Técnica de constrição da aorta minimamente invasiva transversal em camundongos para indução de Hipertrofia Ventricular Esquerda

Resumo

O objectivo do presente protocolo é descrever passo a passo a técnica de constrição da aorta transversa minimamente invasiva (TAC) em camundongos. Pela eliminação de intubação e ventilação que são obrigatórios para o procedimento padrão comumente usado, TAC minimamente invasiva simplifica o procedimento operatório e reduz o esforço de colocar o animal.

Resumo

Constrição da aorta transversa (TAC) em camundongos é dentre as técnicas cirúrgicas mais utilizadas para a investigação experimental de pressão induzida por sobrecarga esquerda hipertrofia ventricular (HVE) e sua progressão para insuficiência cardíaca. Na maioria dos inquéritos relatados, este procedimento é realizado com intubação e ventilação do animal que torna exigente e demorado e contribui para a carga cirúrgica para o animal. O objectivo do presente protocolo é descrever uma técnica simplificada de TAC minimamente invasiva sem intubação e ventilação dos ratos. Passos críticos da técnica são enfatizados para atingir baixa mortalidade e alta eficiência na indução de hve.

Camundongos C57BL/6 do sexo masculino (10 semanas, 25-30 g, n = 60) foram anestesiados com uma única injeção intraperitoneal de uma mistura de ketamina e xilazina. Em um respirar espontaneamente animais seguindo uma esternotomia parcial superior de 3 a 4 mm, um segmento de 6/0 de sutura seda enfiada através do olho de uma ajuda de ligadura foi aprovado sob o arco aórtico e amarrado com uma agulha de calibre 27 embotada. Animais com operação submeteu-se a mesma preparação cirúrgica mas sem constrição da aorta. A eficácia do procedimento na indução de hve é atestada por um aumento significativo na proporção de peso de corpo/coração. Esta proporção é obtida no dias 3, 7, 14 e 28 após a cirurgia (n = 6-10 em cada grupo e cada ponto de tempo). Usando a nossa técnica, hve é observada em TAC comparado com animais, farsa do dia 7 até dia 28. Operativa e tardia (mais de 28 dias) mortalidades são ambos muito baixa em 1,7%.

Em conclusão, nossa técnica econômica de TAC minimamente invasiva em camundongos carrega muito baixa mortalidade operatória e pós-operatório e é altamente eficiente na indução de hve. Simplifica o procedimento operatório e reduz o esforço de colocar o animal. Pode ser facilmente realizada seguindo os passos críticos descritos neste protocolo.

Introdução

Nos últimos anos, o estudo de insuficiência cardíaca tem sido conduzido em animal viável modelos¹. Comparado a grandes modelos animais de insuficiência cardíaca, pequenos modelos animais tem inúmeras vantagens potenciais. Além de reduzir os custos de habitação e manutenção modelos animais pequenos são acessíveis aos investigadores mais devido a menos complexas instalações necessárias².

Modelos de mouse insuficiência cardíaca oferecem muitas das mesmas vantagens que os modelos do rato. Além disso, reduzida a carcaça custa³, modelos do rato beneficiam a disponibilidade de relevantes transgénicas e nocaute (KO) cepas. A possibilidade de célula tipo específico, inducible KO ou transgénicas estratégias fazer o mouse uma ferramenta valiosa para estudar a patogênese da insuficiência cardíaca e para tentar identificar novos regimes terapêuticos³.

Entre o mouse modelos de insuficiência cardíaca, atualmente usado⁴, constrição transversal da aorta (TAC), que foi primeiramente descrita por Rockman⁵ é o modelo preferido para gerar pressão induzida por sobrecarga esquerda hipertrofia ventricular (HVE)^{1 , 3}. a maior vantagem desse modelo é a capacidade de permitir a estratificação de hve², embora ventricular esquerda em resposta ao TAC que remodela é variável entre cepas de mouse diferente. Em particular, camundongos C57BL/6 desenvolvem rápida dilatação LV após TAC que não pode ocorrer com outras estirpes^4,6,7.

O início súbito de hipertensão alcançado com TAC causas um aproximadamente 50% aumento na massa de LV dentro de 2 semanas, permitindo examinar rapidamente a atividade das intervenções farmacológicas ou moleculares, visando o desenvolvimento de hve⁴de modulação. A indução aguda de hipertensão grave por TAC não exatamente reproduzir a progressiva hipertrofia ventricular esquerda e remodelação observados na prática clínica de estenose aórtica ou hipertensão arterial. No entanto, este modelo é usado por muitos pesquisadores para identificar e modificar novos alvos terapêuticos em insuficiência cardíaca⁴.

Executar o TAC em camundongos requer perícia cirúrgica maior do que o necessário para outras técnicas usadas para induzir a hve e subsequente insuficiência cardíaca². A maioria dos autores executam esse procedimento, intubar e ventilar o animal^2,8, o que torna este procedimento mais exigente e demorado e contribui para a carga cirúrgica para o animal. Apenas alguns investigadores utilizaram TAC minimamente invasiva em seu estudo com uma breve referência para o procedimento cirúrgico^9,10,11.

O objectivo do presente protocolo é descrever passo a passo uma técnica simplificada e user-friendly de minimamente invasiva constrição da aorta transversa em camundongos, destacando as fases críticas do processo. Seguindo estas etapas principais, um pode facilmente realizar esta técnica.

Protocolo

camundongos C57BL/6J masculino (10 semanas, 25-30g, n = 60) são utilizados no presente protocolo. Os animais recebem atendimento humano em conformidade com as orientações formuladas pelo Ministério da agricultura e do ensino superior e pesquisa, e todos os procedimentos são realizados em conformidade com a Directiva do Conselho de Comunidade Europeia de 24 de novembro de 1986 ( 86/609/CEE) e as leis francesas. O protocolo foi aprovado pelo " Comité de ética Regional da CREMEAS de Experimentação Animal " (#2016092816207606).

1. preparação para a cirurgia

1. manter os ratos durante uma semana após a chegada na instalação de animais em um ciclo de luz/escuro de 12h / 12h, em gaiolas padrão, com comida (para detalhes, consulte a tabela de materiais) e água disponível ad libitum.
2. No dia da operação, coloque os ratinhos em gaiolas individuais alguns minutos antes da indução da anestesia, a fim de evitar qualquer estresse adicional ao animal. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos no dia antes da cirurgia.
3. Intra-peritoneally injetar uma dose única de uma mistura de cetamina (51,4 mg/kg) e xilazina (3,3 mg/kg), diluído em solução salina (0,9% NaCl).
4. Certifique-se da profundidade da anestesia pela ausência do reflexo do dedo do pé-retiro.
5. Rapar o pescoço e o peito do animal com uma navalha comercialmente disponível e desinfetar a área depilada com álcool a 70%.
6. Colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma almofada de trabalho limpo cortiça e corrigir as patas com fita adesiva.

2. Cirurgia

1. técnica cirúrgica estéril é usado em todos os procedimentos. Em uma respiração espontaneamente animal, realizar uma incisão cervical longitudinal na linha média superior a 10 mm com uma faca de lâmina 11 do notch supraesternal no meio do peito para expor o esterno ( Figura 1).
2. Retrair a tireoide, passando uma sutura de polipropileno estadia de monofilamento de 4/0 com uma madeira de Crile da agulha e fita para a almofada trabalho.
3. Separar sem rodeios os músculos pré-traqueais com pinças microcirúrgica para descobrir a traqueia.
4. Deslize suavemente o liso com ponta curva Pinca microcirúrgica com as maxilas fechadas sobre a traqueia e por trás do esterno.
5. Por cuidadosamente abrindo e fechando as mandíbulas da pinça microcirúrgica curvada com ponta lisa realizam uma dissecção romba sob os músculos pré-traqueais e atrás do esterno para afastar a pleura.
6. Segure os músculos bem supra-clavicular com a pinça reta microcirúrgica com ponta lisa e puxe suavemente o peito do animal.
7. Deslize o maxilar inferior do friozinho de osso sob o esterno e executar uma esternotomia superior parcial 3-4 mm ( Figura 2). Direto a parte inferior do miniesternotomia ligeiramente para a esquerda.
8. Passar uma 7/0 estadia polipropileno sutura de monofilamento de dentro para fora do espaço intercostal segundo em cada lado do miniesternotomia usando um porta-agulha microcirúrgica. Fique perto do ângulo costo-esternal para evitar lesões aos vasos torácicos intercostais e internos ou pleura.
9. Espalhar as bordas esternais usando suturas de estadia polipropileno monofilamento 7/0 de cada lado e corrigi-los para o bloco de trabalho com fita adesiva.
10. Gentilmente mudar de lado os músculos pré-traqueais, gordura do mediastino e Timo usando liso com ponta curva microcirúrgico fórceps para visualizar o arco aórtico com ampliação de baixa potência (2-3x) ( Figura 3). Tome especial cuidado para não tocar ou danificar a pleura parietal para prevenir o desenvolvimento de pneumotórax.
11. Expor o tecido mole sob o arco aórtico por Pinca ( Figura 4) e espalhe suavemente as suas mandíbulas. Preparar um túnel no tecido mole sob o arco aórtico com fórceps subordinante segundo suavemente abrindo e fechando as mandíbulas em tecido mole.
12. Passar um segmento de 6/0 ligadura seda enfiada através do olho de uma ajuda de ligadura ( Figura 4 B) realizada na mão esquerda sob o arco aórtico e recuperá-los por Pinca realizada na mão direita entre a origem da esquerda e direita inominadas comuns artérias carótidas ( Figura 5).
13. Cortar uma agulha de calibre 27 a um comprimento de 5 mm e sem corte ambas as extremidades, pressionando-os com um porta-agulha Crile. Coloque a agulha de calibre 27 cega ao lado da aorta ( Figura 6) com a pinça reta microcirúrgica com ponta lisa e amarrar a sutura confortavelmente ao redor da agulha e da aorta entre a carótida comum esquerda e direita inominada artérias, usando a pinça subordinante dois ( Figura 7). Para amarrar firmemente a sutura, execute um nó duplo inicial seguido de quatro nós adicional. Certifique-se de que todos os nós são planos.
14. Depois da ligadura, remover rapidamente mas com cuidado a agulha para alcançar um estreitamento do diâmetro de 0,4 mm e uma constrição da aorta transversa reprodutíveis 65-70%.
15. Verificar hemostasia do tecido mole ao redor do arco aórtico, das bordas esternais e músculos pré-traqueais. Colocar gaze hemostático absorvível onde o escorrimento do sangue é observada. Remover o polipropileno monofilamento de 7/0 ficar suturas usadas para espalhar as bordas esternais.
16. Passar uma sutura de 6/0 simples monofilamento polipropileno com um porta-agulha microcirúrgica de fora para dentro do espaço segundo intercostal esquerdo e em seguida, de dentro para fora o direito segundo espaço intercostal. Fique perto do ângulo costo-esternal para evitar lesões aos vasos torácicos intercostais e internos ou pleura.
17. Reunir as bordas esternais, amarrando a sutura de polipropileno monofilamento 6/0 com uma madeira de Crile porta-agulha.
18. Fechar a pele com um polipropileno monofilamento 5/0 execução sutura em uma camada com uma madeira de Crile porta-agulha.
19. Realizar o procedimento de Souza idêntico para a operação de constrição, mas sem subordinação uma sutura ao redor da aorta.

3. Recuperação pós-operatória

1. acompanhar de muito perto os animais. transferir o mouse para uma gaiola individual e colocá-lo em uma posição propensa.
2. Permitir o mouse para recuperar sob uma luz de aquecimento até totalmente acordado (menos de 1 h após a indução de anestesia).
3. Para analgesia pós-operatória, injetar 0,1 mg/kg de buprenorfina intraperitonealmente. Repita injecções subcutâneas de 0,1 mg/kg de buprenorfina cada 8 h para os três primeiros dias, conforme indicado.
4. Coloque os ratos operados em gaiolas padrão (máximos 3 ratos por gaiola) e mínimos 2 ratos por gaiola.

4. Colheita de coração

1. no dia de análise, eutanásia o mouse com uma solução de cetamina 300 mg/kg e xilazina 20 mg/kg em solução salina por injeção intraperitoneal.
2. Primeiro colher o sangue da veia cava inferior e em seguida, através da mesma linha injetar 5 mL de solução de 2,6 mM EDTA em solução salina.
3. o coração da colheita, remover os átrios e peso do coração (ventrículos direito e esquerdo sem átrios).
4. Separar o ventr direita esquerdaIcle com o septo restante para a parte do ventrículo esquerdo. Pesar de ambas as amostras de tecido e congelá-los em azoto líquido.

Resultados

Sobrevivência operativa e tarde
A sobrevivência operativa foi muito alta, 98,3% (59 de 60) para toda a série (TAC e animais operação). A morte só operativa foi devido a uma complicação de sangramento em um rato aplainada para operação de Souza. Sobrevivência pós-operatória durante o período de observação de 28 dias também foi excelente, por 98,3% (58 de 59). A morte só tarde pós-operatória ocorreu em um rato de TAC no dia (D) 16, possivelmente de origem cardíaca.

<...

Discussão

O objectivo do presente protocolo é apresentar uma ilustração passo a passo da técnica cirúrgica para constrição da aorta transversa minimamente invasiva em ratos. Descrição técnica pormenorizada da constrição da aorta transversa em ratos tem sido relatada por outros autores^2,8. No entanto, estes investigadores realizar cirurgia após intubação e ventilação dos animais. O uso de uma etapa adicional de intubação-ventilação aumenta a complexidade e a duração de todo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio cirúrgico	Olympus	SZX2-TR30
Navalha	Rowenta	Nomad TN3650FO
Suturas:
Polipropileno 7/0	Ethicon	BV-1X
Polipropileno 6/0	BBraun	C0862061
Silk 6/0 ligadura	FST	18020-60
Polipropileno 4/0	Ethicon	8683
Polipropileno 5/0	Ethicon	Z303
Drogas:
Ketamin	Merial	Imalgè ne 1000, LBM154AD
Xylazine	Bayer	Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorfina	Ceva	Vetergesic, 072013
Instrumentos:
Bone nippers	Ferramentas Cirúrgicas Finas	16101-10
Auxiliar de ligadura	Ferramentas Cirúrgicas Finas	18062-12
Pinça de amarração	Ferramentas Cirúrgicas Finas	18026-10
Porta-agulhas Ferramentas	Cirúrgicas Finas	12003-15
Pinça de microcirurgia	Ferramentas Cirúrgicas Finas	11003-12
Pinças de Microcirurgia	Ferramentas Cirúrgicas Finas	11002-12
Pinça de Tecido	Ferramentas Cirúrgicas Finas	11021-12
Porta-agulha de microcirurgia	Ferramentas Cirúrgicas Finas	12076-12
Tesoura de microcirurgia	Ferramentas Cirúrgicas Finas	91501-09
Tesoura Mayo	Ferramentas Cirúrgicas Finas	14511-15
Faca de 11 lâminas	Cirúrgica Fina Ferramentas	10011-00
Extração de RNA e qPCR:
TriReagent	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini kit	Qiagen	74704
Qubit Ensaio de RNA fluorimétrico	Fisher Scientific	10034622
RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Kit de cDNA de alta capacidade	Fisher Scientific	10400745
Taqman Master Mix	Fisher Scientific	10157154
Taqman BNP primers	Fisher Scientific	Mm01255770_g1
Taqman ANP primers	Fisher Scientific	Mm01255747_g1
Primers Taqman ACE	Fisher Scientific	Mm00802048_m1
Taqman Col1a1 primers	Primers Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Taqman TGFb Primers	Fisher Scientific	Mm01178820_m1
Taqman Gapdh	Fisher Scientific	Mm99999915_g1
ABIPrism  Termociclador	Applied Biosystems	7000
Software:
GraphPad Prism	GraphPad	Prism 7
Alimento animal
Dieta completa para ratos/camundongos adultos	Safe	UB220610R