Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando RNA-seq para monitorar os níveis do mRNA ao longo do tempo durante a hipoxia resposta das células de S. cerevisiae . Esse método pode ser adaptado para analisar a expressão gênica durante qualquer resposta celular.

Resumo

Complexas mudanças na expressão gênica tipicamente mediam uma grande parcela de uma resposta celular. Cada gene pode alterar a expressão com cinética original como o gene é regulamentado pelo sincronismo particular de um dos muitos estímulos, sinalização de percursos ou efeitos secundários. A fim de capturar o gene todo resposta de expressão à hipoxia em levedura S. cerevisiae, análise de RNA-seq foi usada para monitorizar os níveis de mRNA de genes todos em horários específicos, após a exposição à hipoxia. Hipóxia foi estabelecida pelo crescimento de células de gás de₂ ~ 100% N. Importante, ao contrário de outros estudos hipóxicos, ergosterol e ácidos graxos insaturados não foram adicionados para a mídia porque estes metabólitos afetam a expressão genética. Pontos de tempo foram escolhidos na faixa de 0 - 4 h após hipoxia porque esse período captura as grandes mudanças na expressão gênica. Em cada ponto de tempo, mid log hipóxicos células foram rapidamente filtrada e congelado, limitar a exposição ao₂ e concomitante as mudanças na expressão gênica. O RNA total foi extraído de células e usado para enriquecer para mRNA, que depois foi convertido em cDNA. A partir deste cDNA, multiplex bibliotecas foram criadas e oito ou mais amostras foram sequenciadas em uma pista de um sequenciador de última geração. Um pipeline pós-sequenciamento é descrito, que inclui o aparamento de base de qualidade, ler o mapeamento e determinar o número de leituras por gene. DESeq2 dentro do ambiente de estatística R foi usado para identificar genes que alteram significativamente em qualquer um dos pontos de tempo hipóxica. A análise de três réplicas biológicas revelou grande reprodutibilidade, genes da cinética diferente e um grande número de esperado O₂-regulado genes. Esses métodos podem ser usados para estudar como as células de vários organismos respondem à hipoxia ao longo do tempo e adaptados para estudar a expressão gênica durante outras respostas celulares.

Introdução

Muitos organismos respondem a hipoxia, ou O baixo₂, alterando a expressão de gene a ^1,2,3. Esta resposta ajuda a lidar com a falta de um substrato fundamental para a respiração aeróbia e para diversas reações biossintéticas, mas também com uma mudança de estado redox ⁴células. Vários estudos de microarray, realizados em S. cerevisiae mostram que os níveis de RNAm de centenas de genes mudam em resposta a hipóxia ^5,6,7,

Protocolo

1. indução de hipóxia

1. Um dia ou mais antes do curso do tempo de hipoxia: preparar a incubadora, célula de filtragem sistema, vácuo, tanque de gasolina, balões, rolhas, tubos de vidro e tubos, como a Tabela de materiais.
2. Coloque o tanque de₂ N, incubadora, sistema de vácuo e filtragem nas proximidades, para permitir o processamento rápido das células.
3. Prepare a mídia YPD líquida estéril (1% de extracto de levedura, peptona de 2%, 2% de glicose) misturando os componentes em um frasco de vidro e autoclave.
4. Planeje o layout dos balões na incubadora.
   Nota: O tanque de₂ N, o primeiro balão ser....

Resultados

O curso de tempo de hipóxia e RNA-seq análise foram realizadas independentemente de três vezes. Para examinar a reprodutibilidade de as três repetições, dados da expressão do gene para todos os genes foi analisados usando análise de componente Principal (PCA). A Figura 2 mostra como as amostras mudam durante os dois primeiros componentes principais, que juntos representam 58,9% da variabilidade. Esta análise indicou que cada curso do tempo exibe alterações si.......

Discussão

Neste estudo, os níveis de RNAm para todos os genes foi medido durante hipóxia em levedura S. cerevisiae. O objetivo foi analisar as mudanças de expressão de gene como global devido ao crescimento em um ambiente controlado de perto-anóxica. Várias medidas foram tomadas para garantir que o método descrito aqui foi cuidadosamente controlada e reprodutível. Primeiro, as células foram expostas a um ambiente hipóxico precisamente definido: 99,999% N₂ em mídia rica (YPD). Outros estudos de hipóxia tem fecha.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora seca fechada	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Ajustada a 30 °C. Modifique a porta para permitir a entrada de um tubo Tygon. Como alternativa, use a incubadora New Brunswick G25, que contém uma porta de tubo. Não use um agitador de água ao ar livre, pois a condensação se acumulará nos tubos entre os frascos, possivelmente contaminando as culturas.
Porta-filtro de micro-análise	Millipore	XX1002530	25mm de diâmetro, suporte em aço inoxidável, montagem de rolha de silicone perfurado nº 5 em frasco filtrante padrão de 125 mL
Vácuo forte	Edwards	E-LAB 2	O " casa" O vácuo pode ser muito fraco. Como alternativa, use uma bomba de vácuo portátil de energia elétrica como a listada aqui.
		1.000 mL	Para atuar como purgador de vácuo.
~2 pés de comprimento de Tubo de Vácuo de Parede Pesada, diâmetro interno 3/8 pol, diâmetro externo 7/8 pol	Tygon	38TT	Duas peças: a primeira conecta o vácuo ao purgador, e a segunda conecta o purgador ao sistema de filtro.
		de gás N2 de alta pressão	99,999% de pureza, >1.000 psi, com regulador e controlador de fluxo de gás
Frasco			Abertura coberta com folha de alumínio. Um para cada cepa de levedura.
		autoclavados de 250 mL	Aberturas cobertas com folha de alumínio. Um para cada ponto de tempo mais dois para armadilhas de água.
Rolhas de frasco (tamanho 6, dois furos com 5 mm de diâmetro)			Esterilizado com etanol a 70%. Um para cada frasco.
Tubo de vidro, comprimento 9 cm ou 17 cm, diâmetro interno 2 mm, diâmetro externo 5 mm			Esterilizado com etanol 70%. Dois tubos para cada frasco. Coloque nos orifícios de cada rolha. Veja a Figura 1 para a colocação de tubos de 9 vs 17 cm.
~25 cm de comprimento de tubo de plástico, diâmetro interno 5 mm	Tygon	E-3603	Uma peça para cada frasco. Esterilizado com etanol 70%.
Discos de filtro estéreis	Millipore	HAWP02500	25 mm de diâmetro, 0,45 µ m tamanho dos poros, um para cada ponto de tempo
DH2O estéril (~100 mL)
1 mL cubetas			Para medir OD600 (ou seja, concentração celular)
Tubos de centrífuga estéreis de 50 mL Um			para cada ponto de tempo
Pinças limpas
nitrogênio			Para congelar células
contas lavadas com ácido	Sigma	G8772	Mantenha a 4 ° C para células lisadoras
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Para purificação de coluna de RNA
Qiagen RLT buffer			Prepare adicionando 10 µ L de β-mercaptoetanol por 1 ml de tampão RLT, manter a 4 °C.
Tubos de coleta de 2 mL	Qiagen		incluídos no Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		incluído no Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		incluído no Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I estoque e soluções de trabalho	Qiagen	79254	A enzima DNase I vem como pó liofilizado em um frasco de vidro. Usando uma agulha e seringa estéreis, injete 550 µ L de água sem RNase (fornecida no kit Qiagen) no frasco. Misture invertendo suavemente a garrafa. Para evitar a desnaturação da enzima, não faça vórtice. Usando uma pipeta, remova esta solução estoque do frasco e armazene no freezer (-20 ° C) em alíquotas de uso único (80 µ L cada). A solução estoque não deve ser descongelada e congelada novamente.
Tampão RDD	Qiagen	incluído no Kit Qiagen DNase
		gelados de 2 mL com tampa de rosca	Para lise de células durante a extração de RNA
homogeneizador de moinho de esferas	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Manter em câmara fria
Bacto Peptone	BD	DF0118	para meio líquido YPD
Extrato de levedura Bacto	BD	DF0886	para líquido Mídia YPD
glicose	Fisher	D16	para mídia YPD líquida
Tubos de ensaio Qubit	Thermo Fisher	Q32856	para medir a concentração de ácido nucleico
Kit de ensaio Quant-iTTM dsDNA BR	Thermo Fisher	Q32853	para medir a concentração de ácido nucleico
Kit de ensaio de RNA Quant-iTTM	Thermo Fisher	Q32855	para medir a concentração de ácido nucleico
Fluorômetro Qubit	Thermo Fisher	Q33216	para medir a concentração de ácido nucleico
Sistema de eletroforese comercial	Agilent	Bioanalyzer 2100	para medir a qualidade do ácido nucleico
Sequenciador de próxima geração	Illumina	HiSeq 2500	para bibliotecas de sequenciamento
sistema automatizado de manuseio de líquidos	Wafergen	Apollo 324	para criação Bibliotecas de sequenciamento
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	para isolar mRNA do RNA total
PrepX RNA SEQ para Illumina Library Kit	Wafergen	400039	para criar bibliotecas de sequenciamento específicas de fita do RNA total
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, que inclui o comando			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (instalado antes do TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (instalado antes do R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (versão gratuita)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

Frasco de Tanque autoclavado de 500 mL Frascos e estéreis líquido Tubos gzip