µ l de reagente de dissociação de celular a cada poço e incube por 20 min a 37 ° C.
4. Dissocia as células por moer suavemente com uma pipeta multicanal 12 canais até alcançar a suspensão de célula única (geralmente entre 20 a 30 vezes). A quantidade de tempo necessária para dissociar neurospheres completamente irá variar entre linhas GSC. Enquanto o eritrócito recomendada de dissociação (ver materiais) é seguro e incubação por até 45 minutos não teve efeito sobre viabilidade em várias linhas de GSC testadas, verifique-se para cada linha de GSC para ser utilizado na triagem.
   Nota: O volume final em cada bem deve ser aproximadamente 250 µ l (100 µ l de suspensão de células + 150 µ l de reagente de dissociação celular).
5. Determine a porcentagem de células expressando o repórter GFAP:GFP por citometria de fluxo. Padrão de uso da estratégia de retenção. Primeiro, trama para a frente e lateral espalha-se para ter uma noção geral do tamanho da célula e a viabilidade. Em seguida, coloque um portão na população viável de célula única. Isso é a população para a qual será determinada fluorescência verde (eGFP). Qualquer composto que resulta em um aumento da percentagem de GFP-positivo células por mais de três desvios-padrão sobre controle (DMSO-tratada) é considerada como um positivo "hit". Este limiar deve ser ajustado de acordo com a aplicação específica e o rigor desejado.
   Nota: Para o alto throughput tela recomenda-se usando um único subclone de repórter de GSC. Após a identificação de ocorrência, cada batida deve ser validada contra subclones de repórter adicionais da mesma linha GSC. Para aumentar a confiança para verdadeiros hits é também recomendar testes compostos contra repórter subclones isolaram de diferentes GSC neurospheres linhas.

Resultados

Três linhas independentes neurospheres paciente-derivados foram transfectadas com o repórter Ralevic de lentivirus codificação para uma proteína verde fluorescente (GFP) fundida em-frame com uma gaveta de resistência Zeocin e conduzidas pelo elemento humano para a promotora GFAP ( Figura 1). Próximo clones individuais foram isolados por chapeamento 0,7 células por poço em um prato bem 96 (Figura 2), este foi seguido por determina...

Discussão

Enquanto a maioria dos estudos anteriores de GSCs centradas-se principalmente os marcadores que os definem, neste estudo decidimos tomar a abordagem inversa. Focamos principalmente em progênies diferenciadas gerados pelo GSCs (por exemplo, células expressando marcadores neuronais e Ralevic). Aqui vamos demonstrar a utilização de uma sistema, que é baseado na expressão humana do promotor-dependente GFAP de GFP de despistagem de drogas baseada em célula alto throughput. Todos os experimentos foram realizados utilizando lin...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (Solução de Sal Balanceada de Hank)	Sigma Aldrich	H6648
Repórter de Diferenciação GFAP Humana (pGreenZeo, Vírus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
reagente descartável estéril de 50 ml reservatórios	Corning	4870
Placa de 6 poços	Thermo Fisher Scientific	130184
placa de 96 poços	Falcon	353072
Biolite T25 cm² Garrafa Térmica Ventilada	Fisher Scientific	130189
Biolite T75 cm² Garrafa Ventilada	Thermo Fisher Scientific	130190
Tubos de centrífuga de 15 ml	Celltreat	229411
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Pipeta multicanal Fisher Scientific	05-408-129
Ovation, 12 canais, 0,5 - 20uL	Pipeta multicanal VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation, 12 canais, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
Pontas de pipeta multicanal de 12 canais 25 μ l	Tecnologias VistaLab	4060-1002
Ponteiras de pipeta multicanal de 12 canais 250 μ l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT	EMD Millipore	0500-4005
NIH Coleções Clínicas 1 e 2 bibliotecas de pequenas moléculas	Evotec
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Para a preparação de meios de células-tronco neurais (500 mL)			Concentração final
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0,20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Sal de heparina sódica	Sigma	Aldrich H3149	0,0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5.4 mM
Insulina-Transferrina- Selênio (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14.5 mM
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progesterona	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescine	Sigma Aldrich	P5780	4.8 µ M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF,	Human GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
Filtro de Frasco, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Use para filtrar meios esterilizados