Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Resumo

Aqui nós apresentamos um método para medir diretamente o RNA de transferência, níveis de carga de purificado Escherichia coli RNA, bem como uma maneira de comparar os níveis relativos do RNA de transferência, ou qualquer outro RNA curto, entre diferentes amostras baseadas na adição de pico-no células expressando um gene de referência.

Resumo

RNA de transferência (tRNA) é uma parte essencial da maquinaria translacional em qualquer organismo. os tRNAs bind e transferir os aminoácidos para o ribossoma traduzir. Os níveis relativos de tRNAs diferentes e a relação de aminoacylated tRNA para total tRNA, conhecido como o nível de carga, são fatores importantes na determinação da precisão e velocidade de tradução. Portanto, a abundância e níveis de carga dos tRNAs são variáveis importantes para medir quando estudar a síntese de proteínas, por exemplo, sob diferentes condições de estresse. Aqui, descrevemos um método para a colheita de tRNA e medição diretamente tanto a abundância relativa e o nível de carregamento absoluto de espécies específicas de tRNA em Escherichia coli. O tRNA é colhida de forma que o laço lábil entre o tRNA e o aminoácido é preservado. O RNA é então submetido a electroforese do gel e do Norte, mancha, que resulta em separação entre os tRNAs carregado e descarregado. Os níveis de tRNAs específico em amostras diferentes podem ser comparados devido à adição de pico-em células para normalização. Antes da purificação de RNA, adicionar 5% de células de Escherichia coli que overproduce o tRNA raro^selC para cada amostra. A quantidade de espécies de interesse em uma amostra de tRNA então é normalizada para a quantidade de tRNA^selC na mesma amostra. Adição de pico-em células antes da purificação de RNA tem a vantagem sobre a adição de purificado spike-em RNAs que é também responsável por eventuais diferenças de eficiência de lise celular entre as amostras.

Introdução

A seguir, apresentamos um método para quantificar os tRNAs específicas e níveis de medição de sua carga pela mancha do Norte. O método é baseado em uma técnica desenvolvida por Vieira et al . ¹. colheita de células em ácido tricloroacético (TCA) e mantendo as amostras a 0 ° C em toda a purificação de RNA, a ligação éster entre o tRNA e o aminoácido é conservada^2,3,4. TRNAs Aminoacylated distingue suas contrapartes nonacylated por eletroforese em gel e mancha do Norte, devido a uma diminuição da mobilidade do aminoacylated tRNA no gel, causado ....

Protocolo

1. preparação de culturas bacterianas.

1. Crescer todas as culturas em Erlenmeyers com uma relação de volume de cultura/frasco no máximo 1/6. Em uma instalação experimental típica, crescem as culturas a 37,0 ° C e agitando a 160 rpm em morpholinepropanesulfonic ácido (MOPS) mínimo médio ¹⁸ suplementado com a fonte de carbono preferencial, por exemplo glicose 0,2%, pelo menos 10 gerações consecutivas antes da colheita do RNA.
2. o dia antes da colheita de RNA, diluir uma cultura Superdimensonada da estirpe desejada em meio mínimo ESPANADORES de tal forma que vai chegar a desejada OD ₄₃₆ no momento desejado no dia segui....

Resultados

Usar o procedimento descrito aqui, a abundância e cobrando os níveis dos três tRNAs foram medidos em Escherichia coli K-12 antes e durante a fome de aminoácidos.

O auxotroph de arginina estirpe NF915⁴ (thr leu sua argH thi mtl supE44) foi cultivada pelo menos dez gerações em MOPS mínimo suplementado com 0,4% de glicerol, 50 treonina µ g/mL, leucina, arginina e histidina 5 µ g/mL a 37 ° C.......

Discussão

Este protocolo descreve como simultaneamente, medir o nível de carga de específico de e. coli tRNAs e comparar os níveis relativos dos tRNAs em amostras diferentes. Os pontos críticos do protocolo são 1) para manipular as amostras de tal forma que os níveis de carga celular tRNA são retidos, 2) para normalizar as quantidades de tRNA de tal forma que níveis de tRNA relativo em amostras diferentes podem ser comparados confiantemente e 3) para garantir a sp ecificity dos testes selecionados para os tRNAs de interes.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Uréia	Merck	57-13-6	Pureza >99%
Poliacrilamida	Serva	79-06-7
Bis (N, N'-Metileno-bis-acrilamida)	BIO-RAD	161-0201
Ácido tricloroacético (TCA)	Sigma	76-03-9
Fenol	Merck	108-95-2
IPTG
Acetato
Sódio e Glicose
EDTA
Etanol
Tris
Ácido
Cloreto
NaH2PO4
Sigma
ATP	Perkin Elmer
DNA oligos (sondas)	TAG Copenhagen
Hybond N+ membrana	GE Healthcare	RPN203B
Crosslinker
Electroblotter	BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner	GE Healthcare	28955809
Forno
Tela de imagem de fósforo	GE Healthcare
			de hibridização
Frascos
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos
			centrífuga de 20 ml
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Software
ImageQuant	GE Healthcare
Excel	Microsoft

declorídricode Sódio 100403-24-5 BSA Polivinilpirrolidona Ficoll P32 do esperma do arenque do SDS do citrato de sódio γ de Hidretização de Espectrofotômetro Geiger-Mütubo llerTubo de culturade