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Artigo de método

Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

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DOI:

10.3791/56226

⸱

10 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando RNA-seq para monitorar os níveis do mRNA ao longo do tempo durante a hipoxia resposta das células de S. cerevisiae . Esse método pode ser adaptado para analisar a expressão gênica durante qualquer resposta celular.

Resumo

Complexas mudanças na expressão gênica tipicamente mediam uma grande parcela de uma resposta celular. Cada gene pode alterar a expressão com cinética original como o gene é regulamentado pelo sincronismo particular de um dos muitos estímulos, sinalização de percursos ou efeitos secundários. A fim de capturar o gene todo resposta de expressão à hipoxia em levedura S. cerevisiae, análise de RNA-seq foi usada para monitorizar os níveis de mRNA de genes todos em horários específicos, após a exposição à hipoxia. Hipóxia foi estabelecida pelo crescimento de células de gás de2 ~ 100% N. Importante, ao contrário de outros estudos hipóxicos, ergosterol e ácidos graxos insaturados não foram adicionados para a mídia porque estes metabólitos afetam a expressão genética. Pontos de tempo foram escolhidos na faixa de 0 - 4 h após hipoxia porque esse período captura as grandes mudanças na expressão gênica. Em cada ponto de tempo, mid log hipóxicos células foram rapidamente filtrada e congelado, limitar a exposição ao2 e concomitante as mudanças na expressão gênica. O RNA total foi extraído de células e usado para enriquecer para mRNA, que depois foi convertido em cDNA. A partir deste cDNA, multiplex bibliotecas foram criadas e oito ou mais amostras foram sequenciadas em uma pista de um sequenciador de última geração. Um pipeline pós-sequenciamento é descrito, que inclui o aparamento de base de qualidade, ler o mapeamento e determinar o número de leituras por gene. DESeq2 dentro do ambiente de estatística R foi usado para identificar genes que alteram significativamente em qualquer um dos pontos de tempo hipóxica. A análise de três réplicas biológicas revelou grande reprodutibilidade, genes da cinética diferente e um grande número de esperado O2-regulado genes. Esses métodos podem ser usados para estudar como as células de vários organismos respondem à hipoxia ao longo do tempo e adaptados para estudar a expressão gênica durante outras respostas celulares.

Introdução

Muitos organismos respondem a hipoxia, ou O baixo2, alterando a expressão de gene a 1,2,3. Esta resposta ajuda a lidar com a falta de um substrato fundamental para a respiração aeróbia e para diversas reações biossintéticas, mas também com uma mudança de estado redox 4células. Vários estudos de microarray, realizados em S. cerevisiae mostram que os níveis de RNAm de centenas de genes mudam em resposta a hipóxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq era usado para caracterizar as mudanças de expressão do gene ao longo do tempo durante a hipóxia 13. Aqui, os detalhes experimentais são apresentados e discutidos.

Hipóxia pode ser conseguida de várias maneiras, cada uma produzindo um nível diferente de O2. Aqui, hipóxia foi estabelecida por continuamente fluindo ultra-alta-pureza N2 balões, que reduz a [O2] imediatamente dissolvido com cinética reprodutíveis 10. É possível que há algumas2 moléculas O presentes que contribuem para a expressão de gene e metabolismo, mas este ambiente é considerado muito perto anaeróbica. Na ausência de O2, as células de levedura não heme biossintetize, ergosterol e ácidos graxos insaturados 4,12,14. Assim, estudos anteriores incluíram estes metabólitos quando crescer o fermento sem oxigênio 5,10,15. No entanto, muitas respostas hipóxicos são mediadas por esgotamento destes metabolitos e assim reabastecer os inverte o gene hipóxica expressão respostas 12,16. Para imitar a hipóxia natural, estes metabólitos não foram adicionados aos meios de comunicação. No pouco tempo que as células foram expostas a hipóxia sem a presença desses metabólitos essenciais, não havia nenhum aumento perceptível na morte celular (dados não mostrados) nem uma resposta de estresse prolongado 13.

A resposta também é dependente da cepa e o seu genótipo. Especialmente importantes são os alelos dos reguladores conhecidos do hipóxica respostas 2. O fundo de tensão S288C é altamente desejado para que os resultados podem ser comparados a outros estudos genômicos realizados com esta estirpe. No entanto, o S288C contém um alelo de perda-de-função parcial do HAP1 gene 17, um regulador transcricional crítico para a resposta a hipoxia. Este alelo foi reparado em S288C utilizando uma sua cópia do Σ1278b Coe fundo 11.

Expressão gênica é altamente dependente do ambiente celular. Assim, ao realizar a análise do mRNA de todo o genoma, é importante manter um ambiente de constante ao mesmo tempo variando de outro parâmetro como tempo, estímulo ou genótipo. Para alcançar resultados altamente reprodutíveis, considere estas três práticas para o estudo e todas suas réplicas biológicas ou técnicas. Em primeiro lugar, a mesma experimenter(s) deve realizar o estudo, desde que as práticas técnicas podem variar entre experimentadores. Em segundo lugar, o mesmo lote dos ingredientes deve ser usado nos meios de comunicação de crescimento como cada lote tem uma composição ligeiramente diferente que pode afetar a expressão do gene. Em terceiro lugar, para minimizar os efeitos do ciclo celular, cada ponto de tempo deve consistir de células assíncronas na fase log de média de crescimento (1-2 x 107 células/mL).

Quando caracterizando uma resposta complexa como a expressão de gene resposta à hipoxia, um curso de tempo é vantajoso para determinar a cinética de diversos eventos. Pontos de tempo específico devem ser escolhidos que irá capturar as principais alterações da resposta. Neste estudo, foram observados pontos de tempo entre 0 e 4 h, porque experiências passadas revelaram generalizadas alterações na expressão gênica durante este período 13.

Para medir a expressão gênica global, RNA-seq foi usado 18,19. Este método usa o sequenciamento de última geração para determinar a abundância relativa de transcrição do gene cada. Em comparação com análise de microarray de DNA, RNA-seq apresenta maior sensibilidade (para detectar menos abundantes transcrições), uma maior gama dinâmica (para medir alterações maiores de dobra) e reprodutibilidade superior (para seguir com precisão a expressão gênica ao longo do tempo). Normalmente, o RNA celular mais é RNA ribossomal, que muitos métodos têm sido desenvolvidos para enriquecer específicas do RNA espécie 20. Aqui, grânulos de poli-T foram utilizados para purificar A poli-contendo transcrições de mRNA, embora os diversos comercialmente - disponíveis kits de depleção de rRNA podem também ser eficazes no enriquecimento do mRNA.

Caracterizou-se aqui, a resposta de expressão do gene de S. cerevisiae à hipoxia. As células foram expostas à hipoxia e então amostradas em oito pontos de tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Para confirmar a reprodutibilidade e identificar estatisticamente alteradas transcrições, realizaram-se três repetições biológicas. RNA foi extraído por ruptura mecânica e purificação da coluna e processado para análise de RNA-seq. Pós-sequenciamento pipeline é descrito e scripts de programação são fornecidos que permitem a replicação exata das análises realizadas. Especificamente, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, o ambiente estatístico R 24e o pacote de DESeq2 25 foram usados para processar os dados de RNA-seq e identificar 607 genes que mudam significativamente durante hipóxia. Análise de componentes principais (PCA) e expressão gênica das repetições indicaram a reprodutibilidade da técnica. Clustering e heatmaps revelou cinética de expressão abrangente, enquanto a análise do gene ontology (GO) mostrou que muitos processos celulares, como a respiração aeróbia, são enriquecidos no conjunto de genes regulados de oxigênio.

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Protocolo

1. indução de hipóxia

  1. Um dia ou mais antes do curso do tempo de hipoxia: preparar a incubadora, célula de filtragem sistema, vácuo, tanque de gasolina, balões, rolhas, tubos de vidro e tubos, como a Tabela de materiais.
  2. Coloque o tanque de2 N, incubadora, sistema de vácuo e filtragem nas proximidades, para permitir o processamento rápido das células.
  3. Prepare a mídia YPD líquida estéril (1% de extracto de levedura, peptona de 2%, 2% de glicose) misturando os componentes em um frasco de vidro e autoclave.
  4. Planeje o layout dos balões na incubadora.
    Nota: O tanque de2 N, o primeiro balão será uma armadilha de água, o segundo frasco será o último ponto de tempo, o terceiro frasco será o tempo do segundo para o último ponto e assim por diante até o último frasco que é uma armadilha de água final. A Figura 1 mostra a ordem e as conexões entre os frascos.
  5. O dia antes do curso do tempo, inocule uma colônia de levedura em uma cultura de 5 mL de YPD líquido dentro de um tubo de ensaio estéril. Especificamente, pega uma colônia cheia de uma placa utilizando uma ansa esterilizada. Coloque o stick no líquido YPD e apertar o pau até que a maioria das células em suspensão.
  6. Gire os tubos a 30 ° C durante a noite (~ 16 h).
    Nota: Após 16 h, sua células vão atingir saturação (~ 2 x 108 células/mL), indicada por uma cultura muito nublada. Outras cepas podem levar mais tempo para atingir a saturação e devem ser testadas por medir a concentração de células com um espectrofotômetro, conforme indicado no passo 1.9.4.
  7. No dia do curso de tempo, depois de 16 h de incubação, diluir a cultura saturada 01:50, usando uma pipeta de 5 mL para colocar 4 mL de pernoite cultura em 196 mL de YPD líquido dentro de um frasco estéril 500 mL. Crescer com agitação a ~ 200 rpm por 4 h a 30 ° C.
    Nota: Após 4 h, a sua cultura vai chegar a uma concentração de registro médio de ~ 1-2 x 107 células/mL.
  8. Durante a incubação de 4 h, Rotule os frascos (para armadilhas de hipóxia e água) e os 50 mL tubos de colheita. Se a incubadora na etapa 1.7 acima não é usada para o curso de tempo de hipóxia, ligue a outra incubadora e definir a 30 ° C.
  9. Antes de submeter as células a hipóxia:
    1. Adicione ~ 50 mL de água para dois dos frascos 250ml estéril que servirão as armadilhas de água.
    2. Encha 1/3 de um gelo balde com nitrogênio líquido e mergulhe um rack de espuma de poliestireno para segurar tubos de centrífuga de 50 mL.
    3. Configure o sistema de filtro para a coleta de células. Adicione um disco de filtro estéril para a unidade inferior do sistema de filtração, usando uma pinça estéril, tendo o cuidado de só tocar as bordas do disco filtro. Coloque a unidade de filtro superior na unidade inferior do filtro e prenda com os grampos fornecidos com o sistema. Certifique-se de que as unidades inferior e superior são alinhadas para que haja um selo apertado e nenhum escapamento.
    4. Medir a concentração de células com um espectrofotômetro. Dilua as células para que eles podem ser medidos na escala linear do espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0.6, dependendo do espectrofotómetro.
      Nota: Uma unidade de600 OD é ~ 3 x 107 células/mL, dependendo da morfologia celular e Espectrofotômetro. Espera-se uma concentração de 1 ~ 2 x 107 células/mL, correspondente a OD600 de ~0.33 - 0,66.
    5. Rapidamente obter a amostra de tempo 0.
      1. Ligue o sistema de filtro à vácuo forte (~ 10 mbar) através de tubos de vácuo e uma armadilha do frasco de 1.000 mL. Ligue o aspirador. Despeje a unidade superior da cultura (normalmente ~ 20 mL) e esperar para o líquido ser puxado através do filtro (~ 10 s, dependendo da força do vácuo).
      2. Com cuidado, retire o disco do filtro com uma pinça limpa e coloque em um tubo de centrífuga de 50 mL. Imediatamente, coloque o tubo de centrifugação dentro do rack mergulhado em nitrogênio líquido. Importante, não pre-chill os tubos antes de inserir o filtro vão explodir os tubos.
      3. Depois > 30 s, lugar o tubo em um freezer-80 ° C para posterior extração do RNA. Após cada filtração, limpar e remontar o sistema de filtro. Enxaguar o sistema, puxando a água de 10 s sem um disco de filtro. Finalmente, seque o sistema com uma toalha de papel.
    6. Dilua a cultura de 4h em frascos diferentes para os vários pontos de tempo, para que cada balão atinge concentração log médio (~ 1-2 x 107 células/mL) no ponto indicado tempo de hipóxia.
      Nota: A tabela 1 mostra as diluições que foram usadas para a tensão de haploides selvagem-tipo S288C HAP1+ . É aconselhável testar cada estirpe nestas condições de cultura hipóxica e ajustar de acordo com as diluições.
    7. Uma vez que as células e mídia é adicionada para frascos, substitua a folha de alumínio cobrindo o balão abrindo com uma rolha contendo dois tubos de vidro inseridos.
    8. Coloca os frascos na incubadora no layout determinado anteriormente.
    9. Conecte firmemente o tubo conforme mostrado na Figura 1.
    10. Verifica que todas as rolhas são firmemente empurradas para as aberturas de balão.
  10. No tempo 0, abra a válvula do regulador. Em seguida, defina o medidor de fluxo de 3 L/min.
    Nota: Bubbling será observado em ambos os balões de água, indicando o fluxo adequado de gás. Se isso não for o caso, verifique se todas as rolhas são apertadas e tubulação está bem colocada.
  11. Fechar a incubadora e definir a velocidade de agitação para ~ 200 rpm. Inicie um timer.
  12. Cada ponto de tempo, antes de configurar o sistema de filtro como descrevo acima na etapa 1.9.3.
  13. Em cada ponto de tempo (por exemplo, 5 min, 10 min, etc.), tem duas pessoas processar rapidamente as células da seguinte forma:
    1. Primeira pessoa: Remova o frasco apropriado do suporte e retire o bujão (com tubos de vidro ligados).
      Nota: Isto não vai quebrar o fluxo de N2 a qualquer dos restantes frascos cultura mas quebrará temporariamente o fluxo para a última armadilha de água.
    2. Segunda pessoa: Pipetar 1 mL da cultura e dispense em uma cubeta. Reconecte o tubo do frasco de cultura que é agora no fim da linha para a última armadilha de água (um tubo e uma rolha vai ser eliminada durante o processo.). Em seguida, medir a concentração de células na cubeta, conforme descrito acima na etapa 1.9.4.
    3. Primeira pessoa: Despeje o restante da cultura o sistema de filtragem de vácuo e em seguida, executar a filtragem e congelamento conforme descrito acima na etapa 1.9.5.
  14. Quando acabar com todos os pontos de tempo, desligue o gás de2 N. Primeiro fechar o regulador e esperar que a pressão liberar e depois desligar o medidor de fluxo. Finalmente, desmontar o sistema e limpar todos os materiais com água e em seguida etanol 70%.

2. extração do RNA

  1. Prepare o tampão RLT para purificação de RNA coluna, conforme descrito na Tabela de materiais.
  2. Preparar uma solução de trabalho de DNase, adicionando 10 µ l da solução estoque de DNase a 70 µ l de tampão RDD por amostra (ver Tabela de materiais).
  3. Retirar os tubos de 50 mL contendo filtros e células do freezer-80 ° C e colocar no gelo a derreter (~ 15 min). Execute as seguintes etapas com tubos no gelo.
  4. Rotular mL 2 tubos de tampa de rosca e coloque-os em gelo, um tubo para cada amostra. Adicione ~0.6 mL de grânulos ácido lavado a cada tubo, usando um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para colher e medir os grânulos.
  5. Adicione 0,6 mL de tampão RLT frio para os tubos de 50 mL.
  6. Pipetar acima e para baixo para remover células de filtro e suspender em solução. Evite deixar o filtro permanecem na solução, como o filtro irá absorver a solução. Remover toda solução absorvido o filtro usando a ponta da pipeta para apertar o filtro contra a parede do tubo.
  7. Transferi todo o líquido do tubo de 50 mL para os tubos de tampa de rosca contendo grânulos.
  8. Coloque os tubos de tampa de rosca em um homogeneizador de moinho do grânulo e concorrer a um min.
    Imediatamente, coloque os tubos no gelo durante três minutos. Novamente, coloque os tubos para o homogeneizador e concorrer a um min.
  9. Retire os tubos do homogenizador e lugar no gelo por 5 min. As contas vão resolver para o fundo do tubo.
  10. Execute o restante das etapas à temperatura ambiente.
  11. Com uma pipeta, transferir somente o lisado (~ 350 µ l), evitando os grânulos, para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
  12. Microcentrifuga por 2 min em velocidade máxima e a transferência então o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
  13. Adicione 1 volume de etanol a 70% (feito de etanol de grau biologia molecular prova 200). Misture bem por pipetagem.
  14. Transferir a solução e qualquer precipitado para uma coluna de RNA que foi colocada dentro de um tubo de coleta de 2 mL.
  15. Centrifugar por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento (o líquido no tubo).
  16. Adicione 350 µ l de tampão RW1 à coluna. Centrifugar por 15 s em ≥12, 000g x e descarte o escoamento.
  17. Adicione 80 µ l DNase mistura de incubação para a membrana de coluna (não ficar nos lados do tubo) e deixe para descansar por 15 min.
  18. Adicione 350 µ l de tampão RW1 a coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento.
  19. Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte de passagem.
  20. Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 2 min em ≥12, 000 x g.
  21. Cuidadosamente remova a coluna e colocar em um novo tubo de coleta de 2 mL. Microcentrifuge a toda a velocidade para 1 min (para secar completamente a membrana).
  22. Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Adicione 30 µ l de água livre de RNase para a membrana da coluna.
  23. Eluir o RNA da coluna por microcentrifuging por 1 min em ≥12, 000 x g. Quando carregar as colunas para a microcentrifuga, certifique-se que as tampas do tubo da coleção estão enfrentando na direção centrífuga gira, para evitar que as tampas de romper.
  24. Adicione outro 30 μL de água livre de RNase para a membrana da coluna, mantendo a coluna no mesmo tubo microcentrifuga.
  25. Microcentrifuga por 1 min em ≥12, 000 x g, para que o volume final de eluato é 60 µ l.
  26. Armazene cada tubo de 1,5 mL contendo 60 µ l de RNA em congelador a-80 ° C.

3. determinar a qualidade e a concentração de RNA

  1. Medir a concentração de RNA e DNA em cada amostra de RNA, usando um dados, (b) DNA e RNA-específico fluorescente corantes e tubos de ensaio (c), conforme listado na Tabela de materiais. Siga as instruções dos dados e os corantes.
  2. Alternativamente, medir a concentração de ácido nucleico com um espectrofotômetro UV a 260 nm.
    Nota: Uma leitura de260 A do 1.0 é equivalente a ~ 40 µ g/mL, single-stranded do RNA.
  3. Testar a qualidade do RNA executando o RNA em um analisador de ácido nucleico comercial (veja a Tabela de materiais) ou em um padrão de formaldeído/agarose gel 26.

4. RNA-seq análise

  1. Partir do estoque de RNA total, compõem 21 µ l de 100 ng / µ l do RNA em água livre de RNase. Use 1 µ l deste 21 µ l para testar a concentração de RNA como acima. Enviar o restantes 20 µ l (2 µ g) RNA total para um centro de sequenciamento externo para enriquecimento do mRNA, preparação de biblioteca vertente específica (com oito ou mais códigos de barras para multiplexação) e sequenciamento (veja a Tabela de materiais). Alternativamente, localmente realizar o enriquecimento de mRNA e preparação de biblioteca e então apresentar a biblioteca para sequenciamento.
  2. Pool de oito ou mais amostras multiplexadas e sequência em uma pista de um sequenciador de última geração.
  3. Baixe o arquivo FASTQ que contém todas as leituras de sequência e lê o índice correspondente. Também, baixe o arquivo de texto contendo os códigos de barras multiplex.
    Nota: O índice lê pode estar presente em um arquivo separado de FASTQ. Coloque todos esses arquivos em um diretório.
  4. Coloque o script fornecido aqui, "fastq_pipeline.sh", no mesmo diretório. Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador.
    Nota: este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, a qualidade de roteiro apara o lê, o lê é mapeado para o genoma e gera um arquivo delimitado por tabulação que contém o número de leituras por gene para cada amostra.
  5. Deposite os arquivos FASTQ e dados de contagem de leitura crua na expressão do Gene Omnibus do NCBI antes publicação 27. Siga as instruções para "Submeter dados de sequência de alto rendimento para GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Importar os dados de contagem de leitura para o ambiente de estatística R e realizar análise estatística, utilizando o script de R fornecido aqui, "time_course_script. R". Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador.
    Nota: Este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, este script importa os dados de leitura, normaliza o lê, identifica genes que mudam significativamente durante o curso do tempo, realiza análise PCA e gráficos a expressão dos genes selecionados.

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Resultados

O curso de tempo de hipóxia e RNA-seq análise foram realizadas independentemente de três vezes. Para examinar a reprodutibilidade de as três repetições, dados da expressão do gene para todos os genes foi analisados usando análise de componente Principal (PCA). A Figura 2 mostra como as amostras mudam durante os dois primeiros componentes principais, que juntos representam 58,9% da variabilidade. Esta análise indicou que cada curso do tempo exibe alterações si...

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Discussão

Neste estudo, os níveis de RNAm para todos os genes foi medido durante hipóxia em levedura S. cerevisiae. O objetivo foi analisar as mudanças de expressão de gene como global devido ao crescimento em um ambiente controlado de perto-anóxica. Várias medidas foram tomadas para garantir que o método descrito aqui foi cuidadosamente controlada e reprodutível. Primeiro, as células foram expostas a um ambiente hipóxico precisamente definido: 99,999% N2 em mídia rica (YPD). Outros estudos de hipóxia tem fecha...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o Instituto Lewis-Sigler Integrativa facilidade do núcleo do sequenciamento de genómica da Universidade de Princeton para aconselhamento técnico e para a preparação de biblioteca de RNA e sequenciamento. Este trabalho foi financiado por doações da Universidade Rowan e NIH NIGMS R15GM113187 para M.J.H.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incubadora seca fechadaThermo ScientificMaxQ 4000Ajustada a 30 °C. Modifique a porta para permitir a entrada de um tubo Tygon. Como alternativa, use a incubadora New Brunswick G25, que contém uma porta de tubo. Não use um agitador de água ao ar livre, pois a condensação se acumulará nos tubos entre os frascos, possivelmente contaminando as culturas.
Porta-filtro de micro-análiseMilliporeXX100253025mm de diâmetro, suporte em aço inoxidável, montagem de rolha de silicone perfurado nº 5 em frasco filtrante padrão de 125 mL
Vácuo forteEdwardsE-LAB 2O " casa" O vácuo pode ser muito fraco. Como alternativa, use uma bomba de vácuo portátil de energia elétrica como a listada aqui.
1.000 mLPara atuar como purgador de vácuo.
~2 pés de comprimento de Tubo de Vácuo de Parede Pesada, diâmetro interno 3/8 pol, diâmetro externo 7/8 polTygon38TTDuas peças: a primeira conecta o vácuo ao purgador, e a segunda conecta o purgador ao sistema de filtro.
de gás N2 de alta pressão99,999% de pureza, >1.000 psi, com regulador e controlador de fluxo de gás
FrascoAbertura coberta com folha de alumínio. Um para cada cepa de levedura.
autoclavados de 250 mLAberturas cobertas com folha de alumínio. Um para cada ponto de tempo mais dois para armadilhas de água.
Rolhas de frasco (tamanho 6, dois furos com 5 mm de diâmetro)Esterilizado com etanol a 70%. Um para cada frasco.
Tubo de vidro, comprimento 9 cm ou 17 cm, diâmetro interno 2 mm, diâmetro externo 5 mmEsterilizado com etanol 70%. Dois tubos para cada frasco. Coloque nos orifícios de cada rolha. Veja a Figura 1 para a colocação de tubos de 9 vs 17 cm.
~25 cm de comprimento de tubo de plástico, diâmetro interno 5 mmTygonE-3603Uma peça para cada frasco. Esterilizado com etanol 70%.
Discos de filtro estéreisMilliporeHAWP0250025 mm de diâmetro, 0,45 µ m tamanho dos poros, um para cada ponto de tempo
DH2O estéril (~100 mL)
1 mL cubetasPara medir OD600 (ou seja, concentração celular)
Tubos de centrífuga estéreis de 50 mL Umpara cada ponto de tempo
Pinças limpas
nitrogênioPara congelar células
contas lavadas com ácidoSigmaG8772Mantenha a 4 ° C para células lisadoras
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104Para purificação de coluna de RNA
Qiagen RLT bufferPrepare adicionando 10 µ L de β-mercaptoetanol por 1 ml de tampão RLT, manter a 4 °C.
Tubos de coleta de 2 mLQiagenincluídos no Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPEQiagenincluído no Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1Qiagenincluído no Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I estoque e soluções de trabalhoQiagen79254A enzima DNase I vem como pó liofilizado em um frasco de vidro. Usando uma agulha e seringa estéreis, injete 550 µ L de água sem RNase (fornecida no kit Qiagen) no frasco. Misture invertendo suavemente a garrafa. Para evitar a desnaturação da enzima, não faça vórtice. Usando uma pipeta, remova esta solução estoque do frasco e armazene no freezer (-20 ° C) em alíquotas de uso único (80 µ L cada). A solução estoque não deve ser descongelada e congelada novamente.
Tampão RDDQiagenincluído no Kit Qiagen DNase
gelados de 2 mL com tampa de roscaPara lise de células durante a extração de RNA
homogeneizador de moinho de esferasBiospec Mini-Beadbeater-24112011Manter em câmara fria
Bacto PeptoneBDDF0118para meio líquido YPD
Extrato de levedura BactoBDDF0886para líquido Mídia YPD
glicoseFisherD16para mídia YPD líquida
Tubos de ensaio QubitThermo FisherQ32856para medir a concentração de ácido nucleico
Kit de ensaio Quant-iTTM dsDNA BRThermo FisherQ32853para medir a concentração de ácido nucleico
Kit de ensaio de RNA Quant-iTTMThermo FisherQ32855para medir a concentração de ácido nucleico
Fluorômetro QubitThermo FisherQ33216para medir a concentração de ácido nucleico
Sistema de eletroforese comercialAgilentBioanalyzer 2100para medir a qualidade do ácido nucleico
Sequenciador de próxima geraçãoIlluminaHiSeq 2500para bibliotecas de sequenciamento
sistema automatizado de manuseio de líquidosWafergenApollo 324para criação Bibliotecas de sequenciamento
PrepX PolyA mRNA Isolation KitWafergen400047para isolar mRNA do RNA total
PrepX RNA SEQ para Illumina Library KitWafergen400039para criar bibliotecas de sequenciamento específicas de fita do RNA total
Barcode Splitterhttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, que inclui o comandohttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (instalado antes do TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (instalado antes do R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (versão gratuita)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Frasco de Tanque autoclavado de 500 mL Frascos e estéreis líquido Tubos gzip

Referências

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
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