Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Timothy L. Hostelley; Jessica E. Nesmith; Norann A. Zaghloul

doi:10.3791/56187

Method Article

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

DOI:

10.3791/56187

⸱

October 27th, 2017

Timothy L. Hostelley*¹ , Jessica E. Nesmith*¹ , Norann A. Zaghloul¹

¹Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A análise das alterações de expressão do gene global é uma ferramenta valiosa para identificar novos caminhos subjacentes fenótipos observados. O peixe-zebra é um excelente modelo para avaliação rápida do transcriptoma toda de populações de células individuais ou todo animal devido à facilidade de isolamento do RNA de um grande número de animais. Aqui apresenta-se um protocolo para análise de expressão de gene global em embriões de peixe-zebra usando a sequenciação do ARN (RNASeq). Descrevemos a preparação do RNA de embriões de todo ou de populações de células obtidas usando célula de triagem em animais transgénicos. Também descrevemos uma abordagem para análise de dados RNASeq para identificar caminhos enriquecidos e termos de Gene Ontology (GO) em conjuntos de dados de expressão de gene global. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para a validação das alterações de expressão do gene usando transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Esses protocolos podem ser usados para análise comparativa de controle e experimental de moda de zebrafish para identificar alterações de expressão do gene de romance e fornecem a introspecção molecular de fenótipos de interesse.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análise comparativa da expressão gênica global é uma ferramenta valiosa para identificar novos genes, contribuindo para fenótipos observados. Tais análises normalmente contam com avaliação quantitativa da abundância de transcrição em comparação entre experimental e amostras de controlo. Abordagens específicas, tais como qRT-PCR são relativamente rápida e exata para investigação de alterações de expressão de gene único. A sequenciação do ARN (RNASeq) oferece uma abordagem ampla, livre de hipótese para identificar alterações significativas na expressão gênica entre as amostras, tornando-se agora o padrão para tais investigações através de sistemas experimentais.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

todos os protocolos animais descritos abaixo estão em conformidade com e aprovado pela Universidade de Maryland institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC).

1. preparação do embrião

gerar embriões através de acasalamento natural
1. embriões de cultura para 3 meses de idade, reprodutiva maturidade ⁵ ^, ⁸.
2. Separe peixes adultos masculinos e femininos da estirpe desejada em tanques de acasalamento divididos na noite antes da coleta de embrião e adicionar 2 machos e 3 fêmeas para cada tanque.
  Nota: Uso da cepa transgên....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Classificação de diferencialmente expressos Genes:

Para identificar genes diferencialmente expressos na fase larval de zebrafish modelos de síndrome de Alström e síndrome de Bardet-Biedl (BBS), escolhemos a qualquer alms1 ou bbs1 transcrições injetando validados anteriormente da tala-MOs em bloqueio zebrafish do selvagem-tipo embriões¹⁶^,¹⁷. Em 5 dias pós f.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A abordagem descrita no presente protocolo oferece uma estratégia relativamente rápida e econômica para a análise do transcriptoma-nível de animais inteiros ou populações de célula específica classificada. O peixe-zebra fornece um modelo de vantajoso para este tipo de estudo devido a facilidade e a rapidez na geração de grandes quantidades de começar o material, a facilidade de aplicação genética ou ambientais condições experimentais e a disponibilidade de um grande espectro de linhas transgénicas repórter permitindo iso.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) e T32DK098107 (T.L.H. e J.E.N.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentes comerciais
TriZol	Reagente de lise	de 15596026	Thermo Scientific
TrypLE	Gibco	12604013	tampão de dissociação 1
FACSMax	Genlantis	T200100	tampão de dissociação 2
Água tratada com DEPC	Sigma	95284
Kit de conversão de cDNA FirstStrand	Thermo Scientific	K1621	cDNA
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master Mix
FACS buffer	Fisher Scientific	50-105-9042
clorofórmio	Sigma Aldrich	288306
acetato de sódio	Sigma Aldrich	S2889
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Linhagens de Peixe-Zebra
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Nome	< strong>Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
40 filtro de células de mícron	Sigma	CLS431750
tubo FACS	BD Falcon	352063
hemocitômetro	Sigma	Z359629
Microscópio de dissecação	Zeiss
Microscópio invertido	Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq	Illumina
LightCycler 480	Roche
Tanques de acasalamento 1.0L Conjunto de tanques de cruzamento	Aquaneering	ZHCT100
tubo FACS 5 mL tubo de polipropileno	BD Falcon	352063
Nome	Empresa	Número de catálogo<	strong>Comentários
Software
Excel	Microsoft
Consensus Path DB	http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Análise de Enriquecimento	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles