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Artigo de método

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

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DOI:

10.3791/56224

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29 de novembro de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

Neste artigo

Resumo

A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.

Resumo

Elucidar os fatores que direcionam a organização espaço-temporal de evolução tecidos é uma das principais finalidades no estudo do desenvolvimento. Várias proposições afirmam ter sido importantes contribuições para o entendimento das propriedades mecânicas de células e tecidos em sua organização spatiotemporal em diferentes processos de desenvolvimento e morfogenéticas. No entanto, devido à falta de ferramentas confiáveis e acessíveis para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo, validar estas hipóteses tem sido difícil. Aqui nós apresentamos métodos empregando microscopia de força atômica (AFM) e partículas de rastreamento com o objectivo de quantificar as propriedades mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Epiboly é um processo de desenvolvimento precoce conservado cujo estudo é facilitado pela transparência do embrião. Esses métodos são simples de implementar, confiáveis e amplamente aplicável, desde que eles superam intrusivas intervenções que poderiam afetar a mecânica do tecido. Uma estratégia simples foi aplicada para a montagem de amostras, gravação de AFM e injeções de nanopartículas e rastreamento. Esta abordagem faz com que esses métodos facilmente adaptável para outros tempos do desenvolvimento ou organismos.

Introdução

Os princípios físicos subjacentes o controle biomecânico de processos morfogenéticas são largamente indefinidos. Enquanto estudos biomecânicos a nível molecular e celular estão se reunindo considerável impulso, a exploração dos parâmetros biomecânicos no nível do tecido/organismo está em sua infância. Hidrodinâmico regressão1 ou vídeo microscopia de força2 permite aos investigadores distinguir forças ativas e passivas, enquanto o de microcirurgia laser3, ou a menos intrusiva microscopia de força atômica (AFM) de células dissociadas4 ou na vivo 5 ou nanopartículas microrheology6 permitem a antecipação de um tecido propriedades mecânicas e respostas.

AFM é uma técnica topográfica tridimensional com resolução de rugosidade da superfície e conformidade da deflexão de dicas do cantilever em caso de contacto com uma superfície sondado7de alta resolução atômica. Diferentes metodologias empregando AFM foram desenvolvidas para investigar as propriedades da superfície, incluindo medição de atrito, forças de adesão e nas propriedades viscoelásticas de diversos materiais. Recentemente, a AFM tem emergido como uma ferramenta poderosa para recuperar informações sobre as propriedades mecânicas de amostras biológicas. Em particular, AFM não invasiva pode extrair o módulo de cisalhamento complexo de células únicas aplicando recuos oscilatórios com uma ponta de micro ligada a um cantilever de constante flexão conhecido8. Isto permite-nos inferir a resultante de forças. No entanto, AFM não é exclusiva e diferentes metodologias permitem extrair dados reológicos e propriedades mecânicas de células individuais (por exemplo, micropipeta aspiração9, magnético de torção cytometry (MTC)10, ou uniaxial elástica testando a11).

No entanto, a aplicação dessas novas metodologias para processos complexos morfogenéticas não é simples. Os principais desafios enfrentados na determinação das propriedades mecânicas dos tecidos embrionários são os pequenos (µm a mm), macio (no 102 - 10 intervalo de4 Pa) e natureza de visco-elástico (dando origem a fenómenos de tempo-dependente) do material12. Portanto, é importante adaptar os métodos utilizados para a determinação das propriedades mecânicas (rigidez, viscosidade, aderência) para o caso específico de embriões e organismos em desenvolvimento. Duas questões importantes devem ser tomadas em consideração quando analisando reológicas abordagens para estudar o desenvolvimento: para evitar interferência intrusiva e para fornecer fácil acessibilidade. Neste cenário, aspiração micropipeta, MTC e teste de tração apresentam limitações. No primeiro caso, a alta deformação que sofre de uma célula pode alterar suas propriedades fisiológicas e mecânicas9. No segundo caso, a necessidade de aderir firmemente o tecido experimental a um substrato para garantir que as tensões aplicadas deformam o citoesqueleto localmente também poderia apresentar efeitos no estado de ativação das células e, consequentemente, em suas características mecânicas10 . Abordagens de tração uniaxiais, últimas são limitadas pela geometria do desenvolvimento de organismos e acessibilidade11.

AFM parece ser mais adequado para o estudo de processos de desenvolvimento, pois permite o estudo de amostras biológicas diretamente em seu ambiente natural sem qualquer preparação da amostra pesada. Além disso, como a dissociação dos tecidos embrionários é geralmente difícil, o tamanho reduzido das sondas AFM fornece um alto grau de versatilidade com nenhuma limitação na escolha do tipo de meio (aquoso ou aquosos), temperatura da amostra ou produto químico composição da amostra. AFM é versátil o suficiente para ser aplicado a grandes domínios e escalas de tempo e tem sido empregada para recuperar propriedades materiais de tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento ou em condições fisiológicas. Todo nativos tecidos tais como artérias13 ou ossos14 foram estudadas do ponto de vista topográfico e em alguns casos, como a esclera, propriedades mecânicas também foram recuperados15. Topografia também tem sido explorada em embriões ao vivo, permitindo a visualização de, por exemplo, o rearranjo de célula durante a morfogênese em Xenopus16. Protocolos de preparação abrangente, última amostra foram desenvolvidos para determinar parâmetros mecânicos durante os processos de desenvolvimento diferentes. Nanoindentação mapas foram gerados em secções de tecido unfixed nativo para o filhote embrionário do aparelho digestivo,11; propriedades adesivas e mecânicas obtida para células individuais ectoderme, mesoderme e endoderme progenitoras isoladas de gastrulating zebrafish4embriões; realizadas medidas de rigidez para o epiblasto e raia primitiva em explantes de embriões aviários17; e um padrão distinto de gradientes de rigidez definidos diretamente no cérebro embrionário do Xenopus5.

Um salto qualitativo significativo para a aplicação de AFM para explorar o desenvolvimento embrionário pode vir de aproximação simples processos morfogenéticas acessíveis. Zebrafish epiboly é um evento essencial e conservado, em que diferentes tecidos coordenam em um espaço restrito esférico para direcionar a expansão da Drosophila em poucas horas. No início da epiboly zebrafish (fase esférica), uma camada superficial de células, a camada envolvente (EVL), abrange um boné semi-esférico de blastómeros centrada no polo animal do embrião sentado em uma cela sincicial gema maciça. Epiboly consiste a expansão cortical ala vegetal do EVL, as células profundas (DCs) da Drosophila e a camada externa da célula em torno da gema gema sincicial (E-YSL). Epiboly termina com o encerramento do EVL e as DCs no polo vegetal18,19,20. Como e onde as forças são geradas durante a epiboly e como eles são acoplados globalmente ainda não está claro1,21.

Aqui descrevemos detalhadamente como aplicar AFM para inferir Propriedades tecido mecânico passivo durante progressão epiboly a gema de zebrafish celular na vivo. Para isso, usamos pequenas microesferas anexadas a AFM cantilevers como sondas. Isto permite a recuperação de informações locais precisas dentro da superfície de células não-uniforme de gema e estudar gradientes tensionais e sua dinâmica ao longo do tempo. AFM alternativo aproxima-se como aqueles que usam Cunha cantilevers22, will não processar dados local que é suficientemente precisos. A técnica de cunha, que requer habilidades de manipulação muito cuidado para colar um pedaço maior do que o tamanho da amostra no final do cantilever, não é adequada para sondar o embrião (~ 2 dobras maiores que o comprimento do cantilever) mecânica.

Modelagem e caracterizar as propriedades viscoelásticas de células de forma qualitativa e quantitativa permitem uma melhor compreensão da sua biomecânica. Do ponto de vista biomecânico, é essencial para compreender a epiboly e não apenas a demanda conhecimento em medições de tensão cortical e dinâmica, que pode ser extraída por AFM; assim, não há necessidade de informações sobre as propriedades biofísicas do tecido. Para extrair essas informações, uma variedade de técnicas de reologia celular foram desenvolvidos ao longo dos anos para caracterizar os diferentes tipos de células sob diferentes condições fisiológicas23. Eles incluem AFM, MTC e pinças ópticas (OT). Esses métodos, no entanto, têm provados inadequados para mesoscópica análises na escala de embriões ou órgãos. Como alternativa, adaptámos com êxito acompanhamento de nanopartículas microrheology6 para medições reológicas na vivo . Esta técnica analisa os deslocamentos browniano das partículas isoladas e infere Propriedades micromecânicas local.

Junto microrheology AFM e nanopartículas permite a definição de dinâmica tensional cortical e propriedades mecânicas internas da gema durante epiboly. Esta informação apoia plenamente um modelo no qual anisotrópica stress desenvolve-se em consequência as diferenças na resposta de deformação do EVL e a camada citoplasmática de gema (YCL) para a contração isotrópica actomyosin do córtex E YSL é essencial para o movimento líquido direcional da EVL e epiboly progressão1.

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Protocolo

Todas as etapas do protocolo descritas abaixo sigam as orientações de cuidados com animais de nossas instituições.

1. Zebrafish cultura

  1. Criar e manter zebrafish adulto em condições normais.
    Nota: AB e TL tipo selvagem embriões foram utilizados para este estudo.
  2. Coletar embriões e cultivá-las a 28,5 ° C na E3 embrião médio24. Estágio-los de acordo com a morfologia como descrito anteriormente,19.

2. microscopia de força atômica

  1. Manualmente dechorionate encenado zebrafish embriões (de diferentes idades, de acordo com os interesses individuais). Remova chorions com dois pinça fina e afiada (ver Tabela de materiais).
    1. Segure o córion usando uma pinça e tornar uma lágrima com a outra pinça. Em seguida, segurando o córion numa região oposta do rasgo, empurre o embrião suavemente através da abertura.
    2. Execute o dechorionation sob um estereomicroscópio dissecação com uma escala ajustável de ampliação entre 8x e 50 X.
  2. Montar os embriões para AFM
    1. Preparar uma solução de agarose 2% no meio do embrião e encher um prato de Petri 35mm com isto. Deixe solidificar. Faça pequenos furos de 1,5 mm de diâmetro (duas vezes o tamanho do embrião) e profundidade de aproximadamente 350 µm (metade do embrião tamanho) com pinça fina na cama do agarose.
    2. Coloque os embriões no pokes feito na camada de agarose e garantir que eles estão no lugar, espalhando em torno de uma solução de 0,5% de baixa fusão agarose no meio do embrião. Despeje esta solução em torno de apenas os embriões para fixá-los nos buracos.
    3. Antes que a agarose de baixo ponto de fusão que se solidifica à temperatura ambiente, gire os embriões de tal forma que a região de interesse a ser sondada por AFM enfrentará para cima (figura 1A).
  3. Examinar os embriões por AFM
    1. Localize e os embriões no prato de petri empregando um objectivo X 20 em um microscópio de força atômica invertida da imagem (consulte a Tabela de materiais25) à temperatura ambiente (23-24 ° C).
      Nota: Os embriões são mantidos vivos imerso no meio do embrião e anexada à sua cama de agarose.
    2. Sonda de superfície celular de gema de embriões fundidas empregando esferas de poliestireno esféricas de 4,5 µm de diâmetro conectado a um cantilever com uma constante de mola nominal de 0,01 N/m. definir a amplitude pico-a-pico de oscilação do cantilever para 5 µm e sua frequência de 1 Hz.
    3. Colete dados para cada região a ser testado em posições diferentes e em vários embriões, como uma rotina, para uma média de dados.
      Nota: Um bom ponto de partida é a sonda de 5 posições, localizadas no meio e nos cantos de um quadrado de µm 10 µm x 10 controlando a posição do cantilever com os XY piezo-atuadores do microscópio AFM. Coleção de imagens e dados levou cerca de 20 min por embrião. Gravação de dados em diferentes regiões da superfície da célula de gema do embrião, por exemplo, o polo vegetal ou diferentes regiões próximas a margem de células EVL (figura 1B e 1C), só pode ser feito empregando distintas espécimes orientadas de forma diferente.
  4. Calcular as forças
    1. Medir o deslocamento vertical do cantilever AFM (z) com sensores de Extensômetro acoplados ao piezo-atuadores e sua deflexão (d) usando um fotodíodo quadrante pelo método óptico de alavanca com o software de controle de microscópio (ver Tabela de materiais 25).
    2. Use a inclinação de uma curva de d-z obtida a partir de dados coletados de uma região nua de uma lamela de vidro para calibrar a correlação entre o sinal do fotodiodo e a deflexão do cantilever (d).
      Nota: O deslocamento vertical medido é igual a deflexão do cantilever e a inclinação representa a sensibilidade de deflexão da alavanca óptica26.
    3. Inferi que a constante de mola do cantilever (k) das flutuações térmicas conforme descrito anteriormente27.
    4. Calcule o recuo da amostra (h) como:
      h = (z - zc) -(d - dfora)          (1)
      Nota: Aqui zc é a posição do ponto de contacto e dfora é o deslocamento do fotodiodo.
    5. Calcule a força (F) no cantilever como:
      F = k · d (2)
  5. Calcule a tensão do córtex em termos de um modelo de balão de líquido consistindo de uma camada elástica de tensão cortical Tc encerram um líquido viscoso. Neste modelo, para recuos pequenos (em comparação com o tamanho do embrião), força aumenta proporcionalmente4,28 , como:
    F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
    Nota: Aqui nb R é o raio da esfera e ne R é o raio do embrião. Para o embrião do zebrafish, como o raio do embrião (400 µm) é duas ordens de magnitude maiores do que o grânulo (2.25 µm), esta equação pode ser aproximada como:
    F = 4π Tc h (4)
    1. Calcular o força de tensão-recuo (F-h) curvas em cada região de célula de gema do embrião por cinco diferentes apontam as medições.
    2. Calcule o Tc para cada F-h curva por não-linear menos-quadrados encaixe. Para análise estatística, a tensão cortical Tc calculado deve ser em média dos diferentes F-h curvas.
  6. Medir as propriedades viscoelásticas (reologia) do córtex através da aplicação de baixa amplitude (100 nm) oscilações de multifrequência durante AFM é composto por ondas senoidais de diferentes frequências de25.
    1. Calcule um módulo eficaz de complexo g*(ƒ) no domínio da frequência de curvas de recuo de força, como:
      g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
      aqui é a unidade imaginária e F(f) e h(f) são os espectros de frequência (f) da força e recuo. b é a correção para o arrasto viscoso em cantilever extraído as oscilações aplicadas na superfície.
    2. Separado g*(ƒ) em partes reais e imaginárias, como:
      g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f)          (6)
      em > g'(f) é o módulo de elasticidade e é uma medida da energia elástica armazenada e recuperada por ciclo de oscilação. g' (f) é o módulo viscoso que contabiliza a energia dissipada.
    3. Calcular a tangente de perda, que fornece um índice de como o sólido (< 1) ou líquido-como (> 1) comportamento do material, como:
      g' (f) / g' (f)          (7)
      Nota: Com este tipo de medida, é possível extrair parâmetros indicando como viscoso e elástico como é o material sondado. Embora b ligeiramente depende da distância da extremidade do cantilever à superfície, dado os valores muito baixos de g´´ exibido pela gema de célula (ver Figura 2D abaixo), pequenas variações no b têm um impacto insignificante as medições de29.

3. partícula rastreamento Microrheology

  1. Executar a microinjeção de partículas na célula de gema
    1. Fabrica sob medidas microagulhas usando um extrator de micropipeta horizontal e vidro de borosilicato capilar (ver Tabela de materiais).
      1. Preparar microagulhas que têm um diâmetro externo de 1,00 mm, diâmetro interno de 0,58 mm e um comprimento de 10 cm, usando as configurações do extrator: pressão: 500; Calor: 510; Tração: 65; Velocidade: 25; Tempo: 50.
    2. Prepare uma placa de Petri de injeção através da criação de faixas de recuo em linha reta em um agarose a 1% na cama médio de embrião empregando moldes feitos feitos sob encomenda (consulte a Tabela de materiais).
      1. Vire os moldes e colocá-los em cima do gel do agarose líquido e remover os moldes, uma vez que o gel tem solidificado. Pipete os embriões nas ranhuras feitas pelo molde no agarose sob um estereomicroscópio dissecação 1.2 ampliação de X.
        Nota: A largura e o projeto dos moldes permitem que os embriões alinhar o Self.
    3. Antes da injeção, remova quase completamente o meio para facilitar a injeção (a tensão de superfície impede que o embrião/córion degola para a agulha quando removê-lo após a injeção).
    4. Microinjeção de nanopartículas fluorescentes (raio um = 100 nm, consulte Tabela de materiais) diluído em água (1:1, 000) na parte vegetal da célula de gema embrião (Figura 3A).
    5. Ajustar a micropipeta com Micromanipuladores precisão e injetar os grânulos com um microinjector automático com controles de tempo e pressão (ver Tabela de materiais). Ajustar a pressão entre 10 e 20 libras por polegada quadrada.
    6. Antes de injectar a solução do grânulo, calibrar o volume para injetar (0,5 nL) medindo o tamanho das gotas, entregue pelo microinjector com um micrômetro de fase 1 x 0.01 mm (ver a Tabela de materiais).
    7. Emprega uma magnificação de 1.6 X no dissecação estereomicroscópio Visualizar os embriões durante as injeções, que são realizadas à temperatura ambiente.
  2. Avaliar o comportamento viscoelástico da gema gravando flutuações térmicas
    1. Dechorionate os embriões microinjected como no passo 2.1 e incorporá-los em uma baixa de 0,5% de fusão ponto de agarose em solução médio de embrião a 30 ° C. Em seguida, transferi-los para placas de fundo de vidro (veja a Tabela de materiais) e orientar e empurrá-los para a lamela, quando a agarose é ainda líquido.
      Nota: Quando a agarose solidifica à temperatura ambiente, os embriões estão prontos para ser fotografada.
    2. Coloque os embriões montados nas placas de vidro de fundo no palco de um microscópio confocal invertido 2 h após microinjeção. Capturar imagens das nanopartículas para 26 s a uma taxa de amostragem de 25 Hz com um objetivo X 63 à temperatura ambiente em um microscópio confocal invertido empregando o software microscópio padrão comercial (tamanho de pixel = 166 nm, imagens capturadas a cada 40 ms).
    3. Calcular a posição dos centroides das partículas a e definir suas trajetórias ao longo do tempo com o plugin TrackMate do open source software ImageJ (Figura 3B).
    4. Calcule o deslocamento de Mean Square bidimensional (MSD) de cada partícula com software feito por6,30 , como:
      < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8)
      Nota: Aqui t é o tempo decorrido e o intervalo de tempo. Em um líquido viscoso puro, a MSD aumenta inversamente com viscosidade (ν), de acordo com a relação de Stokes-Einstein:
      < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9)
      onde T é a temperatura absoluta.

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Resultados

Medições de tensão cortical
Para cada ponto de medição, cinco curvas força-deslocamento (F-z) foram adquiridas pela AFM pela rampa cantilever com uma amplitude de pico-a-pico de 5 µm a 1 Hz (velocidade = 10 µm/s) até um recuo máximo de ~ 2 µm. Este procedimento estava a menos de 20 min e não foi afectado pela progressão epiboly. Cada condição experimental foi testada pelo menos 5 embriões.

As curvas de força-...

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Discussão

Aqui nós mostramos que as propriedades do material e alguns parâmetros biomecânicos da célula de gema zebrafish durante epiboly podem ser facilmente estimados pela AFM e nanopartículas microrheology.

Enquanto a AFM tem sido empregada para recuperar características reológicas de células e tecidos em condições fisiológicas,4,5,25,28, aqui nós desenvolvemos um protocolo...

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Divulgações

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille para participar na criação de base para estes protocolos. Agradecemos também a plataforma de imagem Molecular do IBMB-PCB, Xavier Esteban e membros do laboratório de apoio contínuo. O programa de grupos consolidados da Generalitat de Catalunya e DGI e consolidar subsídios do Ministério da economia e competitividade da Espanha para EMB e DN apoiou este trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio óptico invertidoNikonTE2000Visualização da amostra e do cantilever AFM Microscópio de
força atômica (AFM)Custom made-Anycomercializado AFM poderia ser empregado
Microscópio confocal invertidoZeissLSM780Coleção de dados de nanoreologia
Agarose D1 Baixo EEOConda8016.00Embriões de
fundiçãoLMP Agarose ultrapura (baixo ponto de fusão)Invitrogen16520-100Fixação de embriões
Zebrafish Microinjeção e Transplante Moldes WorldPrecision InstrumentsZ-MOLDSFundição de embriões. Feito sob medida com as dimensões originais também pode ser empregado
Dumont 5 FórcepsFST11251-201,5 mm de diâmetro
Si3N4 cantileverNovascanPT. GSMedição do embrião por AFM. Ponta esférica: 4,5 µ m de diâmetro e k=0,01 N/m
Nanopartículas fluorescentesLife TechnologiesFluoSpheres F8811,para rastreamento de nanorreologia
Extrator de micropipetasSutter InstrumentsP-2000Fabricação de microagulhas sob medida
Vidro capilar de borossilicatoWarner InstrumentsG100TF-4Fabricação de microagulhas sob medida
MicromanipuladorNarishigeMN-153Manipulação da micropipeta
MicroinjetorEppendorfFemtoJet ExpressControle do tempo e da pressão da injeção
EstereomicroscópioLeicaDFC365FXVisualização dos embriões durante a injeção
Software de análiseMathWorksMatlabAnálise de dados de AFM e rastreamento de partículas
ZebrafishAB e TL tipo selvagem- Cepas empregadas para coleta de embriões
Placas de fundo de vidroMat TekP35G-0.170-14-CMontagem de embriões para coleta de dados de nanorreologia
Micrômetro de estágioFST29025-02Medição do volume de injeção

Referências

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Reimpressões e permissões

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