Este vídeo mostra um procedimento para a geração de culturas de neurônios a partir de embrião tarde e córtex do rato pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados para imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, cálcio e sódio de imagem e fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética pós-natal letal.
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Artigo de método
Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este vídeo irá guiá-lo através do processo de geração de culturas cortical neuronal de embriões tarde e cérebro de camundongos pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados para uma variedade de aplicações, incluindo imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, imageamento de cálcio e sódio, proteína e / ou RNA isolamento. Estas culturas também fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética tarde embrionárias ou pós-natal letal. O procedimento é relativamente simples, requer alguma experiência na técnica de cultura de tecidos e não deve demorar mais do que 2-3 horas, se você estiver devidamente preparado. Uma separação cuidadosa da casca cortical do trato fibras tálamo-cortical vai reduzir o número de gravidezes indesejadas células não-neuronais. Para aumentar a produção de células neuronais triturar os pedaços do tecido cortical delicadamente após a etapa de incubação enzimática. Isto é imperativo, uma vez que evita lesões desnecessárias para as células e prematura morte celular neuronal. Uma vez que estas culturas são mantidos na ausência de células alimentadoras glia, eles também oferecem uma vantagem adicional de culturas em crescimento enriquecido em neurônios.
Protocolo
Preparações antes do dia da cultura:
- Preparar a solução de dissecação estéril (DS).
- Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal com suplementos B27).
- Autoclave DDH 2 O e esterilizar coversilps vidro, se necessário.
- Brasão pratos de cultura de tecidos ou lamínulas de vidro com poli-D-lisina.
Poli-D-lisina Revestimento:
Prepare um dia antes de cultivo em condições estéreis.
- Alíquota de descongelar PDL 10X e colocar no gelo.
- Adicionar 9 ml de água ultra-filtrado estéril para 1 ml de PDL e misture bem (1X).
- Revestimento com superfícies 1....
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2’-desoxiuridina | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Cloreto de Sódio | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Vibraslicer | Campden Instruments | ||
| Cloreto de Potássio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Fosfato de Sódio Dibásico | Sigma-Aldrich | S0876 | |
| Fosfato de Potássio Monobásico | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Glicose D (+) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Poli-D-Lisina | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Suplemento B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Meio Neurobasal (NBM) | Invitrogen | 21103-049 | |
| Ácido 2-amino-5-fosfonopentanoico | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Albumina Bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Inibidor de Tripsina | Sigma-Aldrich | T9253 | |
| Hidróxido de Sódio, solução 1N | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| L-Cisteína | Sigma-Aldrich | C7755 | |
| Ágar Bacto | Difco Laboratories | 0140-01 | |
| Papaina | Worthington Biochemical | LS 03126 | |
| Filtro de seringa estéril de 0,2 μm | Fisher Scientific | DDA02025S0 | |
| Cobrimentos de vidro, No1, 12 mm | Bellco Glass | 1943-00012 | |
| Meio Mínimo Essencial (MEM) | Invitrogen | 11090-081 | com sais de Earle’s, sem L-glutamina, necessário para o cultivo de culturas não neuronais |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen | 15070-063 | para cultivo não neuronal |
| Soro bovino fetal | Invitrogen | 16140-071 | necessário para culturas não neuronais |
| Frascos de cultura tecidual Nunclon "Triple Flask" | Fisher Scientific | 12-565-25 | Usar para culturas não neuronais. Esses frascos são muito convenientes para produzir "meio Neurobasal/B27 condicionado", mas qualquer outro frasco ou placa de cultura tecidual pode ser usado como alternativa. |
| Placas de imagem com fundo de vidro "Imaging dishes" | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | Placas de cultura de 35 mm com fundo de vidro, ideais para imagem de Cálcio ou Sódio quando se utiliza um sistema de imagem invertido. Porém, são caras! |
Reimpressões e permissões
