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Artigo de método

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

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DOI:

10.3791/56201

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26 de outubro de 2017

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1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético após lesões enquanto induzindo na vivo reprogramação. Este método é adequado para avaliar o papel da senescência celular durante a regeneração do tecido e reprogramação na vivo.

Resumo

Senescência celular é uma resposta ao estresse que é caracterizada por uma detenção estável de crescimento celular, o que é importante para muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como câncer e envelhecimento. Recentemente, a senescência também tem sido implicada na regeneração e reparo tecidual. Portanto, tornou-se cada vez mais crítico para identificar células senescentes em vivo. Senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) ensaio é o ensaio mais utilizado para detectar células senescentes tanto na cultura e na vivo. Este ensaio é baseado no aumento conteúdo lisossomal nas células senescentes, que permite a detecção histochemical da atividade lisossomal β-galactosidase em pH suboptimum (6 ou 5.5). Em comparação com outros ensaios, tais como citometria de fluxo, isto permite a identificação de células senescentes em seu ambiente residente, que oferece informações valiosas, tais como a localização, relacionadas com a arquitectura do tecido, a morfologia e o possibilidade de acoplamento com outros marcadores através de imuno-histoquímica (IHC). A limitação principal do ensaio SA-β-Gal é a exigência de amostras frescas ou congeladas.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para entender como celular senescência promove celular plasticidade e tecido regeneração em vivo. Nós usamos SA-β-Gal para detectar células senescentes no músculo esquelético após a lesão, o que é um sistema bem estabelecido para estudar a regeneração de tecidos. Além disso, usamos IHC para detectar Nanog, um marcador de células-tronco pluripotentes, em um modelo do rato transgénico. Este protocolo permite-nos analisar e quantificar a senescência celular no contexto da plasticidade celular induzida e na vivo reprogramação.

Introdução

Senescência celular é uma forma de reação de estresse, caracterizada por uma detenção do ciclo celular estável. Na última década, pesquisa estabeleceu-se firmemente que a senescência é associada com vários processos biológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, fibrose e organismo envelhecimento1,2. Senescência celular foi identificada em fibroblastos humanos no final de sua vida replicative desencadeada por telômero encurtamento3. Além do estresse replicative, existem muitos outros estímulos que podem induzir a senescência, incluindo danos, estresse oxidativo, oncogênicos sinais e alterações genômicas/epigenomic, que eventualmente pode ativar as vias p53/p21 e/ou pRB para DNA estabelecer e reforçar o crescimento permanente de prisão1. Uma das características mais importantes de células senescentes é que eles permanecem metabolicamente ativos e robustamente expressam um fenótipo secretor associada a senescência (SASP): secreção de citocinas inflamatórias, fatores de crescimento e matriz extracelular muitos fatores4. Fatores SASP têm sido propostos para desempenhar um papel importante na mediação e amplificar o efeito de senescência, devido a seus potentes efeitos sobre atrair células imunes e alterando o tecido local e sistêmica www.UniEthos.org.br1. Curiosamente, senescência tem sido recentemente proposta para ser importante para tecido reparação e regeneração5,6. Além disso, dados de vários laboratórios, incluindo a nossa, tem sugerido que senescência induzida por danos do tecido pode aumentar a plasticidade celular, através do SASPs, para promover a regeneração7–9. Portanto, todos os dados emergentes destacam a importância de se estudar a senescência em vivo.

Na era pós (iPSC) células-tronco pluripotentes induzidas, plasticidade celular é a capacidade de uma célula para adquirir uma nova identidade e adotar um destino alternativo quando expostos a diferentes estímulos na cultura e na vivo10. É sabido que a reprogramação completa pode ser conseguida na vivo11,12, onde a expressão da fita contendo quatro fatores Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4e c-Myc de (OSKM) pode ser induzido na vivo para promover a formação de teratomas em múltiplos órgãos. Portanto, um modelo de mouse reprogramável (i4F) pode ser usado como um poderoso sistema para identificar os reguladores críticos e caminhos que são importantes para a plasticidade celular11.

Um sistema adequado e sensível na vivo é essencial para compreender a senescência celular como regula a plasticidade celular no contexto da regeneração de tecidos. Aqui, apresentamos um sistema robusto e um protocolo detalhado para avaliar a ligação entre senescência e plasticidade celular no contexto da regeneração de tecidos. O dano muscular combinação de toxina (CTX) induzida no grupo de músculo tibial Anterior (TA), um sistema bem estabelecido para estudar a regeneração do tecido e o modelo do rato de i4F, permite a detecção de senescência celular e vivo em reprogramação durante a regeneração do músculo.

Para avaliar a relação entre a plasticidade celular e senescência, i4F ratos são feridos com CTX para induzir a lesão muscular aguda e tratados com doxiciclina (0,2 mg/mL) durante 7 dias para induzir no vivo reprogramação. Enquanto um CTX induzido por lesão muscular aguda e protocolo de regeneração tem sido recentemente publicado13, por razões éticas, este procedimento será omitido no protocolo atual. Amostras de músculo TA serão recolhidas às 10 dias pós lesão13, quando o pico de células senescentes anteriormente foram observados14. Aqui, este protocolo detalhado descreve todos os passos necessários para avaliar o nível de senescência (via SA-β-Gal) e reprogramação (através de coloração de IHC de Nanog).

Senescência-associado de beta-galactosidase (SA-β-Gal) ensaio é o ensaio mais comumente usado para detectar células senescentes na cultura e na vivo15. Em comparação com outros ensaios, o ensaio de SA-β-Gal permite a identificação das células senescentes em seu ambiente nativo com arquitetura de tecido intacto, que é particularmente importante para o estudo em vivo . Além disso, é possível acoplar o ensaio SA-β-Gal com outros marcadores usando IHC. No entanto, o ensaio de SA-β-Gal requer amostras frescas ou congeladas, que continua a ser uma grande limitação. Quando os tecidos frescos ou congelados são rotineiramente disponíveis, tais como amostras congeladas de músculo TA, SA-β-Gal é, obviamente, o ensaio mais adequado para detectar células senescentes. NANOG é o marcador usado para detectar células reprogramadas por dois motivos: 1) é um marcador essencial para pluripotência; 2) mais importante, sua expressão não é movido a doxiciclina (dox), portanto ele detecta pluripotência induzida ao invés da expressão forçada da fita Yamanaka.

É importante notar, os protocolos de coloração apresentados neste estudo podem ser realizados separadamente para simplificar o processo de quantificação, mas também podem ser feitos em um procedimento co coloração Visualizar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes na mesma seção.

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Protocolo

os animais foram tratados conforme orientações da Comunidade Europeia e o Comité de ética dos protocolos Institut Pasteur (CETEA) aprovado.

1. preparações das soluções estoque

  1. preparar os materiais para fixação de amostra do músculo. Dissolver 0,5 g de adragante com 20 mL de água em RT tornar o meio de congelação-incorporação para fixação muscular.
  2. Preparar as soluções para a coloração de SA-β-Gal.
    1. Preparar as estoque soluções de K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M), dissolvendo os respectivos pós em água destilada.
    2. Prepare a solução-mãe de 0,2% C 20 H 6 Br 4 at 2 O 5 (eosina), diluir em água.
    3. Preparar a solução estoque de C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL), dissolvendo o pó de X-gal em C 3 H 7 não (dimetilformamida, DMF).
    4. Loja K 3 Fe(CN) 6 K 4 Fe(CN) 6 soluções e a 4 ° C e MgCl 2 no RT.
      Nota: X-galão pode ser armazenado em alíquota a-20 ° C, até a 6 meses. Solução de eosina pode ser mantida na RT e reutilizada após filtragem se necessário. K 3 Fe(CN) 6 e K 4 Fe(CN) 6 soluções são protectedfromthe luz. X-galão de solução não é estável em água e tem que ser protegido da luz.
  3. Preparação das soluções para Nanog coloração: a solução de permeabilização contém 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (citrato trissódico), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) em água destilada, que deve ser armazenado a 4 ° C. preparar a solução de bloqueio contendo 5% de soro fetal bovino (FBS) em tampão fosfato salino (PBS), que deve ser armazenado em RT.

2. Coloração de SA-β-Gal na secção de músculo TA congelado

  1. preparar o material de fixação para o músculo TA colocando uma pequena quantidade do tragacanth goma sobre uma fatia de cortiça.
  2. Ferido ratos de ambos os sexos (2 meses de idade, C57/B6) ficaram feridos 10 dias antes com a toxina (CDX) conforme descrito anteriormente, 13. Uso não-ferido (injeção de PBS) TA do mesmo mouse como controlo negativo. Se na vivo reprogramação é desejado, tratar cada rato com Dox (1 mg/mL) em água potável no mesmo dia (protegido da luz), logo após a lesão CTX.
    Nota: A solução de Dox precisa ser trocada a cada 3 dias para uma duração total de 7 dias.
    1. Isolar os dois músculos de TA (ferido e controle) dos ratos, conforme descrito anteriormente ( figura 1A) 13. Para garantir as seções transversais, inserir o tendão distal do músculo TA o adragante e deixar aproximadamente ¾ parte do músculo do lado de fora ( figura 1B) e congelar diretamente em nitrogênio líquido refrigerado isopentano para < 1 min.
      Nota: Certifique-se de que o músculo TA está em uma posição perpendicular e no centro da rolha. As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C, ou diretamente cryosectioned em 10 seções de µm.
  3. Processar os músculos TA conforme descrito na figura 1B.
    1. Distribuir o 1 st -10 th seções na ordem correta para dez slides diferentes na posição superior esquerda de cada slide. Colocar a seção 11 th adjacente à 1 seção st no primeiro slide; seção 12 th vai seguir a mesma ordem para ser colocado logo além da seção 2 nd no segundo slide. Repita este processo até 10 secções/slide são obtidos por dez slides (100 seções no total) para garantir a distância mínima de 1 mm entre a seção de primeira e a última seção.
  4. Corrigir as seções por 4 min em PBS contendo paraformaldeído 1% e 0,2% de glutaraldeído. Lave com PBS, 2 x 10 min. Em seguida, incubar as secções em PBS (pH = 5,5) por 30 min. executar todas as etapas no RT.
    Nota: A fixação tem que ser suave para manter a atividade enzimática. Execute esta etapa sob o capô. O pH do PBS é crítico e a solução de X-galão deve ser protegida da luz.
  5. Seções incubar a solução X-galão contendo: 4 mM K3Fe(CN) 6, K4Fe(CN) 6 de 4 mM, 2 mM MgCl2 e 400 µ g/mL X-Gal em PBS, pH = 5,5. Incubar no escuro a 37 ° C por um período mínimo de 24 h. lavagem a com PBS, 3 x 10 min, em RT.
    Nota: A incubação requer um mínimo de 24 horas e pode durar 48 horas para maximizar o sinal SA-β-Gal. A solução precisa ser alterado após 24 horas de incubação. As lâminas devem ser protegidas da luz. Se apenas SA-β-Gal coloração é desejado, continue com a etapa 2.5. Se co manchando com Nanog é desejada, por favor pular para o passo 3.1.
    6. Paraformaldeído
  6. fix slides em 1% em PBS durante 30 min. Lave os slides com PBS, 3 x 10 min. corante de contraste com 0,2% eosina. Imergir as lâminas na solução de eosina por 1 min e enxague com água destilada, brevemente. Finalmente, montar as lâminas com meio de montagem aquoso não fluoresce (ver Tabela de materiais).
    Nota: É essencial para realizar a pós-fixação. Execute esta etapa sob o capô. Todas as etapas são executadas no RT.

3. Imuno-histoquímica utilizando anticorpo Anti-Nanog

  1. corrigir os slides com PBS contendo paraformaldeído 4% por 10 min. lavagem com PBS, 2 x 10 min. Adicionar 200 µ l da solução de permeabilização diretamente sobre as guias e incubar durante 5 min.
    1. Lavagem desliza com PBS, 2 x 5 min e na última lavagem, uso 200 µ l PBS contendo 0,25% BSA directamente nos slides. Executar todos estes passos no RT.
      Cuidado: Executar a etapa de fixação sob o capô.
  2. Incubar slides com o anticorpo primário anti-Nanog (concentração final: 1.25 ug/mL) durante a noite a 4 ° C em PBS contendo 5% FBS. Lave os slides com PBS, 2 x 10 min e na última lavagem, uso 200 µ l PBS contendo BSA 0,25% por 5 min. realizar a lavagem todos os passos no RT.
    Nota: Incubar em uma caixa com papel-toalha para evitar a evaporação.
    3. Kit de
  3. incubar slides com 100 µ l de anticorpo secundário rAb-HRP de um pronto para usar (ver a Tabela de materiais) para lavagem de 45 min. desliza com PBS, 3 x 5 min, para remover o anticorpo secundário. Executar todas as etapas no RT com proteção da luz.
  4. Visualização
    1. primeiro, diluir o 3,3 '-diaminobenzidina (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) no buffer de substrato fornecido pelo pronto para utilizar o kit (20 µ l de DAB para 1 mL de solução-tampão de substrato). Adicione 100 µ l de solução DAB diretamente para cada slide e incubar durante um máximo de 10 min a RT.
      Nota: DAB solução diluída deve ser preparada na hora e pode ser armazenada por até uma semana, a 4 ° C. O tempo de incubação pode ser ajustado para minimizar o sinal de fundo, mas deve ser mantido a mesma para todos os slides.
    2. Remover a DAB solução enxaguando com água. Counterstain os slides com solução rápido vermelho (pronto para usar, consulte a Tabela de materiais) por 20 min. lavar os slides com água novamente brevemente.
    3. Eles desidratam com etanol a 95% para 5 mem seguida por 100% de etanol, 2 x 5 min. Finalmente, montar as lâminas com meio de montagem de endurecimento rápido (veja a Tabela de materiais).
    4. Observar os slides sob o microscópio de campo brilhante em 20 X para evitar fundo.
      Nota: Solução rápido vermelha pode ser mantida na RT e re-utilizada após filtragem.

4. Análise e quantificação

  1. quantificação SA-β-Gal
    1. digitalizar slides e escolher as melhores seções em cada slide com base nas imagens adquiridas. Use pelo menos 2 seções/TA para a quantificação. Julgar a seção ' s qualidade baseada na integridade do tecido, qualidade da coloração e counterstaining. Para a quantificação, escolha as duas seções de mais alta qualidade com a maior distância possível entre as amostras, que permite a melhor representação de quantificação de SA-β-Gal em todo o músculo TA inteiro.
    2. Quantificação de células positivas SA-β-Gal ( Figura 2).
      1. Determinar o rank do tamanho do pixel, manualmente, selecionando os menores e as maiores células positivas de SA-β-Gal.
        1. Abra a imagem digital do slide digitalizado usando software ImageJ.
        2. Na interface, clique ' Analyze ' > ' ferramentas ' > ' ROI Manager ' > ' Analyze ' > ' conjunto de medição ' > ' selecione a área '. Use a ferramenta seleção e cercam o menor e maior positivo SA-β-Gal da pilha e adicioná-lo ao gerente do ROI clicando no ' Add '. Medir os tamanhos usando o ' medida ' botão e salvar os valores para posterior utilização.
      2. Ajustar o parâmetro de limite para garantir que todas as células visíveis positivas são Selecionadodas.
        1. Converter a imagem para escala de cinza clicando ' imagem ' > ' tipo ' > ' 8-bit ' ( Figura 2A). Em seguida, vá para ' imagem ' > ' ajuste ' > ' limiar ', mova o cursor de segundo até todas as células de SA-β-Gal positivas são cobertas em vermelho ( Figura 2B) e, em seguida, clique em ' aplicar '.
        2. Analisar partículas clicando ' Analyze ' > ' analisar partículas ' > ' tamanho (pixel ^ 2) ' e aplicar o valor definido na etapa 4.1.2.1, digite ' circularidade ': ' 0.00-1.00 ', clique ' okey '; um resumo de todos os contagem de partículas é mostrado no Gerenciador de ROI ( Figura 2D).
      3. Transferir todas as partículas selecionadas para a imagem original. Ajuste a seleção manualmente para garantir a exata quantificação. Adicionar células positivas (seta verde, Figura 2E) e/ou remover células positivas falsas (seta vermelha, Figura 2E). Finalmente, medir a área delineando a seção ( Figura 2D) usando o ' ferramenta de seleção '. Clique ' Gerenciador de ROI ' > ' adicionar ' > ' medida '.
      4. Importante, normalizar o número de células positivas pela área da seção.
  2. Quantificação Nanog
    1. contar as Nanog positivas células sob o microscópio no campo brilhante manualmente na ampliação de 20 X.
      Nota: O counterstaining rápido vermelho permite boa avaliação da morfologia do músculo TA. No entanto, a coloração é muito leve e não possui um esquema claro de seção. O scanner muitas vezes não consegue identificar o limite das seções e não foco corretamente. É possível usar o marcador para as bordas das seções do círculo antes da digitalização ou usar um scanner mais sensível para detectar a seção. Para o protocolo atual, é mais eficiente para contar as células positivas Nanog manualmente.

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Resultados

Detecção de senescência celular induzida por lesão de músculo

Foi recentemente demonstrado que a lesão muscular induz transitória senescência celular14. Em 10 dias pós-lesão (DPI), a maioria do myofibers danificado está em fase de regeneração com núcleos centralmente localizados, uma marca registrada de regeneração myofibers, e a arquitetura do músculo é restabelecida. As células inflamatórias infiltrante sã...

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Discussão

Aqui, apresentamos um método para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético de ratos reprogramáveis. Esse método pode ser usado para avaliar e quantificar os dois senescência e induzir plasticidade celular na vivoe examinar o papel da senescência em reparação de tecidos e regeneração.

No protocolo atual, o ensaio da senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) é usado para detectar células senescentes no vivo no músculo esquelético. ...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Estamos em dívida com Clemire Cimper por seu excelente suporte técnico. Trabalho no laboratório de H.L. foi financiado pelo Instituto Pasteur, Centre National pour la Recherche científico e a Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire conquistou Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), a Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) e ARC Fondation (PJA 20161205028). C.C. e C.A. são financiados pelo doutorado e pós-doutorado bolsas do consórcio reviver.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
K3Fe(CN)6Sigma13746-66-2Para SA-β Solução de coloração Gal
K4Fe(CN)6Sigma14459-95-1Para SA-β Solução de coloração Gal
MgCl2Sigma7786-30-3para SA-β Solução de coloração
Gal X-GalSigmaB4252para SA-β Solução de coloração Gal
DoxiciclinaSigmaD3447Para induzir a reprogramação in vivo
CardiotoxinaLotaxan Valence, FrançaL8102Para lesão muscular
Glutaraldeído Sigma111-30-8Para solução de fixação
ParaformaldeídoCiência de microscopia eletrônica50-980-487Para solução
de fixaçãoNaCitrate:
Citrato de sódio bioxtra monobásico, anidrido		Sigma18996-35-5Para solução de permeabilização
TritonSigma 93443Para solução de permeabilização
Albumina de soro bovinoSigmaA3608Solução de lavagem
Anticorpo anti- NanogSinalização celular8822SAnticorpo monoclonal de coelho
EnVision+ Kits (HRP. Coelho. DAB+)DakoK4010Para Nanog revelation
Eosin 1%Leica380159EOFContracoloração
Fast red VectorLaboratoriesH-3403Contracoloração
Thermo Scientific Shandon Immu-MountFisher scientific9990402Solução de montagem
Meio de montagem de endurecimento rápido para microscopia : Eukitt®Sigma25608-33-7Solução de montagem
Microscópio de contraste de fase Campo claro CKX41: objetivas 10X-20X-40XMicroscópioOlympus CKX41para quantificação de Nanog
Mouse: i4F-AAbad et al., 2013N/AModelo de mouse reprogramável
Músculo esquelético, Tibialis Scanner de
ZeissAxio Scan Z1Digitalização de slides
lâmina anterior

Referências

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