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Artigo de método

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

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DOI:

10.3791/56191

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9 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1UCLA Immunogenetics Center, Department of Pathology and Laboratory Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Neste artigo

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Resumo

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Resumo

Dentro do sistema imunológico inato, linfócitos efetores conhecidos como natural killer (NK) células desempenham um papel essencial na defesa do hospedeiro contra células aberrantes, eliminando especificamente tumoral e Viralmente infectado as células. Aproximadamente 30 defeitos conhecidos monogénicas, juntamente com uma série de outras condições patológicas, causam ou funcional ou clássica NK célula deficiência, manifestando-se na reduzida ou ausente atividade citotóxica. Historicamente, a citotoxicidade foi investigada com métodos radioativos, que são complicados, caros e potencialmente perigosos. Este artigo descreve um método baseado em citometria de fluxo aerodinâmico, clinicamente aplicável para quantificar a atividade citotóxica das células NK. Neste ensaio, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou purificadas preparações de células NK são co incubadas em diferentes proporções com uma linhagem de células de tumor alvo conhecida por ser sensível a citotoxicidade mediada por células do NK (NKCC). As células alvo são previamente rotuladas com uma tintura fluorescente para permitir sua discriminação das células efetoras (células NK). Após o período de incubação, as células alvo morto são identificadas por uma mancha de ácido nucleico, que permeia especificamente as células mortas. Este método é passível de diagnóstico e aplicações de pesquisa tanto, graças às capacidades multi-parâmetros de citometria de fluxo, tem a vantagem adicional de potencialmente permitindo uma análise mais profunda do fenótipo de células NK e função.

Introdução

Assassino naturais (NK) células são um subconjunto de sofisticada de linfócitos inatos humanos criticamente envolvidos na eliminação de células infectadas Viralmente, células transformadas e outras ameaças patogênicos 1,2. Grânulos líticas de célula NK citotóxicas proteínas, tais como a perforina e granzymes de casa. Após a ativação, células NK formam uma complexa interação com seus alvos conhecido como sinapse imunológica, através do qual estas moléculas citolíticas localmente são liberadas, resultando na lise de célula alvo direto e apoptose, juntamente com a liberação de citocinas e chemokine e, finalmente, na indução de um inflamatório estado 1,3,4.

Ativação de células NK envolve uma complexa cadeia de ativando e inibitórias interações entre NK celulares receptores e ligantes expressados na superfície das células alvo, formando um sistema rigidamente regulamentado. Um dos mais estudados mecanismos de ativação de células NK é o self"desaparecido". Na verdade, falta de detecção de classe que eu major complexo de histocompatibilidade (MHC), ou moléculas de antigénios (HLA) de leucócitos humanos, na infectado ou transformado a citotoxidade de células NK de células gatilhos. Tumor e células infectadas por vírus geralmente downregulate estes antígenos para escapar a imunidade mediada por células T, tornando-se assim o principal NK células alvos 1,3,4.

Avaliação da função de célula NK principalmente é categorizada em degranulação ou citotoxicidade ensaios. No entanto, ensaios de degranulação, como detecção de fluxo cytometric do marcador degranulação associada CD107a, são apenas indicativos de ativação de células NK e não de sua função final, o abate direto de alvo células 5,6,7,8. Portanto, essa limitação tem atraído investigadores ensaios de citotoxicidade como uma alternativa mais revelador e mais direta.

O velho "padrão ouro" para avaliar a atividade citotóxica mediada por células de células T e NK tanto é o ensaio de liberação de cromo (CRA). CRA envolve radioactivamente rotulagem das células alvo com 51Cr e co, incubando-os com células efetoras. Este ensaio é rica em princípio que esse lysis da pilha resulta na liberação de proteínas 51Cr para o sobrenadante, que pode ser medido pela contagem de gama. Neste ensaio, ao mesmo tempo eficaz, é problemático para uma variedade de razões: elevados custos de material, manipulação e eliminação de radioativo 51Cr, liberação espontânea de 51Cr e difícil padronização - tornando-se completamente impraticável 9,10.

Um número de ensaios não-radioativo, envolvendo rotulagem fluorescente, liberação de enzima e bioluminescência mesmo, desde que foram desenvolvido como alternativas ao CRA 11,12,13,14. Descrevemos aqui um método baseado em citometria de fluxo para medição de NK célula atividade citotóxica sobre células-alvo K562 que é simples, sensível e reprodutível. Células k562 são eu e expressão aumentada de ligantes para receptores NK activatory, que os torna particularmente suscetível a de citotoxicidade mediada por células NK 15, uma célula humana erythroleukemic linha com reduzida expressão da classe HLA. Neste ensaio, células K562 pre-são rotuladas com carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e co cultivadas em várias relações com qualquer células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou purificado de células NK 1. CFSE é um corante fluorescente estável, proteína ligadora que permite a discriminação das células alvo do efetor NK células 16,17. Após a incubação co, uma mancha de ácido nucleico, especificamente que permeiam a membrana das células mortas, é usada para identificar as células alvo morto (veja a tabela de materiais). As amostras são então adquiridas em um citômetro de fluxo para determinar a percentagem de mortos (i.e., mancha +) CFSE + nas células-alvo.

Este ensaio pode ser usado como uma rotina diagnóstica triagem para defeitos monogénicas afetando o compartimento de célula NK, que são aproximadamente 30 defeitos conhecidos causando funcional ou clássica deficiência de células NK, e para hemophagocytosis hemofagocítica primário ou secundário. Também é útil investigar a atividade das células NK em pacientes com infecções virais herpes recorrente, grave, para avaliar a reconstituição imunológica após transplante de células hematopoiéticas ou post imuno terapia 18,19,20e para uma série de aplicações de pesquisa básica.

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Protocolo

As amostras foram coletadas de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Programa de Proteção à Pesquisa Humana da UCLA e aprovadas pelo IRB.

1. Preparação de reagentes

NOTA: Salvo indicação em contrário, todos os reagentes devem se equilibrar à temperatura ambiente antes do uso. Todos os reagentes devem permanecer estéreis.

  1. Prepare uma solução de trabalho 2x de Tween-20 (ou seja, 0,2%) adicionando 10 μL de solução de Tween-20 a 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio com uma pipeta p20.
    1. Dada a alta viscosidade do Tween-20, siga as seguintes etapas para garantir a precisão: colete lentamente para evitar a formação de bolhas, não mergulhe toda a ponta para evitar o transporte e pipete para cima e para baixo várias vezes em PBS para lavar todo o Tween-20 da ponta.
  2. Adicione 2 μL de solução-mãe de IL-2 (2,1E6 UI / mL) a 198 μL de meio completo (ou seja, diluição 1:100), que é RPMI com 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal bovino (FBS) e, em seguida, prossiga para uma diluição adicional de 1:100 adicionando 2 μL de solução intermediária de IL-2 a 198 μL de meio completo para preparar uma solução de trabalho 7x (210 UI / mL).
  3. Adicione 2 μL de solução estoque CFSE (5 mM) a 500 μL de mídia simples (RPMI). Vortex, gire para baixo para remover as gotas da tampa e, em seguida, prossiga com uma diluição adicional de 1:20 adicionando 50 μL da solução intermediária CFSE a 950 μL de RPMI simples para obter uma solução de trabalho 2x de 1 μM. Vortex bem e mantenha protegido da luz.

2. Isolamento de PBMCs como células efetoras

NOTA: Este ensaio foi validado para uso eficaz com PBMCs totais de controles saudáveis. No entanto, recomenda-se que o conteúdo de células NK seja verificado com cada preparação de PBMC (Figura 1). Além disso, o volume de sangue total para coleta é baseado na frequência de células NK no sangue total periférico e isso pode variar de pessoa para pessoa, principalmente entre doadores saudáveis e pacientes.

  1. Colete um mínimo de 4 mL de sangue total humano em tubos de coleta de sangue heparinizado de sódio ou lítio. Armazene amostras de sangue em temperatura ambiente no momento da coleta e uso dentro de 30 h após a coleta.
  2. Dilua o sangue total com 4 mL de PBS (ou seja, volume igual de PBS ao sangue total).
  3. Adicione 4 mL de solução de gradiente de densidade (consulte a tabela de materiais) a um tubo cônico de 15 mL. Cubra cuidadosamente o sangue total diluído sobre a solução de gradiente de densidade, inclinando o tubo.
  4. Centrifugue a 650 x g por 24 min com o freio desligado.
  5. Colete cuidadosamente a camada de células mononucleares, que é a fina camada branca abaixo da camada superior de plasma e plaquetas, em um novo tubo cônico de 15 mL. Traga o volume para 15 mL com PBS.
  6. Centrifugue a 450 x g por 10 min com o freio acionado. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 0,5 mL de meio completo.
  7. Use um contador de células automatizado ou hemocitômetro para contar as células e ajuste a concentração de PBMC para 5x106 células/mL com meio completo.
  8. Verificar o conteúdo das células NK por citometria de fluxo (ver passo 4).
  9. Inicie o ensaio dentro de 30 min. Mantenha as células em temperatura ambiente por até 10 min ou coloque em uma incubadora umidificada de CO5% 2 a 37 ° C até que esteja pronto para uso.

3. Isolamento de células NK como células efetoras

NOTA: Esta parte do protocolo é uma alternativa ao uso de PBMCs totais como células efetoras. O rendimento típico de 4 mL de sangue total de um indivíduo saudável é de aproximadamente 4x105 células NK, ou aproximadamente 5-15% dos PBMCs, embora essa frequência varie entre os doadores 21. Recomenda-se que uma verificação de pureza seja realizada após o isolamento.

  1. Colete um mínimo de 4 mL de sangue total humano em tubos de coleta de sangue heparinizado de sódio ou lítio. Tome 50 μL de sangue total para corar como uma amostra de pré-enriquecimento.
  2. Adicione o coquetel de enriquecimento a amostras de sangue a 50 μL / mL (consulte a tabela de materiais). Misture bem e incube por 10 min em temperatura ambiente.
  3. Adicione um volume igual de PBS + 2% de FBS para diluir a amostra e misture bem.
  4. Adicione 4 mL de solução de gradiente de densidade a um tubo cônico de 15 mL. Sobreponha cuidadosamente a amostra diluída sobre o meio gradiente de densidade.
  5. Centrifugue a 1.200 x g por 10 min com o freio desligado.
  6. Colete cuidadosamente a camada de células enriquecidas em um novo tubo cônico de 15 mL. Lave as células aumentando o volume para 50 mL com PBS + 2% FBS.
  7. Centrifugar a 300 x g durante 10 min. Rejeitar o sobrenadante e repetir a lavagem.
  8. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 0,5 mL de meio completo.
  9. Usando um contador de células automatizado ou hemocitômetro, conte as células e ajuste a concentração para 5x105 células/mL. Pegue 50 μL de suspensão celular purificada para corar como uma amostra pós-enriquecimento.
  10. Mantenha as células em temperatura ambiente por até 10 min ou coloque em uma incubadora umidificada de CO5% 2 a 37 ° C até que estejam prontas para uso.

4. Imunofenotipagem para avaliação do conteúdo de células NK

  1. Usando PBMCs isolados totais de 50 μL, sangue total pré-enriquecimento ou células NK purificadas, corar com anticorpo conjugado com fluorocromo anti-CD56 como marcador de célula NK. Marcadores para outros tipos e linhagens celulares (ou seja, células T CD3+, células B CD19+) também podem ser incluídos para avaliar a origem da contaminação, se houver.
  2. Incubar durante 20 min a 4 °C e lavar adicionando 2 ml de PBS + 2% de FBS.
  3. Centrifugue a 450 x g por 5 min.
  4. Para PBMCs ou células NK, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 μL de PBS + 2% de FBS.
  5. Para amostras de sangue total, realize a lise de glóbulos vermelhos (RBC):
    1. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (31,75 g de cloreto de amônio + 4,16 g de base Tris + 6,65 g de EDTA, dissolvido em 5000 mL de água deionizada).
    2. Incube por 10 min em temperatura ambiente.
    3. Repita a lavagem duas vezes, aspire o sobrenadante e ressuspenda a amostra lisada em 100 μL de PBS + 2% FBS.
      NOTA: A lise de hemácias também pode ser realizada antes da coloração.
    4. Prossiga com a análise por citometria de fluxo.

5. Descongelamento, cultura e colheita de células-alvo K562

  1. Alíquota de 10 ml de meio completo para um tubo cónico de 15 ml e deixar aquecer em banho-maria a 37 °C. Para o descongelamento e cultura de células K562, use apenas meios pré-aquecidos a 37 ° C para todas as etapas.
  2. Colocar um frasco para injetáveis de células K562 congeladas no banho-maria a 37 °C até que a maior parte esteja descongelada.
  3. Transferir as células K562 semi-descongeladas para o meio completo, pré-aquecido a 37 °C, no tubo cónico de 15 ml. Lave o interior do frasco criogênico com um pouco de meio pré-aquecido e adicione a lavagem ao tubo de 15 mL.
  4. Centrifugue a 140 x g por 7 min com o freio acionado. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio completo.
  5. Alíquota uma quantidade adequada de suspensão celular para contar as células usando um contador de células automatizado ou hemocitômetro.
  6. Ajuste a concentração para 1x10 5-2x105 células/mL e cultive em uma incubadora umidificada de CO5% 2 a 37 °C por pelo menos 2 dias antes do uso. Mantenha a cultura nesta faixa de densidade por não mais de 3 meses e, em seguida, descongele uma nova alíquota. Nunca exceda uma concentração celular de 1x106 células/mL em cultura.
  7. Para uso no ensaio, misture bem a cultura de células K562 com uma pipeta sorológica de 10 mL e remova uma alíquota para contar e avaliar a viabilidade celular usando um contador celular automatizado ou hemocitômetro e coloração com Trypan Blue.
    1. Se a viabilidade for inferior a 85%, prossiga com as seguintes etapas de remoção de células mortas.
      1. Adicione 15 mL de solução de gradiente de densidade a tubos cônicos de 50 mL, conforme necessário. Recolha todas as células da cultura e sobreponha lentamente a suspensão celular sobre a solução de gradiente de densidade, inclinando o tubo.
      2. Centrifugue a 650 x g por 24 min com o freio desligado. Colete cuidadosamente a camada de células vivas em um novo tubo cônico de 15 mL. Traga o volume para 50 mL com PBS.
      3. Centrifugue a 450 x g por 10 min com o freio acionado. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio completo. Contar as células e verificar a viabilidade celular (como em 5.7).
      4. Cultura em incubadora umidificada de CO5 2 a 37 °C por pelo menos 2 dias antes do uso.
  8. Colete 5x105 células-alvo K562 e centrifugue a 140 x g por 7 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 500 μL em meio com 1% de FBS.

6. Rotulagem de células-alvo K562

NOTA: Certifique-se de que as células K562 estejam bem ressuspensas antes de adicionar a solução de trabalho CFSE.

  1. Pipete 500 μL da solução de trabalho CFSE para os 500 μL de células K562 para uma concentração final de 0,5 μM. Usando a mesma ponta de 1000-1250 μL, misture imediatamente pipetando suavemente para cima e para baixo 3-5 vezes.
  2. Incubar em banho-maria a 37 °C ou em incubadora umidificada de CO2 a 5% a 37 °C por 10 min no escuro.
    NOTA: Como o tempo de atraso de equilíbrio de temperatura é maior na incubadora em comparação com o banho-maria, o tempo de incubação pode precisar ser ajustado especialmente para volumes > 1 mL.
  3. Extinguir a reação de rotulagem com 10 mL de meio completo por 10 min no escuro em temperatura ambiente.
  4. Centrifugue as células K562 marcadas a 140 x g por 7 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda em 1 mL de meio completo.
  5. Conte as células usando um contador de células automatizado ou hemocitômetro e leve a concentração para 1x105 células/mL em meio completo.
  6. Coloque as células em uma incubadora umidificada de CO5 a 2% a 37 ° C até que estejam prontas para uso. As células podem ser mantidas em temperatura ambiente por até 10 min ou em uma incubadora de CO2 umidificada a 37 °C até que estejam prontas para uso. Não refrigere.

7. Revestimento

NOTA: Se as células NK forem limitantes, a concentração de células K562 e NK pode ser reduzida pela metade, de modo que metade das células seja plaqueada no ensaio. O ensaio produz resultados comparáveis com metade da quantidade de células (desde que as proporções sejam mantidas consistentes).

  1. Se estiver usando PBMCs totais, rotule uma placa tratada com cultura de tecidos de 96 poços, fundo em U, para as seguintes condições por poço: (1) Efetor (E): Alvo (T) = 50: 1 + IL-2 - controle positivo para citotoxicidade de células NK; (2) E: T = 50: 1; (3) E: T = 25: 1; (4) E: T = 12,5: 1; (5) E: T = 6,25: 1; (6) T - apenas células-alvo - controle negativo para morte por K562; (7) E - apenas células efetoras; (8) T + Tween - Controle positivo para morte por K562
  2. Se estiver usando células NK purificadas, rotule uma placa tratada com cultura de tecidos de 96 poços, com fundo em U, para as seguintes condições por poço: (1) Efetor (E): Alvo (T) = 5: 1 + IL-2 - controle positivo para citotoxicidade de células NK; (2) E: T = 5: 1; (3) E: T = 2,5: 1; (4) E: T = 1,25: 1; (5) E: T = 0,625: 1; (6) T - apenas células-alvo - controle negativo para morte por K562; (7) E - apenas células efetoras; (8) T + Tween - controle positivo para morte por K562
  3. Adicione 100 μL de meio completo às condições 3, 4, 5, 6, 7. Para esta e todas as etapas subsequentes, (recomendado) use uma pipeta multicanal.
  4. Adicione 100 μL de células efetoras (PBMCs a 5x106 células/mL ou células NK purificadas a 5x105 células/mL) às condições 1, 2, 3. Adicionar células efetoras para as condições 4-7 por diluição serial. Não mude as pontas de condição para condição.
    1. Misture a condição 3, pegue 100 μL e transfira para a condição 4.
    2. Misture a condição 4, pegue 100 μL e transfira para a condição 5.
    3. Misture a condição 5, pegue 100 μL e transfira para a condição 7; A condição 6 não possui células efetoras.
  5. Adicione 100 μL de solução de trabalho preparada 2x 0,2% Tween à condição 8 (concentração final: 0,1% Tween-20); a condição 8 não possui células efetoras.
  6. Adicione 30 μL de solução de trabalho de IL-2 à condição 1. A IL-2 deve ser adicionada à suspensão de células efetoras antes da adição da suspensão de células-alvo (concentração final: 27 UI / mL).
  7. Adicione 100 μL de células-alvo (células K562 marcadas em 1x105 células/mL) às condições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. A condição 7 não tem células-alvo.
  8. Misture todos os alvéolos com uma pipeta multicanal e centrifugue a placa a 120 x g durante 2 min.
  9. Incubar numa incubadora de CO2 humidificada a 37 °C durante 4 h. No final da incubação, coloque a placa no gelo e proceda à coloração de viabilidade em 30 min.

8. Coloração para viabilidade e aquisição

  1. Prepare a coloração de células mortas (consulte a tabela de materiais) adicionando 3 μL da solução estoque de 5 μM a 600 μL de PBS.
  2. Adicione 50 μL de coloração diluída de células mortas a cada poço para um volume final de 250 μL e uma concentração final de 0,005 μM. Misture bem com uma pipeta multicanal.
  3. Prossiga com a análise por citometria de fluxo. Usando um citômetro de fluxo, colete pelo menos 1.000 eventos na porta da célula-alvo (Figura 2) para obter resultados estatisticamente significativos.

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Resultados

Antes de configurar o ensaio, é altamente recomendável que o conteúdo da célula NK ser avaliadas na população efetora de escolha. A Figura 1 mostra uma típica coloração de CD56 antes (luz azul) e depois o enriquecimento de célula NK (vermelho). Células NK compreendem até 15% de PBMC e devem ser pelo menos 80% puro depois de enriquecimento.

Análise de fluxo cytometric neste ensaio envolve a deteção d...

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Discussão

O método descrito aqui fornece uma alternativa simples e econômica para o ensaio de libertação tradicionais 51Cr para avaliar a atividade citotóxica das células NK. Esse método é menos demorado do que os métodos padrão anteriores, como CRA, sensível e reprodutível e pode ser usado para ambos clínicos e aplicações de pesquisa.

Enquanto o ensaio funciona com totais PBMCs e enriquecido de células NK, a opção de usar PBMCs sem a necessidade de purificar a populações de células é um gran...

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Divulgações

Os autores não declaram nenhum conflito de interesse financeiro.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Jill Narciso, centro de Imunogenética de UCLA, pela sua assistência com a preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução salina tamponada com fosfato (1x, sem Ca2+ e Mg2+)Corning (Cellgro)21-040-CM
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Tween-20SigmaBP337-100
RPMI 1640 MediaCorning (Cellgro)10-040-CV
Soro Fetal Bovino Inativado por CalorOmega ScientificFB-02
Penicilina estreptomicinaLife Technologies15140-163Solução de estoque a 10.000 U / mL
IL-2R & D Systems202-IL-050Liofilizado a partir de um 0.2 μ m solução filtrada em acetonitrila e TFA com BSA como proteína transportadora. Reconstituir com 500 ul a 100 μ g/mL em ácido acético estéril 100 mM contendo pelo menos 0,1% de albumina de soro bovino (2,1x10E6 IU/ml)
Células K562ATCCCCL-243Linha de células cancerígenas 
Frascos de cultura de células T-75Corning431464
CFSELife Technologies (CellTrace)C34554Reconstitua o frasco I com 18 ul de DMSO para preparar uma solução estoque de 5mM. Não congele/descongele.
Sytox RedLife TechnologiesS34859é fornecida a 5 μ M em 1 mL de DMSO. A solução de DMSO pode ser submetida a vários ciclos de congelamento e descongelamento sem degradação do reagente.
Tubos de coleta de sangue de heparina de sódio/lítioBD02-687-95
Placa de 96 poços com fundo em UPipetassorológicas
Tubos de fundo redondo de poliestireno BDFalcon
Tubo cônico de polipropileno de 50 mLBD Falcon352070
tubo cônico de polipropilenoBD Falcon352097
Reservatório de reagentesUSA Scientific2321-2230
Coquetel de enriquecimento de células NK humanasStemCell Technologies (RosetteSep)15065
Kit de proliferação celular A solução de estoque Corning CLS3897 (5mL)BD Falcon 14959-5 15 mL

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was updated from:

Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death.

to:

Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis.

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C lulas Natural KillerMononucleares do Sangue Perif ricoSepara o por Gradiente de DensidadeMarca o de C lulas AlvoRaz o Efetor AlvoCorante de C lulas MortasC lulas Alvo K562
Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana
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