Method Article

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

DOI:

10.3791/56221

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September 21st, 2017

 ,  , 
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós relatamos os protocolos para a síntese e purificação de oligômeros de peptídeo ácido nucleico (PNA) incorporando modificado de resíduos. São descritos os métodos bioquímicos e biofísicos para a caracterização do reconhecimento dos duplex RNA pelas PNAs modificados.

Abstract

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RNAs estão emergindo como importantes biomarcadores e alvos terapêuticos. Assim, há grande potencial no desenvolvimento de sondas químicas e terapêuticas ligantes para o reconhecimento da estrutura e sequência de RNA. Quimicamente modificados peptídeo ácido nucleico (PNA) oligómeros foram recentemente desenvolvidos que pode reconhecer os duplex RNA em uma maneira sequência-específica. PNAs são quimicamente estável com um backbone de peptídeo-como neutro. PNAs pode ser sintetizada relativamente facilmente pelo método de síntese do peptide de fase sólida Boc-química de manual. PNAs é purificada por HPLC de fase reversa, seguida pelo peso molecular caracterização do laser assistida por matriz dessorção/ionização-tempo de voo (MALDI-TOF). Técnica de eletroforese (página) do gel de polyacrylamide Non-desnaturação facilita a imagem da formação triplex, porque cuidadosamente projetado, frente e verso livre RNA constrói e PNA vinculado triplexes frequentemente mostrar taxas de migração diferentes. PÁGINA de non-desnaturação com brometo de etídio post coloração é muitas vezes uma técnica fácil e informativa para caracterizar as afinidades de ligação e especificidades de oligômeros PNA. Normalmente, vários ganchos de RNA ou duplex com mutações de único par de base podem ser usados para caracterizar Propriedades de vinculação de PNA, tais como ligação de afinidades e especificidades. 2-aminopurina é um isômero da adenina (6-aminopurina); a intensidade de fluorescência 2-aminopurina é sensível às mudanças de ambiente estrutural local e é apropriada para o acompanhamento da formação triplex com o resíduo de 2-aminopurina incorporado perto do local de ligação do PNA. 2-aminopurina titulação de fluorescência também pode ser usada para confirmar a seletividade de vinculação da PNAs modificadas no sentido de alvo RNAs double-stranded (dsRNAs) sobre single-stranded RNA (ssRNAs). Experiências de fusão térmicas UV-absorvância-detectado permitem a medição da estabilidade térmica de duplex PNA-RNA e PNA· Triplex de2 do RNA. Aqui, descrevemos a síntese e purificação de oligômeros PNA incorporando modificado de resíduos e descrever métodos bioquímicos e biofísicos para a caracterização do reconhecimento dos duplex RNA pelas PNAs modificados.

Introduction

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RNAs estão emergindo como importantes biomarcadores e alvos terapêuticos, devido aos avanços recentes em descobertas de funções dos RNAs na regulação e catálise de diversos processos biológicos,1,2,3. Tradicionalmente, vertentes antisentidos têm sido utilizados para ligar a ssRNAs através de Watson-Crick formação duplex3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. recentemente, triplex-formando ácidos nucleicos peptídeo (TFPNAs) foram projetados para ligar a dsRNAs através de estruturas (Figura 1)3,28,29de hidrogénio. regiões de dsRNA estão presentes na maioria dos RNAs antisentido-alvo tradicionais, incluindo mRNAs, pre-pre-mRNAs ou pri-miRNAs3e muitos outros não-codificantes RNAs1,26,27. Visando dsRNAs através da formação de tripla hélice usando o TFPNAs pode ser vantajoso devido à sua especificidade de estrutura e é de grande potencial para uso em restaurar as funções normais dos RNAs, que são a desregulação nas doenças, por exemplo.

O recentemente publicado trabalho de Rozners et ale nos3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, relatou os esforços na melhoria a ligação seletiva de TFPNAs modificados para dsRNAs com maior afinidade. Desenvolvemos métodos de síntese de monômeros PNA racionalmente projetados (Figura 2) incluindo thio-pseudoisocytosine (L) monômero30 e monômero de guanidina-modificado 5-metil-citosina (Q)31. Através de vários métodos de Caracterização bioquímica e biofísica, demonstrámos que relativamente curtos PNAs (resíduos de 6-10), incorporando resíduos L e Q mostram reconhecimento melhorado de pares de bases Watson-Crick G-C e C-G, respectivamente, em dsRNAs. Além disso, comparado a PNAs não modificados, PNAs que contenham resíduos de L e Q mostram vinculação mais seletiva para dsRNA ssRNA e dsDNA. A funcionalidade de guanidina42 na base Q permite PNAs entrar de células HeLa31.

Em nosso laboratório, podemos sintetizar PNAs pelo manual Boc-química (Boc ou t- COB defende tert-butyloxycarbony4método síntese do peptídeo de fase sólida (ver Figura 2). A síntese do monômero PNA com Boc como proteger o grupo amina é conveniente, como o grupo Boc é estericamente menos volumoso em comparação com fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amina, protegendo o grupo, que pode ser benéfico durante monômero PNA acoplamento a suporte sólido. O grupo Boc é ácido-lábil e pode ser facilmente removido com o sólido apoio por 20-50% de ácido trifluoroacético (TFA) em diclorometano (DCM) durante a síntese PNA. Um sintetizador de peptídeo automatizado pode ser empregado para sintetizar oligómeros PNA; no entanto, 3-5-fold excesso de monômero PNA é necessária para um sintetizador de peptídeo automatizado. Manual síntese requer significativamente menos monômero PNA (excesso de 2-3-fold), com cada acoplamento facilmente monitorado pelo Kaiser teste43. Além disso, muitos sintetizadores automatizados não são compatíveis com a síntese de estratégia do COB devido ao uso de TFA corrosivo durante a etapa de remoção do Boc.

Os oligómeros PNA podem ser purificados por reverso-fase alta-cromatografia líquida (HPLC-RP) seguida por peso molecular caracterização por MALDI-TOF (figuras 3 e 4)30, 31. empregamos página não-desnaturação para monitorar a formação triplex, devido ao fato de que livre duplex RNA constrói e PNA vinculado triplexes frequentemente mostra migração diferentes taxas (Figura 5)30,31 . Não há rotulagem é necessário se eficiente pós-coloração pode ser alcançado para ambos o RNA frente e verso e PNA· Bandas de triplex2 RNA. Uma relativamente pequena quantidade de amostra é necessária para experimentos de página não-desnaturação. No entanto, os buffers de carregamento (incubação) e os buffers da execução (pH 8,3) podem não ser o mesmo, resultando nas medições limitadas as triplexes cineticamente estáveis, porque um pH relativamente alto de 8.3 significativamente pode desestabilizar um triplex.

2-aminopurina é um isômero da adenina (6-aminopurina); a intensidade de fluorescência 2-aminopurina (com um pico de emissão em cerca de 370 nm) é sensível às mudanças de ambiente estrutural local e é apropriado para o acompanhamento da formação triplex com o resíduo de 2-aminopurina incorporados perto o PNA (sítio de ligação A Figura 6) 31. ao contrário de muitos outros corantes que mostram a emissão de fluorescência na faixa visível, 2-aminopurina-etiquetados RNA pode ser exposto a luz do quarto sem foto branqueamento. Ao contrário de experimento da página em que uma execução tampão de pH 8.3 é muitas vezes necessária, 2-aminopurina com base em titulação de fluorescência permite a medição da ligação em uma solução com um pH especificado e assim pode permitir a medição e a detecção de relativamente fraco e cineticamente instável ligação em equilíbrio.

Experiências de fusão térmicas UV-absorvância-detectado permitem a medição da estabilidade térmica de duplex (Figura 7)31 e triplexes30,32,44,45. Dependendo da composição de comprimento e sequência, o derretimento de triplexes pode ou não mostrar uma transição clara. Parâmetros termodinâmicos podem ser obtidos se se sobrepõem as curvas de aquecimento e resfriamento. Parâmetros termodinâmicos precisos podem ser obtidos por titulação isotérmica (ITC) a calorimetria32; no entanto, relativamente grandes quantidades de amostras são geralmente necessárias para ITC.

Protocol

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1. manual fase sólida peptídeo síntese de PNAs usando Boc química

Nota: para o sucesso e a facilidade da síntese oligómero PNA desejada, todos os solventes e reagentes devem ser anidro. Adicionar as apropriado peneiras moleculares (4A, pastilhas de diâmetro de 1-2 mm) e ocasionalmente purgar o gás nitrogênio seco em garrafas. Para a síntese de monômeros PNA modificados, os protocolos relatados nas respectivas referências 30 , 31 podem ser usados. Monômeros PNA não modificados podem ser adquiridos de fontes comerciais. Em cada uma das etapas de lavagem, a quantidade adequada de solvente é adicionada à resina, formando uma pasta, antes de ele é drenado fora

  1. Carregamento do primeiro monómero e tampando as excesso livre aminas primárias sobre a resina
    1. pesar 30 mg de cloridrato de 4-methylbenzhydrylamine (MBHA·HCl) de poliestireno de resina (comercialmente disponível; carregar valor 0,7-1,4 mmol/g; tamanho de engranzamento de 100-200) e transferência para 5 mL de uma embarcação da reação de fase sólida peptídeo equipado com uma rolha de vidro e torneira.
    2. Embeber a resina em uma quantidade adequada de DCM para 1 h, permitindo que a resina a inchar e expor as aminas (sal de HCl).
      Nota: Grânulos de resina devem sempre estar totalmente submersa em solventes durante a síntese.
    3. Drenagem fora o DCM aplicando um fluxo suave de gás nitrogênio seco no topo do balão. Adicionar 1 mL de 50% (v/v) N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) em DCM e deixá-lo por 15 min. Isso neutraliza o HCl sal anexado para as enciclopédia aminas na resina.
    4. Repeat passo 1.1.3. Enquanto isso, pesar 6 µmol de monômero e 6 µmol de Hexafluorofosfato de tripyrrolidinophosphonium (benzotriazolo-1-yl-oxi) (PyBOP) e transferir para um tubo de 1,5 mL. Adicione 200 µ l de dimetilformamida (DMF) e 12 µmol de DIPEA. Vórtice a solução de acoplamento de 3-5 min.
      Nota: O valor desejado de carga usado é 0,2 mmol/g. O primeiro monómero adicionado é o monômero no C-terminal da sequência desejada de PNA. O valor de carregamento do primeiro aminoácido pode ser calculado pelo ácido pícrico método 46.
      5. Solução de
    5. dreno fora a DIPEA do DCM. Lave a resina com DCM (x 3), seguida por DMF (x 3) e fechar a torneira. Adicionar a solução de acoplamento preparado para a resina e agite. Empurre a resina ao longo das paredes internas do navio para a solução de acoplamento com o uso de uma espátula limpa inox. Anexar a rolha de vidro e segura do navio em um agitador de incubadora para 3h em 40 ° C.
      Nota: Como alternativa, a embarcação da reação pode ser mantida constante em temperatura ambiente durante 6-8 h permitir a conclusão do peptide reação de acoplamento.
    6. Preparar a solução tampando misturando 240 µmol de anidrido acético e 360 µmol de DIPEA em 200 µ l de DCM. Escorrer a solução de acoplamento e lave a resina com DMF (x 3) e DCM (x 3). Adicione a solução tampando e deixar o navio por 30 min, ocasionalmente sacudindo o recipiente suavemente. Capturando com máscaras dos grupos amina primária livre em excesso as resinas por acetilação.
    7. Repeat passo 1.1.6. Drenar a solução tampando e lave a resina com DCM (x 3).
    8. Remover uma pequena alíquota de grânulos de resina, usando um tubo capilar fino e colocá-los em um frasco de vidro pequeno 1,5 mL. Realize o teste de Kaiser 43. Adicione 15 µ l de cada um do Kaiser soluções de teste para o vidro frasco e usando um soprador de calor. Observe a cor dos grânulos após o aquecimento. A cor dos grânulos deve permanecer inalterada, indicando a falta de grupos amina livre na resina.
      Nota: O kit de teste de Kaiser está comercialmente disponível ou pode ser preparado de acordo com o protocolo relatado. R: solução de ninidrina em etanol; solução b: fenol em etanol; solução c: cianeto de potássio (KCN) em piridina.
      Cuidado: KCN é altamente tóxico; deve usar roupa protetora adequada e aquecimento deve ser executado em uma coifa ventilado, na ausência de solventes inflamáveis ou reagentes.
    9. Repita o passo 1.1.6 se os grânulos de resina exibir cor azul azul ou desmaiar.
  2. Remoção do grupo protector do N-terminal amina
    1. drenar os solventes da embarcação da reação e adicionar uma solução de 50% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em DCM, garantindo que as resinas são totalmente submersa. Deixe o recipiente por 15 minutos, agitando ocasionalmente para facilitar a desproteção dos grupos amina. Repita 2 ciclos mais.
      Atenção: O TFA é altamente corrosivo. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando.
    2. Lavar a resina com DCM (x 3), DMF (x 3) e DCM (x 3). Adicionar uma solução de 5% DIPEA em DCM. Deixe o recipiente por 15 min. Esta etapa ativa as aminas livre neutralizando os ânions de contador TFA. Repetir uma vez mais....
    3. Lavar a DIPEA da solução DCM. Lave a resina com DCM (x 3). Realize o teste de Kaiser (etapa 1.1.8).
      Nota: O sucesso desproteção dos grupos amina renderá descoloração azul dos grânulos. Quando desproteção é bem-sucedido, acoplamento subsequente de monômeros por acoplamento de peptídeo pode ser realizado.
  3. Acoplamento de monômeros subsequentes
    1. pesa 18 µmol de desejado monômero (para o monômero de Boc-PNA-Q-OH, 13,2 mg de monômero é pesado) e 18 µmol de PyBOP em um tubo de 1,5 mL. Adicione 200 µ l de DMF e 36 µmol de DIPEA no tubo de 1,5 mL. Vórtice até todos os compostos sólidos são dissolvidos.
    2. Lavar a resina com DMF (x 3). Adicionar a solução de acoplamento para o recipiente de reação e agite. Empurre a resina ao longo das paredes internas do navio para a solução de acoplamento com o uso de uma espátula limpa inox. Anexar a rolha de vidro e segura do navio em um agitador de incubadora para 3h em 40 ° C.
    3. Drenagem fora a solução de acoplamento e lave a resina com DMF (x 3) e DCM (x 3). Execute a etapa 1.1.8. Se a cor dos grânulos permanece inalterado, repita as etapas de 1.2.1-1.3.3 até a sequência desejada de PNA é concluída. Se descoloração azul dos grânulos é observada após o acoplamento de um monômero, repita as etapas 1.3.1-1.3.3. Se descoloração ainda persistir, execute a tampando novamente (etapa 1.1.6).
      Nota: Acoplamento tempo (3-12 h) e/ou uso de equivalente em excesso de monômero estendida e reagentes de acoplamento são recomendados se houver problemas com acoplamento.
    4. , Uma vez que a sequência PNA desejada for concluída, lave a resina com DMF (x 3) e DCM (x 3). Seque completamente a resina aplicando um fluxo contínuo de gás nitrogênio seco por 15 min. Esta resina seca pode ser dividida e usada para anexar a lisina ou uma etiqueta fluorescente como cianina 3 (Cy3) e carboxyfluorescein no N-terminal da ANP.
  4. Fixação da marca de lisina ou fluorescentes (Cy3 e Cy5, carboxyfluorescein) para o N-terminal da PNA
    1. pesa 10 mg de resina, pre-loaded com a sequência PNA desejada. Transferir para um recipiente de reação de 5 mL. Mergulhe a resina no DCM por 1 h.
    2. Para a ligação de lisina, executar etapas 1.2.1-1.3.3, substituindo o monômero com qualquer Boc-Lys (Z) - OH ou Fmoc-Lys (Boc) - OH.
    3. Para a ligação de carboxyfluorescein, executar passos 1.2.1-1.3.3, com 10 vezes excesso de 5 6-carboxyfluorescein como o monômero, e N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) e hydroxybenzotriazole (HOBt) como os reagentes de acoplamento em DMF. Embora a reação de acoplamento durante a noite no shaker incubadora em 40 ° C.
      Nota: Como carboxyfluorescein é sensível à luz, a embarcação da reação deve ser coberta com papel alumínio.
    4. Para a fixação do corante Cy3 ou Cy5, rótulo pelo método de química clique, executar etapas 1.2.1-1.3.3, substituindo o monômero com N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Isto functionalizes o N-terminal da ANP com um grupo de alquino. Realizar a reação catalisada por cobre clique para anexar o contendo azida Cy3 ou Cy5 fluorescente tintura 12 ,, 47 , 48 , 49
  5. Clivagem PNA de apoio sólido, purificação e caracterização
    Nota: se qualquer grupo amina está protegido com o Fmoc proteger o grupo, primeiro deprotect o grupo amina, tratando com piperdine de 20% em DMF solução para 15 min (2 ciclos). Lave a resina cuidadosamente com DMF (x 3) seguido pelo DCM (x 3). Seca a resina, aplicando um fluxo contínuo de gás nitrogênio seco por 15 min.
    1. De transferência de 5 mg de resina seca em um pequeno frasco. Adicione 10 µ l de thioanisole e 4 µ l de 1,2-Etanoditiol, garantindo que a resina está submersa nos reagentes. Deixar o tubo em temperatura ambiente por 5 min.
      Nota: Estes reagentes atuam como catadores, que armadilha reativa espécie catiônica que se formam durante a remoção de proteger grupos na ANP. Necrófagos adequados podem ser escolhidos com base na cadeia de lado protegendo grupos.
      2. Adicione 100 µ l de TFA no tubo que contém a resina e catadores de
    2. . Delicadamente a mistura de vórtice e sujeito à centrifugação breve. Deixar o tubo em temperatura ambiente por 10 min.
      Atenção: O TFA é altamente corrosivo. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando.
    3. , Cuidadosamente, adicionar 20 µ l de ácido tríflico (TFMSA) para o tubo. Agite suavemente a mistura de reação antes de submeter a centrifugação breve à temperatura ambiente. Deixar o tubo estável à temperatura ambiente por 2 h.
      Atenção: O TFMSA é altamente corrosivo. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando.
    4. Filtro fora a clivagem cocktail num balão de fundo redondo de 5 mL (RBF) com o uso de um vidro Pasteur pipeta equipado com algodão. Use uma pequena quantidade de TFA para lavar a resina.
    5. Purga do gás nitrogênio seco ao filtrado coletado até todos os solventes voláteis se evaporam. Adicionar 1 mL de éter dietílico frio para a RBF.
      Nota: O éter dietílico fará com que a ANP a precipitar.
      1. Enxaguar a RBF com o dietil éter várias vezes antes de transferir a solução turva em um tubo de 1,5 mL. O tubo de centrifugação de assunto para permitir que o precipitado PNA resolver. Decantar os solventes e adicionar 300-500 µ l de água esterilizada para o precipitado. Vórtice cuidadosamente para dissolver o PNA.
    6. Purificar a amostra PNA bruta através de RP-HPLC utilizando water-acetonitrile-0.1% TFA como fase móvel. Recolher as frações correspondentes, evaporar todos os solventes usando um concentrador a vácuo antes de re-dissolvendo a ANP purificada em água esterilizada.
    7. Caracterizam a ANP purificada através de análise de MALDI-TOF com o uso de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) como a matriz de cristalização amostra.
    8. Medir a absorvância UV (260 nm) da ANP no 65 ° C. calcular a concentração da ANP com a equação:
      figure-protocol-1
      Nota: aqui o c é a concentração, A é a leitura de absorbância obtida, ε é o coeficiente de extinção da sequência de RNA e l é o comprimento do percurso óptico da cubeta (1 cm). O coeficiente de extinção da sequência PNA é a soma do coeficiente de extinção de monômeros individuais 50. Os coeficientes de extinção da adenina, citosina, guanina e timina são 15,4, 7.3, 11,7 e 8,8 mL/µmol·cm, respectivamente. O coeficiente de extinção dos L e Q monômeros usados presume-se ser a mesma que a de citosina (C) base.

2. Non-desnaturação página

  1. preparação de soluções tampão necessário
    1. tampão de incubação preparar (10 mL) usando 116,88 mg NaCl (200 mM), 50 µ l de ácido etilenodiaminotetracético de 100mm (EDTA) (0,5 mM), 200 µ l de estoque de 1 M HEPES (20mm), 9,75 m H 2 O; ajuste o buffer para pH 7.5.
    2. Preparar 1 x buffer de execução de Tris-borato-EDTA (TBE) (1 L) usando 100 mL 10 x Tris-borato-EDTA em pH 8.3 e 900 mL H 2 O.
    3. Prepare-se 10% de amônio persulfato (APS) solução (300 µ l) usando persulfato de amónio de 30 mg e 300 µ l H 2 O.
  2. Preparação do gel de polyacrylamide 12%
    1. limpar o pente bem formando, placas de fundição de vidro e espaçadores com etanol; o pente bem formando e espaçadores são de 1 mm de espessura. Configurar o assembly de gel e selar com fita de vedação de gel de.
    2. Para um gel de poliacrilamida de 22 x 16,5 cm x 1 dimensão mm, 50 mL de solução de gel é adequada. Pesar 5,7 g de acrilamida e 0,3 g de N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) e transferir para uma centrífuga de 50 mL tubo.
      Atenção: A acrilamida é cancerígena. Evitar a inalação de poeira fumos de acrilamida e certifique-se de que a roupa de proteção adequada é usada ao manusear.
    3. Dissolver compostos sólidos em 50 mL 1 X TBE execução de tampão, colocando o tubo de centrifugação em um banho de água de 50 ° C por 15 min ou até que todos os compostos sólidos dissolvido. Realize a centrifugação (3.000 rpm, 5 min, 25 ° C) para remover todas as bolhas de ar dentro da solução. Deixar a solução arrefecer à temperatura ambiente.
    4. Adicionar 250 µ l de solução APS de 10% e 50 µ l de tempted (TEMED) para a solução de gel e misture delicadamente com uma espátula. Imediatamente despeje a solução entre as placas de vidro, certificando-se de não apresentar quaisquer bolhas de ar. Inserir o pente bem formando e deixar a instalação do gel em temperatura ambiente pelo menos 60 min permitir a polimerização ocorra, antes de armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para usar.
  3. Preparação de amostras
    1. remover a quantidade necessária de grampo do RNA (1 µM) do estoque principal em um tubo limpo 1,5 mL. Secar a solução do RNA usando um concentrador a vácuo.
      Nota: Cada amostra contém 1 µM de RNA em tampão de incubação 20 µ l. Normalmente, 13 amostras do RNA são preparadas para experimentar uma página. O RNA para todas as amostras pode ser preparado juntos em um único tubo.
    2. Retire os volumes necessários de PNA alvo (com a concentração final de até 50 µM) do estoque principal e transferência em tubos separados 1,5 mL. Evaporar a água das soluções PNA usando um concentrador a vácuo.
    3. Adicionar 260 µ l de tampão de incubação para a 1,5 mL tubo contendo secas RNA e misture cuidadosamente para garantir que todos os RNA é dissmesmo. Sujeitar o RNA para encaixar refrigeração: lugar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) por 5 min. imediatamente transferir para um banho de gelo e deixe por 10 min.
      4. Tubos de
    4. Adicionar 20 µ l de RNA em cada um da 1,5 mL contendo secas PNA e misturar cuidadosamente. Executar o recozimento: Coloque o tubo contendo a mistura de RNA e PNA em um bloco de calor (pré-aquecido a 65 ° C) durante 10 min. vire o poder do bloco do calor e deixe as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite.
  4. Execução e processamento de gel
    1. remova a fita de gel de selagem no lado inferior da placa de vidro. Montar e fixar a placa de vidro sobre o carrinho de gel de vertical utilizando grampos de plástico.
      Nota: O gel em execução é realizado em uma sala fria a aproximadamente 4 ° C. Todo o equipamento, amostras e os amortecedores são arrefecidos a 4 ° C antes de executar o gel.
    2. Encher o reservatório de tampão inferior com 1 x TBE buffer de execução até que a placa está submersa em aproximadamente 1-2 cm de tampão em execução. Encher o reservatório superior amortecedor com tampão em execução até que o nível do buffer excede o topo do gel por 1-2 cm. lentamente e com cuidado, remova o pente bem formando, permitindo que o buffer corrente encher os poços.
      3. O carrinho de gel de
    3. conectar uma fonte de alimentação. Pre-funcione o gel pelo menos 30 min com uma tensão constante de 250 V, que é otimizado para um 22 x 16,5 cm x gel de 1 mm.
    4. Entretanto, adicionar 4 µ l (20% do volume de amostra) de solução de glicerol de 35% para cada uma das amostras e misture delicadamente. Uma vez que a pre-execução é concluída, carregar 20 µ l de cada amostra (incluindo uma amostra de RNA sozinha mais amostras contendo mistura de RNA e PNA) cuidadosamente na parte inferior do bem, usando uma micropipeta e gel de carregamento dicas, certificando-se de não apresentar quaisquer bolhas de ar. Funcione o gel com uma tensão constante de 250 V, semelhante para a pré-executar, por 5 h.
    5. Parar o fornecimento de energia após 5h e retire a placa de vidro do suporte. Remova a fita de gel de selagem restante e desmontar a placa de vidro. Suavemente retire e mergulhe o gel em um recipiente enchido com 350 mL de água desionizada. Cuidadosamente, adicione 35 µ l de brometo de etídio (10 mg/mL) e coloque o recipiente num agitador de plataforma (baixa velocidade) por 30 min.
      Atenção: O brometo de etídio é um agente mutagénico. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando.
    6. Descarte a solução de brometo de etídio em um recipiente de recolha designado. Lave o gel com 1,5 a 2 L de água destilada. Digitalizar o gel usando um sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais) com um laser verde de 532 nm e emissão filtram conjunto em 610 nm.
  5. Análise do gel
    1. quantificar as intensidades de banda de gel usando um software livre, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normalizar as intensidades de banda de acordo com:
      figure-protocol-2
      Nota: aqui eu max frente e verso é a intensidade da banda do hairpin RNA sozinho sem a adição de PNA e eu triplex max é a intensidade da banda triplex com a maior concentração de PNA adicionado.
      1. Calcular a fração de formação triplex de acordo com:
        figure-protocol-3
    2. enredo a fração da formação triplex (Y) contra a concentração de PNA adicionado ( ΜM). Ajustar os dados para a equação para obter a constante de dissociação (K d):
      figure-protocol-4
      Nota: aqui R 0 é a concentração de grampo do RNA (1 µM). Aqui Y 0 e B são a inicial e a mudança máxima da fração triplex, respectivamente. Y é a fração de triplex variada concentração de PNA. X é a concentração total de PNA e K d é a constante de dissociação.

3. 2-aminopurina fluorescência ensaio

  1. preparação de amostras (contendo dsRNA)
    1. remover a quantidade necessária de 2-aminopurina (2AP) rotulada dsRNA (1 µM para cada vertente) do estoque principal em um tubo limpo 1,5 mL. Evaporar a água nas soluções do RNA usando um concentrador a vácuo.
      Nota: Cada amostra contém 1 µM de RNA em tampão de incubação 75 µ l. Normalmente, preparam-se 13 amostras do RNA. RNA para todas as amostras pode ser preparado juntos em um único tubo.
    2. Retire os volumes necessários da ANP orientada para as diferentes concentrações do estoque principal e transferência em tubos separados 1,5 mL. Evaporar a água das soluções PNA usando um concentrador a vácuo.
    3. Adicionar 975 µ l de tampão de incubação para a 1,5 mL tubo contendo secas RNA e misture cuidadosamente para garantir que todos os RNA é dissolvido. Centrifugue a solução de RNA brevemente e submetê-la a recozimento: colocar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) durante 10 min. vire o poder do bloco do calor e deixe as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente.
      4. Tubos de
    4. Adicionar 75 µ l de RNA em cada um da 1,5 mL contendo secas PNA e misturar cuidadosamente. Deixar as amostras à temperatura ambiente pelo menos 1 h. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite.
  2. Preparação de amostras (contendo ssRNA)
    1. remover a quantidade necessária de ssRNA 2AP-rotulado (1 µM) do estoque principal em tubos limpos 1,5 mL. Extrai os volumes necessários de PNA orientada para as diferentes concentrações de estoque principal e transferência para os tubos de respectivos 1,5 mL que contêm a ssRNA. Secar a mistura de RNA e PNA usando um concentrador a vácuo.
    2. Adicionar 75 µ l de incubação buffer em cada um dos tubos de 1,5 mL e homogeneiza. Submeta a mistura a recozimento: colocar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) durante 10 min. vire fora a alimentação e deixar as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite.
  3. Medição e análise
    1. usar um Espectrofotômetro de fluorescência para medir a emissão em um intervalo de comprimento de onda de 330-550 nm. Usar um comprimento de onda de excitação de 303 nm.
      Nota: As amostras são medidas à temperatura e cada amostra é medida 3 vezes, em que é tomada a média.
      2. Buffer de
    2. transferir 70 µ l de incubação para a cubeta de 1 cm quadrados. Iniciar a medição.
    3. Retire o tampão a cubeta. Enxágue a cubeta com água destilada e purgar o gás nitrogênio para secar. Repita para todas as amostras. Subtrair as medições de tampão de todas as amostras.
    4. Sinopse a intensidade de fluorescência (u.a.) contra o comprimento de onda (nm). Gravar a intensidade de fluorescência a 370 nm para todas as amostras. Plotar a intensidade de fluorescência a 370 nm (u.a.) contra a concentração correspondente da ANP adicionado (µM).
    5. Ajustar os dados à equação da etapa 2.5.2 para obter a constante de dissociação (K d): Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), onde R 0 é a concentração de dsRNA 2AP-rotulado (1 µM).
      Nota: Aqui Y 0 e B são a mudança inicial e máxima de intensidade de fluorescência em 370 nm, respectivamente. Y é a intensidade de fluorescência a 370 nm a concentração variada de PNA. X é a concentração total de PNA e K d é a constante de dissociação.
    4. ol >

    4. UV-absorvância-detectado térmica experimentos de fusão

    1. de preparação de amostras
      Nota: medir a absorvância UV (260 nm) do RNA a 95 ° C (para certificar-se de que as estruturas secundárias do RNA são rompidas). Calcular a concentração do RNA com a equação:
      figure-protocol-5
      ​ onde c é a concentração, A é a leitura de absorbância obtida, ε é o coeficiente de extinção da sequência de RNA, e l é o comprimento do percurso óptico da cubeta (1 cm). O coeficiente de extinção do RNA é calculado com base em um modelo de vizinho mais próximo usando MeltWin 51 , 52. O pacote de programa pode ser fornecido mediante solicitação.
      1. Remover a quantidade necessária de ssRNA (5 µM) do estoque principal limpa 1,5 ml de tubos. Remover os volumes necessários de alvo PNA (5 µM) do estoque principal e transferência para os tubos de respectivos 1,5 mL que contêm a ssRNA. Secar a mistura de RNA e PNA usando um concentrador a vácuo.
      2. Adicionar 130 µ l de incubação buffer em cada um dos tubos de 1,5 mL e homogeneiza. Submeta a mistura a recozimento: colocar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) durante 10 min. vire fora a alimentação e deixar as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite.
    2. Medição e análise
      1. usar um espectrofotômetro UV-Vis para medir a absorvância a 260 nm, utilizando uma cubeta 8-microcélula com um comprimento de caminho de 1 cm. mede as amostras ' absorvâncias no aumento da temperatura de 15 para 95 ° C, seguido, diminuindo a temperatura de 95 a 15 ° C a uma taxa de rampa de 0,5 ° C/min.
      2. Transferência de 130 µ l da amostra em cada um do bem, certificando-se que um bem contém o tampão de incubação. Inicie a medição. Repita conforme necessário.
      3. Normalizar os valores de absorvância com a alta temperatura normalizada para a unidade de leitura e traçar a absorvância normalizada lendo contra temperatura (° C). Traça a primeira derivada das curvas. Obter as temperaturas de fusão por encaixe as curvas derivadas primeiras para uma função gaussiana.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HPLC de fase reversa permite a purificação de oligômeros PNA. Podemos obter puros oligómeros PNA com duas rodadas de purificação HPLC (Figura 3). A identidade das PNAs pode ser confirmada pela análise de MALDI-TOF (Figura 4).

PÁGINA de non-desnaturação é uma técnica fácil e informativa para caracterizar as afinidades de ligação e especificidades de oligômeros PNA. Normalmente usamos vários ganchos de RNA ou duplex com mutações de único par de base para caracterizar Propriedades de vinculação (Figura 5). Os dados não-desnaturação da página mostrados na Figura 5 claramente sugerem que o Q - e L-modificado PNA pode reconhecer uma região dsRNA com um par de C-G (Figura 5B, painel de fundo) mas não a uma mulher sem um par de C-G (Figura 5B, top painel). Este reconhecimento específico e aprimorado é através do T· A-U, L· G-C e Q· C-G PNA· Formação de base tripla (Figura 1A, C, D) do RNA2 . Vários PNAs com mutações simples ou múltipla também podem ser usados para demonstrar as propriedades de ligação melhorada de um PNA modificado. Mostramos que adicionar 2 mM Mg2 + no buffer de incubação não afeta a ligação significativamente31.

Temos demonstrado por titulação de fluorescência 2-aminopurina que um PNA Q - e L-modificado é vinculado a uma região alvo dsRNA (Figura 6A, 6C, 6D) mas não ssRNA (Figura 6B, 6E, 6F). PNA P3 vincula o dsRNA 2-aminopurina-rotulado com um valor ded Kde 0,8 ± 0,1 µM. A intensidade de fluorescência a 370 nm para a 2-aminopurina-rotulado ssRNA permanece relativamente constante com variada concentração de P3, indicando a falta de vinculação de PNA P3 para o ssRNA.

PNAs contendo show de resíduos (P2 e P3) Q não térmico derretendo transições (Figura 7), sugerindo não vinculativo para o ssRNA. Isto é devido ao impedimento estérico confronto presente em Watson-Crick, como Q-G par. Comparado a P1 de PNA não modificado, PNAs P4 e P5 contendo modificado L resíduos mas sem resíduos Q, mostrar diminuiu temperaturas de fusão para os duplex RNA-PNA correspondentes devido o impedimento estérico confronto presente em Watson-Crick como L-G par. Os dados de fusão térmicos UV-absorvância-detectado são consistentes com os dados de titulação de fluorescência 2-aminopurina, que também mostram que um PNA que contenham resíduos Q e L não se vincula a ssRNA sensivelmente (Figura 6B, 6E, 6F). Incorporando uma base Q é mais desestabilizador do que uma base de L, como uma base Q tem um confronto estérico mais significativo na formação de um par de Watson-Crick-como Q-G (Figura 1-F), em comparação com um par de Watson-Crick-como L-G (Figura 1E ).

figure-results-1
Figura 1 : Estruturas químicas das estruturas de pares de base base estável da tripla e instável. (A-D) Major-sulco PNA· Triplica o RNA2 base de T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) e Q· C-G (D). (E, F) Watson-Crick instável como pares de bases do RNA-PNA de L-G (E) e Q-G (F). A letra R representa a espinha dorsal de açúcar-fosfato do RNA. Ligações de hidrogênio são indicadas por linhas tracejadas pretas. A figura é reproduzida de referência31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2 : Estruturas químicas dos monômeros PNA. Quatro monômeros PNA (T, C, L e Q) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3 : Estrutura química de um oligómero PNA e purificação por RP-HPLC. (A) estrutura química da sequência PNA P3. (B, C) Dados de RP-HPLC de bruto PNA P3 (B) e re-purificado PNA P3 (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4 : Espectro de MALDI-TOF de purificado PNA P3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5 : Prendendor de RNA e sequências PNA e caracterização de ligação por página não-desnaturação. Ganchos de cabelo (A), RNA (rHP1 e rHP2), PNA P3 e um PNA· RNA2 triplex formado entre PNA P3 e rHP2. (B) página de Non-desnaturação (12%) resultados para rHP1 e rHP2 ligação para PNA P3. O buffer de incubação é de 200 mM de NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Os grampos de RNA carregados (rHP1 e rHP2) são de 1 µM em 20 µ l. As concentrações de ANP nas pistas da esquerda para a direita são 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, e 50 µM. PNA P3 não ligar para rHP1 (painel superior) mas vincula a rHP2 (painel inferior). (C) Kd determinação para P3 ligação para rHP2. A fração de formação triplex (Y) foi plotada contra a concentração de PNA. A figura é uma adaptação de referência31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6 : Estudo de titulação de fluorescência de PNA P3 vinculaçãoa 2-aminopurina-rotulado RNAs. O resíduo de 2-aminopurina é designado como '2', na sequência de RNA. O buffer de incubação é de 200 mM de NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (), Um PNA· RNA2 triplex formado entre P3 e um 2-aminopurina-rotulado dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) uma hipotética duplex de PNA-RNA formado entre P3 e um 2-aminopurina-rotulado ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Espectros de emissão de fluorescência para a 2-aminopurina-etiquetados RNA frente e verso (1 µM) e ssRNA (1 µM), respectivamente, com variadas P3 concentração em pH 7,5. O pico em cerca de 475 nm é devido a emissão de fluorescência fraca da base L da ANP. (D, F) K d determinação baseia-se nas parcelas da intensidade de fluorescência 2-aminopurina (a 370 nm) do duplex RNA e ssRNA, respectivamente, contra a concentração de PNA P3. A figura é uma adaptação de referência31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 7 : Thermal derretendo resultados para duplex RNA-PNA. O buffer de incubação é de 200 mM de NaCl, 0.5 mM EDTA, 20mm NaH2PO4, pH 7,5. Todas as amostras contêm 5 µM de single-stranded do RNA (ssRNA1) e PNA em 130 µ l. (A) Single-stranded do RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 e P5) e um hipotético duplex de PNA-RNA formado entre PNA P3 e ssRNA1 em uma orientação paralela. O confronto estérico é indicado para o Watson-Crick como Q-G e L-G pares. (B) fusão curvas para diferentes PNAs ligação a ssRNA1. As temperaturas de fusão são mostradas para as curvas com transições de derretimento. A figura é uma adaptação de referência31.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligómeros PNA de ligação duplex RNA (por exemplo, 10-mers) são moléculas médias e assim pode mostrar mudança de mobilidade electrophoretic mediante vinculação de RNAs com um tamanho comparável ou ligeiramente maior (por exemplo, 50-mer ou menor). Se um RNA é significativamente maior do que a ANP, titulação de PNA em RNA pode não funcionar devido a uma mudança de mobilidade limitada de gel. Assim, o RNA grande pode ser truncado para os ensaios de página não-desnaturação. Titulação de uma grande RNA em um fluoróforo-rotulado PNA permite o acompanhamento da formação triplex por um gel de agarose não-desnaturação com a amostra carregada no meio do gel de40.

Para uma experiência de titulação por página não-desnaturação com uma constante concentração total do RNA, geralmente usamos uma concentração de RNA sem rótulo de 1 µM para post eficiente coloração do RNA livre e bandas triplex por brometo de etídio. Uma concentração de RNA tão baixa quanto 0,2 µM pode também ser suficiente dependendo do RNA construção31. A concentração do RNA sem rótulo (0,2 µM) determina que os valores de Kd que podem ser medidos com precisão devem ser cerca de 0,2 µM ou maior. Outros corantes de coloração podem ser usados para melhorar a eficiência de coloração. Alternativamente, os nossos dados não publicados sugerem que Cy3 tingir-etiquetados RNAs pode ser usado em experimentos de página não-desnaturação para medir os eventos de ligação de apertado.

Devido ao fato de que 2-aminopurina é apenas moderadamente fluorescente, 2-aminopurina titulação de fluorescência também é limitada para a medição da vinculação com valores ded Kpróxima ou acima de 0,2 µM31. O RNA ou o PNA pode ser rotulado com uma tintura relativamente brilhante para quantificar uma ligação relativamente apertado em solução através da titulação de fluorescência, se a vinculação resulta em alterações na fluorescência sinais53,54, 55.

A estratégia de segmentação de estruturas de RNA pela ligação de dsRNA PNAs foi testada por um número limitado de RNAs. É provável que Propriedades de vinculação podem variar para dsRNAs com diferentes composições de sequências e pares de base. Um pode sempre escolher strand de um duplex para a concepção de TFPNAs ricos em purinas. É de fundamental importância compreender como consecutivos Q· C-G triplos podem afetar a estabilidade de um triplex. Mais extensos estudos de sequência dependente claramente são necessários para compreender as propriedades de vinculação dependente da sequência de TFPNAs.

A afinidade obrigatória da TFPNAs pode ser reforçada pelo aumento do comprimento e/ou modificando ainda mais as bases e backbones56,57 de TFPNAs. No entanto, uma região contínua frente e verso pode não muitas vezes consistem em mais de 10 pares de bases consecutivas sem interrupção por estruturas não-Watson-Crick. Um pode conjugar TFPNAs com pequenas moléculas de reconhecimento de não-Watson-Crick estruturas adjacentes às regiões dsRNA. Em princípio, um conjugado de molécula TFPNA-pequeno deverá ter aprimorado vinculação afinidade e especificidade em comparação com um TFPNA ou pequena molécula sozinha. No entanto, as propriedades físicas e químicas do vinculador para a conjugação58,59,60,61,,62,63,64 deve ser otimizado.

O fato de que TFPNAs pode seletivamente ligar a dsRNAs sobre ssRNAs e dsDNAs sugere que é possível desenvolver TFPNAs como sondas químicas muito útil e potenciais terapêuticos ligantes através da regulação da dinâmica estrutural do RNA e interações com proteínas e metabólitos. Absorção celular de TFPNAs pode ser facilitada através da conjugação com penetração celular partes tais como pequenas moléculas, peptídeos e nanopartículas, ou complexação com estruturas supramoleculares como lipossomas5,6 ,12,17,25,31,41,,65,66. Mais functionalization de TFPNAs com bioimaging tags como fluorophores e radioisótopos pode facilitar a detecção, imagem latente e do posicionamento das estruturas funcionais de RNA em organismos vivos.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tem sido apresentado um pedido de patente (PAT/179/14/15/PCT) baseado no trabalho relatado aqui.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pela Singapore Ministério da educação (MOE) nível 1 (RGT3/13 e 15/RG42 para games) e MOE Tier 2 (T2-024-2-MOE2013 e MOE2015-T2-1-028 para games).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Peneiras moleculares, 4A, pellets de 1-2 mm de diâmetro Alfa Aesar87956
(MBHAŸ HCl)Sigma-Aldrich532444
N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)Alfa AesarA11801
Benzotriazol-1-il-oxi)tripirrolidinofosfônio hexafluorofosfato (PyBOP)Alfa AesarB25251
Anhyride acéticoSigma-Aldrich320102
Kaiser Test Kit Sigma-Aldrich60017
Ácido trifluoroacético (TFA)Alfa AesarL06374
Monômeros PNA não modificadosASM Research Chemicals GmbH5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys (Z) -OH / Fmoc-Lys (Boc) -OHSigma-AldrichB8389 / 47624
TioanisolAlfa AesarA14846
1,2-EthanedithiolAlfa AesarL12865
Ácido TrifluorometanossulfônicoAlfa AesarA10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcappped (5 µ m) LiChroCART® 250-4Merck Millipore150838
RNA Oligos Sigma-AldrichPersonalizado 
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA)Sigma-Aldrich39468
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Alfa AesarJ15694
HEPES Lonza17-737E
AcrilamidaSigma-AldrichA8887
N.N'-metilenobisacrilamidaSigma-Aldrich 
Persulfato de amônio (APS)Bio-rad161-0700
Tetrametiletilenodiamina (TEMED)Bio-rad161-0800
10X Tris-Borato-EDTA (TBE) Tampon, pH 8.31ª BaseBUF-3010-10X1L
Glicerol Promega H5433
Brometo de etídio (10 mg/mL)Bio-rad 161-0433
Célula de Alta Precisão (Quartzo Suprasil, 200-2500 nm)Hellma Analytics 105.250-QS
Cloridrato de 4-Metilbenzhidrilamina (146072

References

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