Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.
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Artigo de método
Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Dentro do sistema imunológico inato, linfócitos efetores conhecidos como natural killer (NK) células desempenham um papel essencial na defesa do hospedeiro contra células aberrantes, eliminando especificamente tumoral e Viralmente infectado as células. Aproximadamente 30 defeitos conhecidos monogénicas, juntamente com uma série de outras condições patológicas, causam ou funcional ou clássica NK célula deficiência, manifestando-se na reduzida ou ausente atividade citotóxica. Historicamente, a citotoxicidade foi investigada com métodos radioativos, que são complicados, caros e potencialmente perigosos. Este artigo descreve um método baseado em citometria de fluxo aerodinâmico, clinicamente aplicável para quantificar a atividade citotóxica das células NK. Neste ensaio, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou purificadas preparações de células NK são co incubadas em diferentes proporções com uma linhagem de células de tumor alvo conhecida por ser sensível a citotoxicidade mediada por células do NK (NKCC). As células alvo são previamente rotuladas com uma tintura fluorescente para permitir sua discriminação das células efetoras (células NK). Após o período de incubação, as células alvo morto são identificadas por uma mancha de ácido nucleico, que permeia especificamente as células mortas. Este método é passível de diagnóstico e aplicações de pesquisa tanto, graças às capacidades multi-parâmetros de citometria de fluxo, tem a vantagem adicional de potencialmente permitindo uma análise mais profunda do fenótipo de células NK e função.
Introdução
Assassino naturais (NK) células são um subconjunto de sofisticada de linfócitos inatos humanos criticamente envolvidos na eliminação de células infectadas Viralmente, células transformadas e outras ameaças patogênicos 1,2. Grânulos líticas de célula NK citotóxicas proteínas, tais como a perforina e granzymes de casa. Após a ativação, células NK formam uma complexa interação com seus alvos conhecido como sinapse imunológica, através do qual estas moléculas citolíticas localmente são liberadas, resultando na lise de célula alvo direto e apoptose, juntamente com a liberação de citocinas e chemokine e, finalmente,....
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Protocolo
As amostras foram coletadas de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Programa de Proteção à Pesquisa Humana da UCLA e aprovadas pelo IRB.
1. Preparação de reagentes
NOTA: Salvo indicação em contrário, todos os reagentes devem se equilibrar à temperatura ambiente antes do uso. Todos os reagentes devem permanecer estéreis.
- Prepare uma solução de trabalho 2x de Tween-20 (ou seja, 0,2%) adicionando 10 μL de solução de Tween-20 a 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio com uma pipeta p20.
- Dada a alta viscosidade do Tween-20, siga as seguintes etapas....
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Resultados
Antes de configurar o ensaio, é altamente recomendável que o conteúdo da célula NK ser avaliadas na população efetora de escolha. A Figura 1 mostra uma típica coloração de CD56 antes (luz azul) e depois o enriquecimento de célula NK (vermelho). Células NK compreendem até 15% de PBMC e devem ser pelo menos 80% puro depois de enriquecimento.
Análise de fluxo cytometric neste ensaio envolve a deteção d.......
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Discussão
O método descrito aqui fornece uma alternativa simples e econômica para o ensaio de libertação tradicionais 51Cr para avaliar a atividade citotóxica das células NK. Esse método é menos demorado do que os métodos padrão anteriores, como CRA, sensível e reprodutível e pode ser usado para ambos clínicos e aplicações de pesquisa.
Enquanto o ensaio funciona com totais PBMCs e enriquecido de células NK, a opção de usar PBMCs sem a necessidade de purificar a populações de células é um gran.......
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Divulgações
Os autores não declaram nenhum conflito de interesse financeiro.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Jill Narciso, centro de Imunogenética de UCLA, pela sua assistência com a preparação do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução salina tamponada com fosfato (1x, sem Ca2+ e Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Soro Fetal Bovino Inativado por Calor | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicilina estreptomicina | Life Technologies | 15140-163 | Solução de estoque a 10.000 U / mL |
| IL-2 | R & D Systems | 202-IL-050 | Liofilizado a partir de um 0.2 μ m solução filtrada em acetonitrila e TFA com BSA como proteína transportadora. Reconstituir com 500 ul a 100 μ g/mL em ácido acético estéril 100 mM contendo pelo menos 0,1% de albumina de soro bovino (2,1x10E6 IU/ml) |
| Células K562 | ATCC | CCL-243 | Linha de células cancerígenas |
| Frascos de cultura de células T-75 | Corning | 431464 | |
| CFSE | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitua o frasco I com 18 ul de DMSO para preparar uma solução estoque de 5mM. Não congele/descongele. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | é fornecida a 5 μ M em 1 mL de DMSO. A solução de DMSO pode ser submetida a vários ciclos de congelamento e descongelamento sem degradação do reagente. |
| Tubos de coleta de sangue de heparina de sódio/lítio | BD | 02-687-95 | |
| Placa de 96 poços com fundo em U | Pipetas | sorológicas | |
| Tubos de fundo redondo de poliestireno BD | Falcon | ||
| Tubo cônico de polipropileno de 50 mL | BD Falcon | 352070 | |
| tubo cônico de polipropileno | BD Falcon | 352097 | |
| Reservatório de reagentes | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Coquetel de enriquecimento de células NK humanas | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Referências
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
