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Artigo de método

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

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DOI:

10.3791/56212

⸱

22 de agosto de 2017

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um método para medir diretamente o RNA de transferência, níveis de carga de purificado Escherichia coli RNA, bem como uma maneira de comparar os níveis relativos do RNA de transferência, ou qualquer outro RNA curto, entre diferentes amostras baseadas na adição de pico-no células expressando um gene de referência.

Resumo

RNA de transferência (tRNA) é uma parte essencial da maquinaria translacional em qualquer organismo. os tRNAs bind e transferir os aminoácidos para o ribossoma traduzir. Os níveis relativos de tRNAs diferentes e a relação de aminoacylated tRNA para total tRNA, conhecido como o nível de carga, são fatores importantes na determinação da precisão e velocidade de tradução. Portanto, a abundância e níveis de carga dos tRNAs são variáveis importantes para medir quando estudar a síntese de proteínas, por exemplo, sob diferentes condições de estresse. Aqui, descrevemos um método para a colheita de tRNA e medição diretamente tanto a abundância relativa e o nível de carregamento absoluto de espécies específicas de tRNA em Escherichia coli. O tRNA é colhida de forma que o laço lábil entre o tRNA e o aminoácido é preservado. O RNA é então submetido a electroforese do gel e do Norte, mancha, que resulta em separação entre os tRNAs carregado e descarregado. Os níveis de tRNAs específico em amostras diferentes podem ser comparados devido à adição de pico-em células para normalização. Antes da purificação de RNA, adicionar 5% de células de Escherichia coli que overproduce o tRNA raroselC para cada amostra. A quantidade de espécies de interesse em uma amostra de tRNA então é normalizada para a quantidade de tRNAselC na mesma amostra. Adição de pico-em células antes da purificação de RNA tem a vantagem sobre a adição de purificado spike-em RNAs que é também responsável por eventuais diferenças de eficiência de lise celular entre as amostras.

Introdução

A seguir, apresentamos um método para quantificar os tRNAs específicas e níveis de medição de sua carga pela mancha do Norte. O método é baseado em uma técnica desenvolvida por Vieira et al . 1. colheita de células em ácido tricloroacético (TCA) e mantendo as amostras a 0 ° C em toda a purificação de RNA, a ligação éster entre o tRNA e o aminoácido é conservada2,3,4. TRNAs Aminoacylated distingue suas contrapartes nonacylated por eletroforese em gel e mancha do Norte, devido a uma diminuição da mobilidade do aminoacylated tRNA no gel, causado por aminoácido covalentemente ligados5. Além disso, apresentamos um protocolo para normalizar as quantidades de tRNA por adição de pico-em células superexpressão do usados raramente tRNAselC 4.

os tRNAs são algumas das moléculas mais abundantes na célula bacteriana e uma parte absolutamente vital da maquinaria de tradução. os tRNAs vincular aminoácidos e transferi-los para os traduzir ribossomas. A ligação dos aminoácidos para tRNAs (aminoacylation ou carregamento) é facilitada pela aminoacil sintetases de tRNA. A abundância relativa de diferentes tRNAs carregada é importante para garantir a fidelidade da síntese de proteínas, porque sub-representação do cognato acusado que tRNA para um codão de determinado RNA mensageiro (mRNA) aumenta a probabilidade de que um tRNA perto-cognato serão erroneamente entrega seu aminoácido à cadeia de polipeptídeo crescente no Ribossoma6. A importância do tRNA carregada é refletida na extensa resposta da célula de e. coli para uma severa queda nos níveis de carregamento de um tRNA; a resposta rigorosa. Durante a resposta rigorosa a síntese dos tRNAs, RNAs ribossomal e maioria dos mRNAs é abaixada em favor de transcrição de mRNAs específicos associados a sobrevivência de biossíntese e estresse de aminoácido, e a taxa de crescimento das células é reduzida drasticamente7 . Além disso, o recente trabalho de nos revelou que a Escherichia coli ativamente degrada a maioria dos seus tRNA em resposta ao estresse que limitam a tradução4,8, sugerindo que o ajuste dos níveis de tRNA pode ser importante para lidar com tais tensões. Assim, medições correctas de abundâncias de tRNA e níveis de carregamento será uma ferramenta importante para compreender plenamente a respostas bacterianas do stress.

Escherichia coli é comumente usado para expressar a proteína recombinante e devido às diferenças no uso do códon entre espécies, expressão de qualidade inferior é um problema muitas vezes enfrentado9. Isto pode ser contornado pela expressão de tRNAs adicionais necessários para traduzir o mRNA recombinante10. Medições do tRNA níveis em tais cepas de carregamento poderiam orientar os esforços de solução de problemas e ajudar a aperfeiçoar a expressão de proteínas.

Este método também permite a detecção de "mischarging"; um aminoacylated da molécula de tRNA com um aminoácido não-cognato. Aminoacylation por aminoácidos diferentes pode causar um tRNA migrar com velocidades ligeiramente diferentes através de géis de poliacrilamida1,11. Em alguns casos, o método também pode ser usado para distinguir padrões diferentes de modificação em idênticas tRNAs3.

Outro estabelecido procedimento bioquímico para a investigação do tRNA níveis de carregamento é periodato de oxidação. O método baseia-se na observação de que a aminoacylated-tRNA é protegido de periodato de oxidação e tRNA descarregado não é. Depois periodato tratamento de oxidação a recarga do tRNA é usada para estimar os níveis de carga do RNA colhido. No entanto, a recarga de vários tRNAs foi mostrado para ser afetado pelo tratamento proporcionando alguma imprecisão12. O método apresentado aqui medidas de carregamento diretamente do RNA purificado, excluindo assim qualquer preconceitos de reações químicas ou enzimáticas. Uma limitação deste método é que apenas uma espécie de tRNA é detectado em um momento, então, embora a mesma Northern blot pode ser descascado e reprobed de vários tRNAs, é demorado e um tanto trabalhoso coletar dados sobre muitos tRNAs.

Uma maneira confiável de normalizar as amostras para o outro é vital em estudos onde o objetivo é comparar os níveis relativos de uma molécula através de amostras diferentes. Aqui apresentamos um procedimento de normalização para o RNA, onde uma pequena alíquota de células de Escherichia coli superexpressão do tRNA raroselC é adicionada como um pico em que todas as amostras experimentais antes da purificação de RNA. Este método é útil não só ao examinar os tRNAs mas para quantificação relativa de qualquer espécie de RNA quando a instalação experimental é tal que nenhum RNA endógena pode ser confiável para ser apresenta na mesma concentração celular em todas as amostras. Por exemplo, o nível de um "housekeeping" como RNA ribossómico (ARNR) muitas vezes é usado como uma referência endógena para comparar as quantidades relativas de outro RNA entre diferentes amostras de13. Mas isso é de pouca utilidade se a concentração celular do RNA referência varia entre amostras, como pode ser o caso para o RNA ribossômico se amostragem ocorre durante um esforço resposta15,16,17 ou durante entrada em fase estacionária17. A adição de pico-em células com as amostras experimentais antes da purificação de RNA fornece uma forma sólida e precisa de normalização independente da instalação do amostragem. Outra forma de padronização é a adição de um ou mais pico-em RNAs para as amostras experimentais após a purificação de RNA. No entanto, este método não leva em conta diferenças eventuais na recuperação de RNA entre as amostras.

Usando células de Escherichia coli que overexpress a referência de RNA como spike-em células (ver Figura 1) em um experimento em e. coli tem a desvantagem de que resulta além de uma pequena quantidade de exógenos Escherichia coli total RNA para a amostras. Podemos corrigir para este acréscimo através da análise de uma amostra contendo somente spike-em células em paralelo com as amostras experimentais (ver o norte borre na pista Figura 2, , rotulada "selC"). O protocolo apresentado é desenvolvido para Escherichia coli K-12, mas é provável que seja aplicável para a maioria das espécies bacterianas.

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Protocolo

1. preparação de culturas bacterianas.

  1. Crescer todas as culturas em Erlenmeyers com uma relação de volume de cultura/frasco no máximo 1/6. Em uma instalação experimental típica, crescem as culturas a 37,0 ° C e agitando a 160 rpm em morpholinepropanesulfonic ácido (MOPS) mínimo médio 18 suplementado com a fonte de carbono preferencial, por exemplo glicose 0,2%, pelo menos 10 gerações consecutivas antes da colheita do RNA.
  2. o dia antes da colheita de RNA, diluir uma cultura Superdimensonada da estirpe desejada em meio mínimo ESPANADORES de tal forma que vai chegar a desejada OD 436 no momento desejado no dia seguinte. Calcular o volume de cultura Superdimensonada usar para inoculação pela fórmula:
    figure-protocol-1
    Nota: aqui, OD novo denota o desejado OD 436 após a incubação, V nova denota o volume da cultura diluído, OD velho denota o OD 436 da cultura Superdimensonada diluída de, G denota o número de gerações a cultura vai crescer, desde o tempo de diluição (t 1) que o tempo que é necessário no dia seguinte (t 2) e pode ser calculada como: tempo de diferença (em min) entre t 1 e t 2 dividido pelo tempo de geração (em min). Para garantir o crescimento de estado estacionário, no momento da amostragem, G deve ser ≥ 10; V velho denota o volume da cultura out-adulto que deve ser transferido para o meio fresco. Esta equação é uma aproximação que não leva em conta para qualquer fase de retardo; um fenômeno que frequentemente observado após a diluição de uma cultura de out-crescida na mídia fresca.
    1. Condições de crescimento irá variar dependendo da finalidade do experimento, mas para limitar a variação de célula para célula em níveis de tRNA e aumentar a reprodutibilidade dos resultados, (recomendado) crescem as culturas para firmar o estado antes da amostragem 19.

2. Preparação de pico-em células

Nota: A cepa de Escherichia coli MAS1074, que expressa o gene selC codificação tRNA selC sob o controle de um isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- promotor inducible é usado como a tensão de pico-no.

  1. Dilua uma cultura Superdimensonada de MAS1074 para um OD 436 de 0,05 em MOPS mínimo suplementado com 100 µ g/mL ampicilina e 0,2% de glicose. Crescer a cultura a 37 ° C, agitando a 160 rpm.
    Nota: Veja a discussão para o uso de uma estirpe de referência alternativo.
  2. Em OD 436 ~ 0.1, adicionar IPTG para uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão de tRNA selC. Crescer a cultura para OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h de crescimento) e mover o frasco de cultura para um banho de gelo. Manter a cultura de pico-na célula no gelo até que todas as amostras para a purificação de RNA foram colhidas.

3. Colheita das amostras experimentais.

  1. Pre-quente (37 ° C), um tampado Erlenmeyer de 100 mL (ou similar) contendo 4 mL 10% (p/v) o ácido tricloroacético (TCA) para cada amostra, colocando-o em um banho de água aquecida.
    Nota: cuidado, TCA decompõe-se em cima de aquecimento, produzindo fumos tóxicos e corrosivos, incluindo cloreto de hidrogênio e clorofórmio. A solução em água é um ácido forte; Ele reage violentamente com bases e é corrosivo para muitos metais. Devem ser tomadas precauções adequada quando usando esse líquido.
  2. Imediatamente antes da colheita da pilha, medir e registrar o OD 436 da cultura.
  3. Para colher as células, transferir 4 mL da cultura para um frasco previamente aquecido contendo TCA.
  4. Misturar a amostra agitando o balão com a mão para s. 5 mistura com o TCA imediatamente desativa actividades enzimáticas tudo e, assim, preserva os níveis de carga dos tRNAs.
    Nota: Se várias amostras devem ser recolhidos, manter a amostras colhidas no TCA no gelo até que todas as amostras foram coletadas.

4. Adição de pico-em células

Nota: preparação de pico-em células é descrita na etapa 2.

  1. Quando todos amostras para preparação do RNA foram coletado, adicionar 5% pico-em células (baseadas no OD) para cada amostra.
    Nota: O volume de pico-na célula cultura necessária é calculado pela fórmula:
    figure-protocol-2
    onde V pico denota o volume da cultura de pilha de pico-no necessário, V exp denota o volume da cultura de células experimentais colhidos (sem TCA), OD exp denota o OD 436 da cultura de pilha experimental no momento da colheita no TCA. OD spike denota o OD 436 da cultura pico-na célula. Se múltiplas amostras são colhidas em diferentes ODs, o volume de pico em células adicionado deve ser ajustado de acordo com a fórmula acima para cada amostra.
  2. Para quantificar a contribuição da espiga-em células para as espécies de RNA de interesse, preparar uma amostra contendo somente spike-em células misturando 4ml spike-em células com 4 mL TCA. Preparar RNA a partir desta amostra da mesma forma como para as outras amostras.
  3. , Opcionalmente, tomar outro frasco contendo apenas a amostra experimental, sem pico-em células e incluí-lo para quantificar a contribuição da amostra experimental para o tRNA selC níveis; os níveis endógenos de tRNA selC em Escherichia coli K-12 são insignificante baixo.

5. Preparação do RNA

Nota: protocolo de preparação do RNA o descrito aqui é essencialmente descrito por Vieira et al. 1; Para evitar o deacylation do aminoacylated os tRNAs durante a purificação é importante manter as amostras em pH ácido e a 0 ° C ao longo do curso da purificação. Use tubos/frascos estéreis limpo para manter as amostras e as soluções e preparar todas as soluções com ultrapura (18,2 MΩ·cm resistividade) água.

  1. Pour 8 mL de cada amostra para um tubo de centrifugação refrigerada de gelo. Centrifugar as amostras por 10 min a 9.500 x g a 4 ° C. completamente remover sobrenadante e ressuspender em 0,3 mL frio 0,3 M de acetato de sódio, pH 4,5 e 10 mM de EDTA.
  2. Transferir cada amostra para um tubo de microcentrifugadora frio 1,5 mL e adicionar fenol 0,3 mL solução equilibrada com a mesma reserva.
    Nota: cuidado, fenol produz gases tóxicos e é altamente corrosivo para a pele.
  3. Vortex cada amostra 10 x 15 s pelo menos 1 min entre cada vórtice. Num Vortex manter as amostras em 0 ° C. usar as pausas frequentes para assegurar que as amostras de mantenham-se frio.
  4. Amostras de centrifugar por 15 min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase água (fase superior) para Nova microcentrifuga de 1,5 mL de tubos. Adicionar 0,3 mL frio fenol e vórtice 4 x 15 s como antes.
  5. Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase de água de novo, frio 1,5 mL microcentrifuge tubos contendo 2,5 vezes o volume de etanol a 96% (~ 750 µ l). Precipitar o RNA incubando os tubos por 1h a-20 ° C, ou durante a noite a -80 ° C.
  6. Amostras de centrifugação por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. descartar o sobrenadante e cuidadosamente, adicionar 1 mL de etanol a 70% frio sem perturbar a pelota do RNA. Inverta suavemente uma vez para lavar o interior dos tubos com etanol.
    Nota: O sedimento pode ser difícil ver neste passo.
  7. Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota até não sobrar nenhuma etanol. Resuspenda o pellet vortexing vigorosamente em 20 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4.5 e 1 mM EDTA.
    Nota: Não seque em demasiado a pelota como ele se tornará difícil ressuspender.
  8. , Opcionalmente, avaliar a concentração de RNA medindo a absorbância em 260 nm.
  9. , Opcionalmente, avaliar a qualidade do RNA purificado através de de eletroforese de gel de agarose 20.
  10. Amostras de loja a -80 ° C.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
< classe p= "jove_title" > 6. Preparação da amostra de controle quimicamente deacylated

Nota: para distinguir a banda de aminoacylated tRNA de sua contraparte deacylated na Northern blot, um quimicamente deacylated alíquota é preparado pelo tratamento alcalino. Para a maioria dos fins, é suficiente para deacylate uma única amostra para cada borrão do Norte.

Amostra de
  1. thaw o RNA no gelo. Transfira uma alíquota de 4 µ l da amostra do RNA para um tubo novo. Adicione pH de Tris-HCl µ l 46 9.0. Incubar durante 2 h a 37 ° C.
  2. Adicionar 15 µ l de acetato de sódio 0,3 M, pH 4,5 e posteriormente Adicionar 125 µ l de etanol a 96%. Precipitar o RNA a-20 ° C durante 1 h.
  3. Centrífuga por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e ressuspender em 4 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4,5 e 1 mM EDTA.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, se a amostra é armazenada a -80 ° C.

7. Gel eletroforese e mancha do Norte

  1. Mix 4 µ l de amostra (não tratada ou quimicamente deacylated) com amortecedor do carregamento 6 µ l (0,1 M de acetato de sódio (pH 5.0), 8m ureia, 0,05% de azul de bromofenol e 0.05% xileno cianol).
    Nota: Lembre-se de incluir a amostra contendo apenas spike-em células, o quimicamente deacylated amostra (e a amostra sem espiga-em células, se um estava preparado).
  2. Carregar as amostras em 0,4 mm espessura 6,5% gel de poliacrilamida (acrylam 19:1 - ide:bisacrylamide) que contém ureia 8 M em tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5.0). Usar géis longa de 60 cm para a adequada separação de espécies de tRNA.
  3. Separado do RNA por eletroforese em gel de 10 V/cm a 4 ° C, até o azul de bromofenol atinge o fundo do gel (~ 20 h).
    4. Tintura de
  4. a área da tintura xileno cianol e 20 cm para baixo para o azul de bromofenol é usada para a mancha (a distância entre os dois corantes deve ser 25-30 cm). Separe as placas de vidro de dois, com cuidado para que o gel permanece em um deles. Um pedaço de papel de filtro fino é cortado para o tamanho da área de mancha desejada e colocado em cima da parte do gel que será usado para a mancha. As peças do gel que não são cobertas por papel de filtro são cortadas e descartadas. Use o filtro de papel para levantar cuidadosamente o pedaço de gel de longe a placa de vidro.
    Nota: O gel grande é muito frágil para segurar com cuidado.
  5. Uma membrana de nylon positivamente carregado (por exemplo, membrana Hybond N +) é colocada no topo do gel e é electroblotted a 20 V para 90 min com 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 2 mM EDTA como buffer de transferência.
  6. Crosslink o RNA para a membrana usando luz UV (0.12 J/cm 2).
    Nota: A membrana agora pode ser armazenada à temperatura ambiente e o protocolo pode ser pausado aqui.

8. Projeto e verificação de sondas

Nota: cuidado de projeto e verificação das sondas de borrão do Norte é crucial para obter resultados fiáveis e evitar indesejável Cruz-hibridação com outras espécies de RNA.

  1. Uso curtos oligonucleotides sintéticos como sondas. Desenha a sequência de sonda, de forma que é complementar à parte mais original da sequência do tRNA de interesse - muitas vezes é o loop anticodão.
    Nota: Uma lista de sequências de tRNA previsto de vários organismos pode ser encontrada no tRNA Genomic Database (GtRNAdb) 21.
  2. Ajuste o comprimento da sequência para obter uma previsão de fusão temperatura de 55-65 ° C.
  3. BLAST (básico Local Alignment Search Tool) o escolhido sequenciar contra a sequência do genoma da cepa bacteriana utilizada no experimento, para verificar se a sequência é exclusiva para o tRNA selecionados, conforme descrito em 22.
    Nota: A tabela 1 lista sonda sugeridas sequências de vários tRNAs diferentes de e. coli K12. Se a sonda é específica para o tRNA de interesse, apenas duas bandas são visíveis na Northern blot (carregado e descarregado tRNA) e somente uma faixa é visível na pista com a amostra deacylated (tRNA descarregado). Se mais de duas bandas estão presentes, ou se mais validação da especificidade da sonda é desejada, ver discussão.

9. Hibridação do borrão do Norte

Nota: nas etapas a seguir, a membrana é sequencialmente hibridizada com sondas complementares para os tRNAs específico desejado, incluindo uma sonda específica para a referência de tRNA selC.

  1. Colocar a membrana em um tubo de hibridização e adicionar 6 mL de solução de hibridação (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (p/v) SDS, 100 mg/mL de distorcido e desnaturado DNA de esperma de arenque e 5 x Denhardt ' s solução (100 x Denhardt ' solução s = 2% albumina de soro bovino, 2% e 2% polivinilpirrolidona 40 Ficoll)).
  2. Pre-cruzar a membrana no buffer para 1h rodar a sonda de 42 ° C. Adicionar 30 pmol radioativo oligo-DNA 5 ' - final - rotulado com 32 P (preparado como descrito por Sambrook et al. 23)
    Nota: cuidado, as emissões de alta energia beta de 32 P podem apresentar uma pele substancial e risco de dose de olho. Precaução adequada deve ser tomada quando usar 32 P. Radioactive resíduos deve ser eliminado de acordo com os protocolos de segurança institucionais adequadas.
  3. Incubar a sonda com a membrana de giro durante a noite no 42 ° C. remover a sonda com uma pipeta descartável 10ml.
    Nota: Se armazenado em um freezer a sonda pode ser reutilizada.
  4. No tubo de hibridização, lave a membrana logo em 50 mL de 0,3 M NaCl, citrato de sódio de 30 mM, SDS 0,1% (p/v) à temperatura ambiente.
    Nota: Esta primeira lavagem contém muito desvinculado da sonda e devem ser tratada como altamente radioactivos.
  5. Repeat passo 9.4 uma vez e, em seguida, move a membrana para um recipiente de plástico liso ou bandeja incluindo uma tampa. Cobrir a membrana com a solução de lavagem (0,3 M NaCl, 30mm citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) e ele incube durante 30 min à temperatura ambiente.
  6. Alterar a solução de lavagem e continue a lavar até um sinal / ruído satisfatório foi obtido (geralmente 3-4 alterações de solução de lavagem). Use um tubo de Geiger-Müller para detectar como o barulho de relação sinal muda medindo a radiação de uma área vazia da membrana e compará-lo com a área onde a sonda tem hibridizado especificamente para tRNA.
  7. a fim de ser capaz de retirar a sonda da membrana após a exposição, certifique-se que (importante) a membrana não secar antes do processo de descascamento. Coloca a membrana em um saco plástico fino ou envoltório firmemente usando plástico enrole e selá-lo para ser hermético por soldadura ou fita. Coloque a membrana selada em uma tela de phosphorimaging.
    Nota: O tempo de exposição exigido na tela de phosphorimaging é determinada pela atividade específica da sonda, a quantidade de RNA sondou for e a eficiência de hibridização da sonda e pode variam muito; de alguns minutos a vários dias. Com a experiência, a intensidade da radiação detectada na membrana com o tubo de Geiger-Müller dá uma indicação boa parte do tempo de exposição necessário. Para a quantificação confiável, é importante que a tela não é superexposta.
  8. Scan phosphorimaging tela usando um scanner a laser e salve o arquivo em " .gel " formato.
    Nota: Um sinal elevado à relação de ruído é necessário para a quantificação confiável. Sondagem para um tRNA deve resultar em duas bandas; aminoacylated contendo um tRNA (migração mais lenta) e deacylated contendo um tRNA (migração mais rápida). Consulte a Figura 2.

10. Descascamento da membrana

Nota: antes da membrana pode ser vasculhados a procura de um outro tRNA, a sonda anterior primeiro deve ser removida pelo descascamento da membrana.

  1. Calor suficiente descascamento buffer (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) para cobrir a membrana e despeje-o sobre a membrana. -Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  2. Repita o passo 10.1 até nenhuma radiação pode ser detectado com um tubo de Geiger-Müller; a membrana pode agora ser re-hibridizada seguindo as etapas descritas na seção 9.

11. Quantificar o tRNA e níveis de carregamento

software de
  1. carregar o arquivo .gel para a imagem (consulte a Tabela de materiais). Desenhar uma linha vertical ao longo de cada uma das pistas amostra de tal forma que abrange a maioria da largura da faixa, mas exclui as bordas das bandas onde o sinal pode ser desigual, como mostrado na Figura 3A.
  2. Visualize conta de cada raia clicando " análise "-> " criar gráfico ". Definir manualmente os dois picos que representa a carga e o tRNA descarregado de cada raia, conforme mostrado na Figura 3B.
  3. Obter a contagem de cada pico clicando " análise "-> " relatório de área " e gravar a área sob cada um dos dois picos.
  4. Quando o blot tem sido vasculhados a procura de tRNA selC e pelo menos um tRNA de interesse, normalizar os níveis do tRNA de interesse para tRNA selC.
    1. Calcular a proporção de tRNA provenientes da espiga-em células em cada pista e subtrair o total de sinal em lane usando a equação:
      figure-protocol-3
      Nota: aqui, Amostra de tRNA = o sinal obtido de uma única faixa de uma membrana sondada para o tRNA desejado; Amostra selC = o sinal obtido a partir da mesma pista da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC; Ref tRNA = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana sondada para o tRNA desejado; Ref selC = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC.
    2. Para normalizar, divida o valor corrigido do tRNA de cada raia pelo sinal selC tRNA do pista mesmo.
      Nota: A contribuição para o sinal da selC tRNA de células amostradas é negligenciável (consulte a Figura 2, lane rotulado "-selC ").
  5. Calcular o tRNA carregamento de nível para cada pista dividindo-se o sinal do pico representando tRNA carregada com a soma do sinal de dois picos (carregada + descarregado).

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Resultados

Usar o procedimento descrito aqui, a abundância e cobrando os níveis dos três tRNAs foram medidos em Escherichia coli K-12 antes e durante a fome de aminoácidos.

O auxotroph de arginina estirpe NF9154 (thr leu sua argH thi mtl supE44) foi cultivada pelo menos dez gerações em MOPS mínimo suplementado com 0,4% de glicerol, 50 treonina µ g/mL, leucina, arginina e histidina 5 µ g/mL a 37 ° C...

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Discussão

Este protocolo descreve como simultaneamente, medir o nível de carga de específico de e. coli tRNAs e comparar os níveis relativos dos tRNAs em amostras diferentes. Os pontos críticos do protocolo são 1) para manipular as amostras de tal forma que os níveis de carga celular tRNA são retidos, 2) para normalizar as quantidades de tRNA de tal forma que níveis de tRNA relativo em amostras diferentes podem ser comparados confiantemente e 3) para garantir a sp ecificity dos testes selecionados para os tRNAs de interes...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Marit Warrer excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho dinamarquês para pesquisa independente | Ciências naturais [1323-00343B] e a Fundação de pesquisa nacional dinamarquesa [DNRF120].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
UréiaMerck57-13-6Pureza >99%
PoliacrilamidaServa79-06-7
Bis (N, N'-Metileno-bis-acrilamida)BIO-RAD161-0201
Ácido tricloroacético (TCA)Sigma76-03-9
FenolMerck108-95-2
IPTG
Acetato
Sódio e Glicose
EDTA
Etanol
Tris
Ácido
Cloreto
NaH2PO4
Sigma
ATPPerkin Elmer
DNA oligos (sondas)TAG Copenhagen
Hybond N+ membranaGE HealthcareRPN203B
Crosslinker
ElectroblotterBIO-RAD
Typhoon FLA 7000 ScannerGE Healthcare28955809
Forno
Tela de imagem de fósforoGE Healthcare
de hibridização
Frascos
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos
centrífuga de 20 ml
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Software
ImageQuantGE Healthcare
ExcelMicrosoft
declorídricode Sódio 100403-24-5 BSA Polivinilpirrolidona Ficoll P32 do esperma do arenque do SDS do citrato de sódio γ de Hidretização de Espectrofotômetro Geiger-Mütubo llerTubo de culturade

Referências

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
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