Aqui, apresentamos o monitoramento em tempo real de migração celular em um ensaio de cicatrização de feridas utilizando empobrecido TIP60 MCF10A mama células epiteliais. A implementação de técnicas de imagem de viver-pilha em nosso protocolo nos permite analisar e visualizar o movimento de célula única em tempo real e ao longo do tempo.
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Artigo de método
Imagens ao vivo de migração de células epiteliais da mama após o esgotamento de transiente de TIP60
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio de cicatrização de feridas é eficiente e uma das formas mais econômicas para estudar a migração de células in vitro. Convencionalmente, imagens são tomadas no início e no fim de uma experiência usando um microscópio de contraste de fase, e as capacidades de migração das células são avaliadas pelo encerramento das feridas. No entanto, o movimento celular é um fenômeno dinâmico, e não permite um método convencional para controlar o movimento de célula única. Para melhorar o atuais ensaios de cicatrização de feridas, usamos técnicas de imagem ao vivo-celular para monitorar a migração celular em tempo real. Este método permite determinar a taxa de migração de células com base em um sistema de rastreamento de celular e fornece uma distinção mais clara entre a migração celular e proliferação celular. Aqui, vamos mostrar o uso da imagem latente da viver-pilha em cicatrização ensaios para estudar as capacidades diferentes de migração das células epiteliais da mama, influenciadas pela presença de TIP60. Como a motilidade celular é altamente dinâmica, nosso método fornece mais insights sobre os processos de cura do que um instantâneo de fechamento de ferida tomado com as técnicas tradicionais de imagem usadas para ensaios cicatrização de ferida.
Introdução
Proteína de HIV-Tat-interactive 60 kDa (TIP60) é uma acetiltransferase de lisina que pode acetificam tanto histona e proteínas não-histonas1,2. Suas funções são encontradas para ter implicações em múltiplas vias de sinalização, incluindo a transcrição, reparar os danos do DNA e apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. Além disso, TIP60 é frequentemente ativador em cânceres e seu downregulation e....
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Protocolo
1. preparação
- Preparar o meio de cultura de MCF10A: médio de Eagle modificado (DMEM de Dulbecco) / F12 (1:1) com 5% cavalo de soro, 20 fator de crescimento epitelial ng/mL, hidrocortisona 0,5 mg/mL, toxina da cólera 100 ng/mL e 10 µ g/mL insulina.
- Preparar o meio livre de soro: DMEM/F12 (1:1) com 20 fator de crescimento epitelial ng/mL, hidrocortisona 0,5 mg/mL, toxina da cólera 100 ng/mL e 10 µ g/mL insulina.
- Use a seguinte sequência de siRNA:
siControl:
Para a frente: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Reverso: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60:
Para a frente: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Reverso: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUC....
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Resultados
Esquema geral do ensaio de migração ao vivo-célula célula baseada em imagem
Figura 1A é uma esquema do presente protocolo. MCF10A células transfectadas com siControl mostrou a morfologia epitelial típica. Após o esgotamento de TIP60, MCF10A células eram mais mesenquimais em comparação com células de controle (figura 1B).
Exame de eficiência ".......
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Discussão
É sabido que, no processo de migração celular, células podem qualquer movimento em forma de folhas aderentes; clusters de soltos; ou células única, isoladas. O modo e a dinâmica de invasão celular podem variar de um estado para outro, e o fenótipo pode mudar dentro de horas. O tradicional ensaio de cicatrização de feridas é baseado no instantâneo fotos tiradas de um microscópio com um intervalo de tempo, como 12 ou 24 h. Isto torna difícil capturar a dinâmica de fechamento da ferida e o padrão dos movimentos da célula.
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Agradecemos os membros do laboratório Jai de sua discussão útil e comentários. S.J. foi apoiado por subsídios desde a Fundação de pesquisa nacional de Singapura e o Ministério da educação de Cingapura sob seus centros de pesquisa da iniciativa de excelência para o câncer ciência Instituto de Singapore (R-713-006-014-271), a médica nacional Conselho de pesquisa (CBRG-NIG; BNIG11nov001 e CS-IRG; R-713-000-162-511), o fundo de pesquisa acadêmica do Ministério da educação (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. e C.Y.T. foram apoiados por uma bolsa de pós-graduação pelo Instituto de ciência da câncer de Cingapura, Universidade Nacional de Cingapura.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Célula MCF10A | ATCC | CRL-10317TM | Célula epitelial da mama |
| Mídia DMEM/F12 (1:1) | Gibco | 11330-032 | Mídia de cultura MCF10A |
| Fator de crescimento epitelial (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Suplementos para mídia de cultura MCF10A |
| Toxina da cólera | Suplementos Sigma-Aldrich | C-8052 | para mídia |
| de cultura MCF10ASuplementos de hidrocortisona | Sigma-Aldrich | H-0888 | para meios de cultura MCF10A |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I-1882 | Suplementos para meios de cultura MCF10A |
| Soro doméstico | Gibco | 16050-122 | Suplementos para meios de cultura MCF10A |
| Tripsina | Gibco | 25200-056 | Para MCF10A desprenda da placa |
| Hemacitômetro | Fisher Scientific | 267110 | Para contagem de células |
| Opti-MEM meios de soro reduzidos | Gibco | 31985-070 | Para mistura de siRNA |
| Lipofectamina RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Reagente Transfect |
| Reagente Trizol | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | Para extração de mRNA |
| Kit de Síntese de cDNA iScript | Bio-Rad | 170-8891 | Para cDNA geração |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | Para qPCR em tempo real |
| 7500 Sistema de PCR em tempo real | Biosystems | Mequina qPCR em tempo real | |
| 10 cm prato | Greiner bio-one | 664160 | Para experimento de knockdown |
| placa de 24 poços | Cellstar | 662160 | Para ensaio de cicatrização |
| de feridas siControl siRNA | Self projetado | Auto-projetado | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Auto-projetado | Auto-projetado | UGAUCGAGUUCUCAGCUAUGAdTdT |
| Observador de células vivas | Zeiss | Zeiss Observador de células invertidas para experimentos de células vivas |
Referências
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B.
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Reimpressões e permissões
