A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.
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Artigo de método
AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema
Neste artigo
Resumo
Resumo
Elucidar os fatores que direcionam a organização espaço-temporal de evolução tecidos é uma das principais finalidades no estudo do desenvolvimento. Várias proposições afirmam ter sido importantes contribuições para o entendimento das propriedades mecânicas de células e tecidos em sua organização spatiotemporal em diferentes processos de desenvolvimento e morfogenéticas. No entanto, devido à falta de ferramentas confiáveis e acessíveis para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo, validar estas hipóteses tem sido difícil. Aqui nós apresentamos métodos empregando microscopia de força atômica (AFM) e partículas de rastreamento com o objectivo de quantificar as propriedades mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Epiboly é um processo de desenvolvimento precoce conservado cujo estudo é facilitado pela transparência do embrião. Esses métodos são simples de implementar, confiáveis e amplamente aplicável, desde que eles superam intrusivas intervenções que poderiam afetar a mecânica do tecido. Uma estratégia simples foi aplicada para a montagem de amostras, gravação de AFM e injeções de nanopartículas e rastreamento. Esta abordagem faz com que esses métodos facilmente adaptável para outros tempos do desenvolvimento ou organismos.
Introdução
Os princípios físicos subjacentes o controle biomecânico de processos morfogenéticas são largamente indefinidos. Enquanto estudos biomecânicos a nível molecular e celular estão se reunindo considerável impulso, a exploração dos parâmetros biomecânicos no nível do tecido/organismo está em sua infância. Hidrodinâmico regressão1 ou vídeo microscopia de força2 permite aos investigadores distinguir forças ativas e passivas, enquanto o de microcirurgia laser3, ou a menos intrusiva microscopia de força atômica (AFM) de células dissociadas4 ou na vivo 5
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Protocolo
Todas as etapas do protocolo descritas abaixo sigam as orientações de cuidados com animais de nossas instituições.
1. Zebrafish cultura
- Criar e manter zebrafish adulto em condições normais.
Nota: AB e TL tipo selvagem embriões foram utilizados para este estudo. - Coletar embriões e cultivá-las a 28,5 ° C na E3 embrião médio24. Estágio-los de acordo com a morfologia como descrito anteriormente,19.
2. microscopia de força atômica
- Manualmente dechorionate encenado zebrafish embriões (de diferentes idades, de acordo com os interesses....
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Resultados
Medições de tensão cortical
Para cada ponto de medição, cinco curvas força-deslocamento (F-z) foram adquiridas pela AFM pela rampa cantilever com uma amplitude de pico-a-pico de 5 µm a 1 Hz (velocidade = 10 µm/s) até um recuo máximo de ~ 2 µm. Este procedimento estava a menos de 20 min e não foi afectado pela progressão epiboly. Cada condição experimental foi testada pelo menos 5 embriões.
As curvas de força-.......
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Discussão
Aqui nós mostramos que as propriedades do material e alguns parâmetros biomecânicos da célula de gema zebrafish durante epiboly podem ser facilmente estimados pela AFM e nanopartículas microrheology.
Enquanto a AFM tem sido empregada para recuperar características reológicas de células e tecidos em condições fisiológicas,4,5,25,28, aqui nós desenvolvemos um protocolo.......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille para participar na criação de base para estes protocolos. Agradecemos também a plataforma de imagem Molecular do IBMB-PCB, Xavier Esteban e membros do laboratório de apoio contínuo. O programa de grupos consolidados da Generalitat de Catalunya e DGI e consolidar subsídios do Ministério da economia e competitividade da Espanha para EMB e DN apoiou este trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio óptico invertido | Nikon | TE2000 | Visualização da amostra e do cantilever AFM Microscópio de |
| força atômica (AFM) | Custom made-Any | comercializado AFM poderia ser empregado | |
| Microscópio confocal invertido | Zeiss | LSM780 | Coleção de dados de nanoreologia |
| Agarose D1 Baixo EEO | Conda | 8016.00 | Embriões de |
| fundiçãoLMP Agarose ultrapura (baixo ponto de fusão) | Invitrogen | 16520-100 | Fixação de embriões |
| Zebrafish Microinjeção e Transplante Moldes World | Precision Instruments | Z-MOLDS | Fundição de embriões. Feito sob medida com as dimensões originais também pode ser empregado |
| Dumont 5 Fórceps | FST | 11251-20 | 1,5 mm de diâmetro |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT. GS | Medição do embrião por AFM. Ponta esférica: 4,5 µ m de diâmetro e k=0,01 N/m |
| Nanopartículas fluorescentes | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | para rastreamento de nanorreologia |
| Extrator de micropipetas | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricação de microagulhas sob medida |
| Vidro capilar de borossilicato | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricação de microagulhas sob medida |
| Micromanipulador | Narishige | MN-153 | Manipulação da micropipeta |
| Microinjetor | Eppendorf | FemtoJet Express | Controle do tempo e da pressão da injeção |
| Estereomicroscópio | Leica | DFC365FX | Visualização dos embriões durante a injeção |
| Software de análise | MathWorks | Matlab | Análise de dados de AFM e rastreamento de partículas |
| Zebrafish | AB e TL tipo selvagem | - | Cepas empregadas para coleta de embriões |
| Placas de fundo de vidro | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Montagem de embriões para coleta de dados de nanorreologia |
| Micrômetro de estágio | FST | 29025-02 | Medição do volume de injeção |
Referências
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc....
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Reimpressões e permissões
