Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2'- O -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular

Summary

Este artigo fornece um procedimento detalhado sobre a síntese em fase sólida, a purificação e a caracterização de dodecamers de ARN modificados na posição C2'- O . As análises fotométricas UV-vis e dicroísmo circular são usadas para quantificar e caracterizar aspectos estruturais, ou seja , de uma única linha ou de duas vertentes.

Abstract

A síntese em fase sólida tem sido utilizada para obter polímeros canônicos e modificados de ácidos nucleicos, especificamente de DNA ou RNA, o que tornou uma metodologia popular para aplicações em vários campos e para diferentes fins de pesquisa. O procedimento aqui descrito concentra-se na síntese, purificação e caracterização de dodecamers de RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' contendo zero, uma ou duas modificações localizadas na posição C2'- O . As sondas são baseadas em grupos 2-tiofenilmetilo, incorporados em nucleótidos de ARN através de síntese orgânica padrão e introduzidos nos oligonucleótidos correspondentes através dos seus respectivos fosforamiditos. Este relatório faz uso da química da fosforamidita através das quatro nucleobases canônicas (Uridina (U), Citosina (C), Guanosina (G), Adenosina (A)), bem como nucleotídeos funcionalizados com 2-tiofenilmetilo modificados no 2'- O- posição; No entanto, a metodologia é favorável para uma grande variedadeMuitas modificações que foram desenvolvidas ao longo dos anos. Os oligonucleótidos foram sintetizados em um suporte de vidro de poro controlado (CPG) seguido por clivagem da resina e desprotecção em condições padrão, isto é , uma mistura de amônia e metilamina (AMA) seguida de fluoreto de hidrogênio / trietilamina / N-metilpirrolidinona. Os oligonucleótidos correspondentes foram purificados por meio de eletroforese de poliacrilamida (20% de desnaturação) seguido por eluição, dessalinização e isolamento através de cromatografia de fase reversa (Sep-pak, coluna _C18 ). A quantificação e os parâmetros estruturais foram avaliados através de análise fotométrica de dicroísmo circular (CD-UV) visível ultravioleta (UV-vis), respectivamente. Este relatório pretende servir como um recurso e guia para iniciantes e especialistas pesquisadores interessados ​​em embarcar neste campo. Espera-se que sirva como um trabalho em andamento à medida que novas tecnologias e metodologias são desenvolvidas. A descrição das metodologias e técnicas dentroO documento da S corresponde a um sintetizador de DNA / RNA (remodelado e comprado em 2013) que utiliza química de fosforamidite.

Introduction

A síntese em fase sólida para obter oligonucleótidos de DNA / RNA é uma ferramenta poderosa que serviu várias aplicações em vários campos desde a década ^de 1970 ^{1 , 2 , 3} usando blocos de construção de fosforamidita ⁴ . Exemplos de sua ampla influência incluem: seu impacto na rotulagem ( através de reações de química de clique) ⁵ , sondagem estrutural ⁶ e tecnologias anti-sentido ⁷ , bem como a elucidação de mecanismos biológicos ^....

Protocol

1. Síntese em fase sólida de oligonucleótidos de ARN

1. Preparação de soluções contendo cada fosforamidite (Tabela 1).
   1. Contar o número de nucleótidos e encaixar na equação n + 1 (onde n = número de nucleótidos) correspondente a cada base e preencher a tabela com os valores faltantes. Volume = 0,15 mL por nucleotídeo a uma concentração de 0,1 M, dissolvido em acetonitrilo anidro.
   2. Pesar cada fosforamidite em frascos âmbar de 10 mL secados no forno (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) e coloque imediatamente sob vácuo usando um dessecador contendo um agente de secagem.
   3. Encha o dessecador com árgon s....

Results

A síntese de dodecamers de RNA contendo zero, uma ou duas modificações de 2-tiofenilmetilo na posição C2'- O é descrita juntamente com a sua correspondente purificação e caracterização. Além disso, está incluída uma descrição detalhada da análise estrutural que foi realizada via CD.

As quatro cadeias de ARN (incluindo uma cadeia com uma sequência complementar) foram obtidas através de síntese em fase sólida, que foi s.......

Discussion

A intenção deste manuscrito é servir como um guia para pesquisadores no campo, iniciante ou especialista, para alcançar com sucesso ou melhorar a síntese de oligonucleótidos de DNA ou RNA. A metodologia descrita enfoca o uso de síntese de fase sólida usando um sintetizador automatizado de DNA / RNA através de química padrão de fosforamidite. O relatório descreve uma descrição passo-a-passo da síntese, purificação e caracterização de dodecamers de RNA. Além disso, o uso de CD é utilizado para identificar motivos estrutur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbsolveTM	PerkinElmer	6NE9711
Acetonitrila 99,9%, Grau HPLC	Fisher Scientific	75-05-8
Acetonitrila 99,9%, anidro para sequenciamento de DNA	Fisher BioReagents	75-05-8
Acrilamida, 99+%	ACROS Organics	164850025
Cloreto de amônio 98+%	Alfa Aesar	12125-02-9
Citrato de amônio, dibásico 98%	Sigma Aldrich	3012-65-5
Fluoreto de amônio 98.0%, grau ACS	Alfa Aesar	12125-01-8
Hidróxido de amônio 28 - 30% em água, ACS Plus	Fisher Chemical	1336-21-6
Persulfato de amônio	ACROS Organics	1444
Argônio-pureza ultra alta	Airgas	7440-37-1
Bis-acrilamida Ultra puro	VWR-Amresco	172
Ácido bórico	Fisher Scientific	A73-1
Dietilpirocarbonato, 97%	ACROS Organics	A0368487
Etanol, anidro, grau histológico	Fisher Chemical	64-17-5
Ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico desidratar 100,2%	Fisher Chemical	6381-92-6
Formamida	Thermo Scientific	75-12-7
Ácido clorídrico, 36.5 - 38.0%, Certificado ACS Plus	Fisher Chemical	7647-01-0
Cloreto de magnésio hexahidratado, 99%	Fisher Scientific	7786-30-3
Metanol, 99.9%,  Grau HPLC	Fisher Chemical	67-56-1
Metilamina 40% em água	Sigma Aldrich	74-89-5
1-Metil-2-pirrolidinona, e Hidratado, 99,5%	Aldrich	872-50-4
Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)	MDS SCIEX	1020157
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11
Acetato de sódio, anidro 99,2%, Certificado ACS	Fisher Chemical	127-09-3
Cloreto de sódio, 100,5%, Certificado ACS	Fisher Chemical	7647-14-5
Fosfato de sódio monobásico di-hidratado 99,0%	Sigma	13472-35-0
2',4' Trietilamina, 99+%	Alfa Aesar	121-44-8
TEMED	Amresco	761
Trihidrofluoreto de trietilamina, 98%	Aldrich	73602-61-6
Ácido trifluoroacético, 99%	Alfa Aesar	76-05-1
6'-Trihidroxiacetofenona monohidratado 98%	Sigma Aldrich	480-66-0
Tris Base	Fisher Scientific	BP154-3
Ureia	Fisher Scientific	U15-3
Reagents para a síntese de RNA:
Mistura de desbloqueio, 3% de ácido tricloroacético em diclorometano	Glen Research	40-4140-57
Cap Mix A, THF/Piridina/Anidrido acético	Glen Research	40-4110-52
Cap Mix B, 10% 1-metilimidazol em THF	Glen Research	40-4120-52
Ativador, 0.25 M 5-etiltio-1H-tetrazol em acetonitrila anidra	Glen Research	30-3140-52
Solução Oxidante, 0.02 M de iodo em THF/Piridina/Água	Glen Research	40-4330-52
U-RNA-CPG	Glen Research	20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG	Glen Research	20-3324-xx
Ac-G-CE Fosforamidita	Glen Research	10-3025-xx
U-CE Fosforamidita	Glen Research	10-3030-xx
Ac-C-CE Fosforamidita	Glen Research	10-3015-xx
Bz-A-CE Fosforamidita	Pesquisa Glen	10-3003-xx