Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Resumo

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca^{2 +} e Ca^{2 +}- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

Resumo

A produção de ATP por fosforilação oxidativa é a principal função das mitocôndrias. Mitocôndrias em eucariontes superiores também participam citosólico Ca^{2 +} buffer, e a produção de ATP em mitocondrial pode ser mediada por intramitocondrial grátis Ca^{2 +} concentração. Capacidade de retenção do CA^{2 +} pode ser considerada como a capacidade das mitocôndrias de reter cálcio na matriz mitocondrial. Ca^{2 +} pistas intracelulares acumuladas para a permeabilidade da membrana mitocondrial interna, denominado a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), menos de 1,5 kDa de peso que leva para o escapamento de moléculas com um molecular. CA^{2 +}-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Aqui, descrevemos dois ensaios para examinar a capacidade de retenção do Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas. Depois de certas quantidades de Ca^{2 +} são adicionados, todos os passos podem ser concluídos em um dia e gravados por um leitor de microplacas. Assim, estes dois ensaios simples e eficazes podem ser adoptados para avaliar a Ca^{2 +}-relacionado funções mitocondriais.

Introdução

As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca^{2 +} pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP¹. Quando a concentração de citosólico Ca^{2 +} vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca^{2 +} rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca^{2 +}. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial ....

Protocolo

1. isolamento de mitocôndrias

Nota: Todas as soluções e equipamentos devem ser pré-resfriado a 0 - 4 ° C e mantidos no gelo.

1. Semente cerca de 3 x 10⁶ SH-SY5Y células por placa de cultura de células de 10 cm. Células de cultura em alta-glicose Dulbecco modificada do meio de águia com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µ g/mL). Manter a 37 ° C numa incubadora contendo 5% CO₂ durante a noite.
   Nota: pelo menos 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y de células são necessárias para cada ensaio de isolamento.
2. Retire o meio e lave as células com cerca de 1 mL de PBS frio de gelo em....

Resultados

Resultados de representante de Ca^{2 +} capacidade de retenção:
Os resultados foram expressos em valores de fluorescência. Com os pulsos adicionais de Ca^{2 +} (proteína mitocondrial nmols/mg 200), a fluorescência aumentada o dobro acima da linha de base com a abertura do mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), um inibidor de Ca^{2 +}-induzida mPTP abertura, ou 1 μM atractyloside (ATR), um ativador de Ca^{2 +}-induzida mPTP abertura, foram adicionados em .......

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para o mitocondrial Ca^{2 +} retenção capacidade do ensaio e Ca^{2 +}-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial.

Para o isolamento mitocondrial, certifique-se de que todos os materiais e os tubos são no gelo, especialmente quando homogeneizando as células. 0,25% do trypsin-EDTA também pode ser usado para destacar células do prato por 5 min a 37 ° C. Depois de 15-25 cursos, é necessário observar a membrana celular intacta ao mi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular SH-SY5Y	ATCC (The Global Bioresource Center)	Número ATCC: CRL-2266
Verde de cálcio-5N	Life Technologies	c-3737	Corante fluorescente verde de ligação Ca2+ inibidores
completos de protease	de vidro 4693116001		Roche Molecular Biochemicals
	Kimble Chase	9885303002
malato de glutamato	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenona	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan instrumentos de flash	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractilosídeo	Sigma-Aldrich	C4992
Dulbecco com alto teor de glicose s meio Eagle modificado	Hyclone	SH30022	4,5 g/L de glicose, L-glutamina, sem piruvato de sódio
soro bovino fetal	Hyclone	SV30087
penicilina	Sigma-Aldrich	P3032
estreptomicina	Invitrogen	11860-038
Kit de ensaio BCA	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
Placa de cultura de células de 10 cm	NEST	704001

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