Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.
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Artigo de método
Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A análise das alterações de expressão do gene global é uma ferramenta valiosa para identificar novos caminhos subjacentes fenótipos observados. O peixe-zebra é um excelente modelo para avaliação rápida do transcriptoma toda de populações de células individuais ou todo animal devido à facilidade de isolamento do RNA de um grande número de animais. Aqui apresenta-se um protocolo para análise de expressão de gene global em embriões de peixe-zebra usando a sequenciação do ARN (RNASeq). Descrevemos a preparação do RNA de embriões de todo ou de populações de células obtidas usando célula de triagem em animais transgénicos. Também descrevemos uma abordagem para análise de dados RNASeq para identificar caminhos enriquecidos e termos de Gene Ontology (GO) em conjuntos de dados de expressão de gene global. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para a validação das alterações de expressão do gene usando transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Esses protocolos podem ser usados para análise comparativa de controle e experimental de moda de zebrafish para identificar alterações de expressão do gene de romance e fornecem a introspecção molecular de fenótipos de interesse.
Introdução
Análise comparativa da expressão gênica global é uma ferramenta valiosa para identificar novos genes, contribuindo para fenótipos observados. Tais análises normalmente contam com avaliação quantitativa da abundância de transcrição em comparação entre experimental e amostras de controlo. Abordagens específicas, tais como qRT-PCR são relativamente rápida e exata para investigação de alterações de expressão de gene único. A sequenciação do ARN (RNASeq) oferece uma abordagem ampla, livre de hipótese para identificar alterações significativas na expressão gênica entre as amostras, tornando-se agora o padrão para tais investigações através de sistemas experimentais.
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Protocolo
todos os protocolos animais descritos abaixo estão em conformidade com e aprovado pela Universidade de Maryland institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC).
1. preparação do embrião
- gerar embriões através de acasalamento natural
- embriões de cultura para 3 meses de idade, reprodutiva maturidade 5 , 8 .
- Separe peixes adultos masculinos e femininos da estirpe desejada em tanques de acasalamento divididos na noite antes da coleta de embrião e adicionar 2 machos e 3 fêmeas para cada tanque.
Nota: Uso da cepa transgê....
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Resultados
Classificação de diferencialmente expressos Genes:
Para identificar genes diferencialmente expressos na fase larval de zebrafish modelos de síndrome de Alström e síndrome de Bardet-Biedl (BBS), escolhemos a qualquer alms1 ou bbs1 transcrições injetando validados anteriormente da tala-MOs em bloqueio zebrafish do selvagem-tipo embriões16,17. Em 5 dias pós f.......
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Discussão
A abordagem descrita no presente protocolo oferece uma estratégia relativamente rápida e econômica para a análise do transcriptoma-nível de animais inteiros ou populações de célula específica classificada. O peixe-zebra fornece um modelo de vantajoso para este tipo de estudo devido a facilidade e a rapidez na geração de grandes quantidades de começar o material, a facilidade de aplicação genética ou ambientais condições experimentais e a disponibilidade de um grande espectro de linhas transgénicas repórter permitindo iso.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) e T32DK098107 (T.L.H. e J.E.N.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes comerciais | |||
| TriZol | Reagente de lise | de 15596026 | Thermo Scientific |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | tampão de dissociação 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | tampão de dissociação 2 |
| Água tratada com DEPC | Sigma | 95284 | |
| Kit de conversão de cDNA FirstStrand | Thermo Scientific | K1621 | cDNA |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| clorofórmio | Sigma Aldrich | 288306 | |
| acetato de sódio | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Linhagens de Peixe-Zebra | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Nome | < strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| 40 filtro de células de mícron | Sigma | CLS431750 | |
| tubo FACS | BD Falcon | 352063 | |
| hemocitômetro | Sigma | Z359629 | |
| Microscópio de dissecação | Zeiss | ||
| Microscópio invertido | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Tanques de acasalamento 1.0L Conjunto de tanques de cruzamento | Aquaneering | ZHCT100 | |
| tubo FACS 5 mL tubo de polipropileno | BD Falcon | 352063 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo< | strong>Comentários |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Análise de Enriquecimento | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
Referências
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.
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Reimpressões e permissões
