Artigo de método

Imagens ao vivo de migração de células epiteliais da mama após o esgotamento de transiente de TIP60

DOI:

10.3791/56248

⸱

7 de dezembro de 2017

 ,  ,  , 
1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos o monitoramento em tempo real de migração celular em um ensaio de cicatrização de feridas utilizando empobrecido TIP60 MCF10A mama células epiteliais. A implementação de técnicas de imagem de viver-pilha em nosso protocolo nos permite analisar e visualizar o movimento de célula única em tempo real e ao longo do tempo.

Resumo

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O ensaio de cicatrização de feridas é eficiente e uma das formas mais econômicas para estudar a migração de células in vitro. Convencionalmente, imagens são tomadas no início e no fim de uma experiência usando um microscópio de contraste de fase, e as capacidades de migração das células são avaliadas pelo encerramento das feridas. No entanto, o movimento celular é um fenômeno dinâmico, e não permite um método convencional para controlar o movimento de célula única. Para melhorar o atuais ensaios de cicatrização de feridas, usamos técnicas de imagem ao vivo-celular para monitorar a migração celular em tempo real. Este método permite determinar a taxa de migração de células com base em um sistema de rastreamento de celular e fornece uma distinção mais clara entre a migração celular e proliferação celular. Aqui, vamos mostrar o uso da imagem latente da viver-pilha em cicatrização ensaios para estudar as capacidades diferentes de migração das células epiteliais da mama, influenciadas pela presença de TIP60. Como a motilidade celular é altamente dinâmica, nosso método fornece mais insights sobre os processos de cura do que um instantâneo de fechamento de ferida tomado com as técnicas tradicionais de imagem usadas para ensaios cicatrização de ferida.

Introdução

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Proteína de HIV-Tat-interactive 60 kDa (TIP60) é uma acetiltransferase de lisina que pode acetificam tanto histona e proteínas não-histonas1,2. Suas funções são encontradas para ter implicações em múltiplas vias de sinalização, incluindo a transcrição, reparar os danos do DNA e apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. Além disso, TIP60 é frequentemente ativador em cânceres e seu downregulation está correlacionada com metástases e taxas de sobrevivência pobre9,10,11,12, 13,14. Metástase de tumor é a principal causa de morte por câncer. É um processo de várias etapa, e a etapa inicial da metástase envolve a migração e invasão de células tumorais em tecidos adjacentes15,16. Para isso, células tumorais primeiro devem desconectar-se da massa do tumor primário, sob a forma de uma camada de células coletivamente invasora ou como desanexado células únicas17. Durante este processo, células tumorais muitas vezes passam por epitélio de transição mesenquimal (EMT), resultando em mudanças na morfologia e célula adesão capacidade17,18.

Algumas técnicas foram desenvolvidas para estudar a migração e a capacidade de invasão do tumor em vitrode células. Entre eles, o ensaio de cicatrização de feridas é mais eficiente e econômica do19. Em primeiro lugar, este método envolve a criação de um fosso artificial em uma monocamada confluente das células, permitindo assim que as células migram e fechar a lacuna. Em segundo lugar, as imagens das lacunas podem ser capturadas no início e no final do experimento. Finalmente, uma comparação de fechamento de espaço é usada para determinar a taxa de migração celular. Um microscópio de contraste de fase é geralmente usado para capturar imagens para ensaios convencionais de cicatrização de feridas. Outra vantagem do ensaio cicatrização é que se assemelha em parte na vivo migração de células do tumor. Da mesma forma para metástases de tumor na vivo , migração celular em ensaios cicatrização mostra tanto a migração coletiva de folhas epiteliais e a migração de células únicas desanexadas.

No entanto, migração celular é conhecida por ser dinâmico, e há uma necessidade de documentar o movimento de células em tempo real. Por exemplo, um ensaio cicatrização convencional não permite que um pesquisador analisar o movimento de célula única. Por outro lado, células cultivadas para ensaios de cicatrização de feridas são muitas vezes soro de fome para inibir a proliferação celular. Isso é feito para descartar a possibilidade de encerramento de lacuna devido a proliferação celular. No entanto, ainda haverá alguns proliferação e morte celular e imagens de contraste de fase, tiradas antes e após o experimento são incapazes de diferenciá-las.

A técnica de imagem live-célula aborda essa limitação dos ensaios convencionais de cicatrização de feridas. Usando um microscópio de viver de imagem combinada com uma incubadora de CO2 e o controle de temperatura apropriado, pesquisadores podem medir o tamanho da lacuna e sua taxa de fechamento ao longo do tempo, enquanto o rastreamento do movimento de ativamente migrando células localizado nas pontas do parte dianteira invasiva. Daí, a implementação de viver-pilha de imagem para monitorar a migração celular só não irá fornecer a melhor visualização da migração celular, mas também permitirá a possibilidade de diferenciar entre migração celular e proliferação celular, proporcionando uma mais análise confiável de migração celular.

Neste estudo, MCF10A mama células epiteliais foram usadas para demonstrar a combinação do ensaio e viver-pilha de imagem para estudar o papel de TIP60 na migração celular-cicatrização da ferida. A depleção de TIP60 resulta em habilidades de aumento da migração de células MCF10A.

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Protocolo

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1. preparação

  1. Preparar o meio de cultura de MCF10A: médio de Eagle modificado (DMEM de Dulbecco) / F12 (1:1) com 5% cavalo de soro, 20 fator de crescimento epitelial ng/mL, hidrocortisona 0,5 mg/mL, toxina da cólera 100 ng/mL e 10 µ g/mL insulina.
  2. Preparar o meio livre de soro: DMEM/F12 (1:1) com 20 fator de crescimento epitelial ng/mL, hidrocortisona 0,5 mg/mL, toxina da cólera 100 ng/mL e 10 µ g/mL insulina.
  3. Use a seguinte sequência de siRNA:
    siControl:
    Para a frente: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
    Reverso: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
    siTIP60:
    Para a frente: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
    Reverso: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
  4. Use pratos de cultura celular de 10 cm e placas de 24 poços.

2. transiente depleção de TIP60 usando siRNA

  1. No dia 1, alíquota 15 µ l de reagente de transfeccao (por exemplo, Lipofectamine RNAiMAX) e 2 mL de redução média de soro (por exemplo, Opti-MEM) e misturá-los com 10 µ l de cada siRNA (estoque de 10 µM), respectivamente.
  2. Incube a mistura à temperatura ambiente por 20 min.
  3. Sementes de 1 x 106 MCF10A células juntamente com 3 mL de meio de cultura em um prato de 10 cm. Conte as células usando um hemocytometer.
  4. Adicione a mistura de siRNA gota a gota para o prato de 10 cm.
  5. Balance o prato para garantir que as células são igualmente distribuídas antes de a colocar na incubadora a 37 ° C.
  6. Após 6 h de incubação, substitua o meio de siRNA-contendo 8 mL de meio de cultura fresco.
  7. No dia 2, prepare outro lote de siRNA misturas e incube-os à temperatura ambiente por 20 min.
  8. Aspire para fora 8 mL do meio de cultura adicionado no dia 1 e substituí-lo com 3 mL de meio de cultura fresco.
  9. Adicione o segundo lote de siRNA mistura aos pratos gota a gota. Agite os pratos para garantir que os reagentes são misturados completamente antes de colocá-los em incubadora.
  10. Após 6 h, substitua o meio de siRNA-contendo 8 mL de meio de cultura fresco.

3. semente células para o ensaio de cicatrização de feridas

  1. No dia 3, descartar o meio e lavar as células uma vez com 2 mL de tampão fosfato salino (PBS) tampão. Descarte o tampão PBS.
  2. Trypsinize o siControl e siTIP60-tratada células, adicionando 1 mL de tampão de tripsina-EDTA 1x para o prato. Coloque de volta no incubadora para 20 min.
  3. Adicionar 4 mL de meio de cultura completo para cada placa, Ressuspender as células pipetando e transferi-los para um tubo de 15 mL.
  4. Centrifugar a 200 g por 5 min e retirar o sobrenadante.
  5. Ressuspender as células com 5 mL de meio livre de soro e contar as células usando um hemocytometer.
  6. Preparar uma suspensão de células de 6 x 105 células/mL para o siControl e siTIP60; Certifique-se de que as células são bem misturadas. Adicione 500 µ l de suspensão de célula para um poço de uma placa de 24 para garantir 100% de confluência. Sementes de 5 a 6 poços cada para siControl e siTIP60.
  7. Agite suavemente a placa e para trás e depois lado a lado para garantir a distribuição uniforme. Evite um movimento circular. Deixe a placa na incubadora durante 24 h.
  8. Colha as células restantes para verificar a eficiência "knockdown" de TIP60. Para fazer isso, centrifugar a suspensão de células restantes a 200 g por 5 min e retire o sobrenadante.
  9. Isolar o RNA usando um reagente comercial, seguindo o protocolo do fabricante e prossiga para PCR quantitativo em tempo real para avaliar a eficiência do knockdown.

4. criar a ferida

  1. Verifique sob um microscópio de contraste de fase para garantir que as células estão totalmente ligadas. Observar as células sob o microscópio (4x, 10x e ampliação de 20 X) para garantir que as células estão totalmente conectadas que formou uma monocamada confluente das células.
    Nota: células siControl anexar geralmente melhor do que as células siTIP60. Isto é esperado porque o esgotamento de TIP60 torna as células mais mesenquimais como20. Aqui, um microscópio de contraste de fase de luz branca normal bancada é usado.
  2. Para gerar a ferida, delicadamente riscar uma linha reta através do centro do poço com uma ponta de pipeta de 200 µ l; o comprimento da ferida gerada é o mesmo que o diâmetro do poço. Repita este passo para todos os restantes poços. Use uma ponta de pipeta nova para cada poço.
  3. Lave delicadamente cada poço 5 vezes utilizando soro livre médio para remover as células desanexadas.
  4. Adicione 1 mL de meio livre de soro a cada poço e proceder à imagem latente da viver-pilha.

5. instalação da imagem latente da viver-pilha

  1. Ligue o microscópio e a temperatura de controle pelo menos 1h antes de configurar a viver-pilha de imagem para garantir que a temperatura na câmara atinge 37 ° C.
  2. Ligue o fornecimento de gás de dióxido de carbono (CO2) antes de começar a viver-pilha imagem. Defina o CO2 concentração de 5%.
  3. Coloque a placa de 24 no palco do microscópio e selecionar a lente objetiva com ampliação de 10x para tratamento de imagens. Direcionar a luz emitida para as oculares em vez da câmera e ajustar o foco para localizar a ferida e as células em torno dele.
    Nota: neste caso, utilizou-se luz branca com contraste de fase.
  4. Use um sistema de viver-pilha observador para marcar a posição da ferida em cada poço.
    Nota: Fase automatizado do sistema da imagem latente de viver-pilha permite a aquisição de imagens em várias posições. Imagens são tiradas em todas as posições marcadas uma vez a cada intervalo.
  5. Configurar a condição de tempo: 1 h intervalo e duração de 72 h; de acordo com esta definição, o sistema vai tirar fotos em cada posição marcada cada hora por 72 h. configurar qualquer intervalo de tempo desejado e o período de monitoramento.
    Nota: Aqui, uma duração de 72 h é melhor porque essas células começam a morrer após 72 h em meio livre de soro.

6. rastreamento de movimento de célula única

  1. Exporte os dados depois de 72 h. exportar os dados, como imagens no formato JPEG e vídeos em formato AVI.
    Nota: Isto é importante porque o software ImageJ só pode reconhecer vídeos no formato AVI. As velocidades de migração de células diferentes entre as células siTIP60 e siControl podem ser claramente observadas no vídeo.
  2. Abra o vídeo AVI no software ImageJ.
  3. Abra o plugin MTrackJ (o plugin deve ser baixado e instalado separadamente): Plugins > MtrackJ.
  4. Adicione uma faixa de células única escolhida do vídeo clicando na guia "Add" na barra de MtrackJ. Escolher um celular na ponta do fronte invasivo e uma célula que pode migrar por conta própria (célula única migração). Siga o movimento das células escolhidas no vídeo e localizá-los usando o MtrackJ.
  5. Medir a distância de movimento, clicando na guia "medida" na barra de ferramentas.
    Nota: Aqui, quase não há células no siControl mudou-se como células únicas, tornando difícil de medir o movimento de célula única, Considerando que muitas das células siTIP60 mudou-se como células únicas. No entanto, o movimento de células localizadas na parte dianteira invasiva pode ser rastreado e calculado em células tanto siControl e siTIP60.
  6. Salve o vídeo com as faixas em formato AVI.

7. quantificação da capacidade de migração celular

  1. Para a quantificação, selecione imagens às 0h e a h "n", "onde n" refere-se a commit quando o siTIP60 ou o siControl células completamente fecharam a ferida.
    Nota: Aqui, 48 h foi escolhido, como as feridas nas células siTIP60 foram quase completamente fechadas.
  2. Quantificar a porcentagem migração usando o ImageJ usando a seguinte fórmula: (área de ferida às 0h - área da ferida com "n" h) / área da ferida às 0 h x 100.

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Resultados

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Esquema geral do ensaio de migração ao vivo-célula célula baseada em imagem
Figura 1A é uma esquema do presente protocolo. MCF10A células transfectadas com siControl mostrou a morfologia epitelial típica. Após o esgotamento de TIP60, MCF10A células eram mais mesenquimais em comparação com células de controle (figura 1B).

Exame de eficiência "...

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Discussão

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É sabido que, no processo de migração celular, células podem qualquer movimento em forma de folhas aderentes; clusters de soltos; ou células única, isoladas. O modo e a dinâmica de invasão celular podem variar de um estado para outro, e o fenótipo pode mudar dentro de horas. O tradicional ensaio de cicatrização de feridas é baseado no instantâneo fotos tiradas de um microscópio com um intervalo de tempo, como 12 ou 24 h. Isto torna difícil capturar a dinâmica de fechamento da ferida e o padrão dos movimentos da célula.

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

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Agradecemos os membros do laboratório Jai de sua discussão útil e comentários. S.J. foi apoiado por subsídios desde a Fundação de pesquisa nacional de Singapura e o Ministério da educação de Cingapura sob seus centros de pesquisa da iniciativa de excelência para o câncer ciência Instituto de Singapore (R-713-006-014-271), a médica nacional Conselho de pesquisa (CBRG-NIG; BNIG11nov001 e CS-IRG; R-713-000-162-511), o fundo de pesquisa acadêmica do Ministério da educação (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. e C.Y.T. foram apoiados por uma bolsa de pós-graduação pelo Instituto de ciência da câncer de Cingapura, Universidade Nacional de Cingapura.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Célula MCF10AATCCCRL-10317TMCélula epitelial da mama
Mídia DMEM/F12 (1:1)Gibco11330-032Mídia de cultura MCF10A
Fator de crescimento epitelial (EGF)PeprotechAF-100-15Suplementos para mídia de cultura MCF10A
Toxina da cóleraSuplementos Sigma-AldrichC-8052para mídia
de cultura MCF10ASuplementos de hidrocortisonaSigma-AldrichH-0888para meios de cultura MCF10A
InsulinaSigma-AldrichI-1882Suplementos para meios de cultura MCF10A
Soro domésticoGibco16050-122Suplementos para meios de cultura MCF10A
TripsinaGibco25200-056Para MCF10A desprenda da placa
HemacitômetroFisher Scientific267110Para contagem de células
Opti-MEM meios de soro reduzidosGibco31985-070Para mistura de siRNA
Lipofectamina RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies56532Reagente Transfect
Reagente TrizolInvitrogen/Life Technologies15596-026Para extração de mRNA
Kit de Síntese de cDNA iScriptBio-Rad170-8891Para cDNA geração
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5125Para qPCR em tempo real
7500 Sistema de PCR em tempo realBiosystemsMequina qPCR em tempo real
10 cm pratoGreiner bio-one664160Para experimento de knockdown
placa de 24 poçosCellstar662160Para ensaio de cicatrização
de feridas siControl siRNASelf projetadoAuto-projetadoCGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNAAuto-projetadoAuto-projetadoUGAUCGAGUUCUCAGCUAUGAdTdT
Observador de células vivasZeissZeiss Observador de células invertidas para experimentos de células vivas

Referências

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