O objetivo do protocolo é preparar o hidrolisado de queratina de penas de galinha por hidrólise alcalina-enzimática e testar se adicionando hidrolisado de queratina em uma base de pomada de cosméticos melhora a função de barreira da pele (aumentando a hidratação e diminuindo a perda de água transepidermal). Os testes são realizados em homens e mulheres voluntários.
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Artigo de método
Preparação de hidrolisado de queratina de penas de galinha e sua aplicação em cosméticos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Hidrolisado de queratina (KHs) é componentes padrão estabelecido em cosméticos de cabelo. Entender os efeitos hidratantes do KH é vantajoso para cosméticos de cuidados com a pele. Os objetivos do protocolo são: (1) para processar o penas de galinha em KH por hidrólise alcalina-enzimática e purificá-la pela diálise e (2) para testar se adicionar KH em uma base de pomada (OB) aumenta a hidratação da pele e melhora a função de barreira da pele, diminuindo perda de água transepidermal (TEWL). Durante a hidrólise alcalina enzimáticos penas primeiro são incubadas a uma temperatura mais elevada em um ambiente alcalino e em seguida, sob condições suaves, hidrolisadas com enzima proteolítica. A solução de KH é diálise, vácuo seco e moído a um pó fino. Formulações cosméticas, compreendendo de óleo em emulsão de água (O/W) contendo 2, 4 e 6% do peso de KH (com base no peso do OB) estão preparados. Testar as propriedades hidratantes do KH é efectuado em 10 homens e 10 mulheres em intervalos de 1, 2, 3, 4, 24 e 48 h. testado formulações estão distribuídas em locais de antebraço volar desengordurados. A hidratação do estrato córneo (SC) é avaliada pela medição da capacidade da pele, que é um dos métodos usados e simples mais todo o mundo. TEWL baseia-se na medição da quantidade de água transportada por uma área definida e o período de tempo da pele. Ambos os métodos são totalmente não-invasiva. KH faz para uma excelente oclusiva; dependendo a adição de KH no OB, ela traz uma redução de 30% em TEWL após a aplicação. KH também funciona como um umectante, como liga-se água de camadas inferiores da epiderme para a SC; com a adição de KH ideal no OB, se para 19% aumento da hidratação em homens e 22% ascensão nas mulheres ocorre.
Introdução
A indústria de curtumes, indústria alimentar e matadouros anualmente produzem imensas quantidades de subprodutos sólidos queratina – lã, penas, cerdas, cascos, garras, chifres e afins. De acordo com dados estatísticos mais recentes, o peso total de galinhas, perus, patos e outras aves abatidas nos EUA é 62,5 bilhões de libras por ano1; na União Europeia é aproximadamente 28,7 bilhões libras por ano. Considerando que as penas fazem até 8,5% do peso total das aves domésticas, os EUA sozinho produz anualmente aproximadamente 5,3 bilhões quilos de resíduos penas2.
Queratina é uma proteína que exibem alta resistência química, porque é fortemente reticulado com pontes dissulfeto que processam seu processamento difícil. Obtenção de produtos solúveis requer a clivagem de ligações cruzadas e possivelmente realizando a hidrólise das ligações peptídicas3. Clivagem das pontes dissulfeto pode proceder por meio de uma reação do ânion tiol de acordo com o seguinte padrão de4,5:
Sum– + – SbSc– ↔ – Sb– + – SaSc–
Com um nível muito elevado de pH, hidrólise das pontes dissulfeto também aparece, em conformidade com o padrão6
-SS– + → de OH– –– S + -SOH
Sob condições suaves (pH aproximadamente 8), até mesmo sulfitolysis se realiza de acordo com o seguinte padrão:
– SS – + HSO3– → – SH + SSO –3–
A forma mais econômica de degradar queratina é degradação microbiana, que se caracteriza por condições de reação suave durante processamento e alta repartição eficiência (ca. 90%)7,8. Keratinases são produzidas por algumas bactérias isoladas de solo e queratina resíduos9. Keratinases microbianas da hidrolise de estruturas rígidas e fortemente reticulado queratina10 e o KH resultante preparado é rico em proteínas solúveis, sem perda de aminoácidos essenciais detectado nele11.
A fim de incorporar uma proteína em preparações cosméticas (por exemplo, emulsões, loções e géis), os requisitos assegurem que tais proteínas são solúveis em água, os sistemas determinados são transparentes e que re-agregação dos peptides é evitada devido a interações hidrofóbicas. Portanto, uma prática comum é aplicar hidrolisados de proteínas, como colágeno hidrolisado, elastina e queratina. Ao adicionar hidrolisados em emulsões cosméticas, sejam tomadas medidas para assegurar que o hidrolisado primeiro é dissolvido em água. Em alguns casos, é desejável que a proteína (ou hidrolisado) é solúvel em álcool ou outros solventes orgânicos12.
KH é normalmente caracterizado em xampus, condicionadores, loções e soros nutritivos para o cabelo, bem como mascaras, unha polonês e agentes de maquiagem do olho. Os efeitos KH declarados geralmente incluem formando uma película protetora, alisando o cabelo ou unha estrutura, elevada plasticidade e aparência da formação tratada, regulando a consistência dos produtos e incentivando a formação de espuma13 , 14. também tem sido demonstrado que o KH reduz a tensão superficial, portanto, suplementação em cosméticos pode facilitar a redução na quantidade de emulsificante adicionado para estabilizar os cremes. KH limitar os efeitos da irritação provocada por detergentes (surfactantes) para a pele, olhos e cabelos, reduzindo assim os efeitos colaterais potenciais de detergente sobre o tecido (por exemplo, a desidratação da pele, dureza e função de diminuição da barreira de a pele). A alta capacidade de armazenamento em buffer de hidrolisados também é explorada para estabilizar o pH dos produtos cosméticos; peptídeos de menor comprimento têm um maior buffer efeito15,16. KHs se estabeleceram como componentes padrão no cabelo e cosméticos de unhas bem como sendo utilizado em produtos para cuidados com a pele, estudos sobre os efeitos hidratantes do KH não aparecem na literatura contemporânea.
Alcalino-enzimático tecnologia foi desenvolvida para o processamento de subprodutos de queratina em KH, e teste ativo está em processo sobre os efeitos de uma série de aditivos cosméticos17,18,19,20 , 21 , 22. a vantagem de dois estágios de hidrólise alcalina-enzimática usando proteases microbianas para penas de galinha atinge alta eficiência sob condições de reação suave e a qualidade do KH é muito elevada em contraste com a hidrólise empregada em ácidos fortes ou alcalinos. Na primeira fase, as penas são incubadas a uma temperatura mais elevada em um ambiente alcalino, que parcialmente interrompe a estrutura de queratina e incha as penas; Depois de ajustar o pH, as penas são hidrolisadas com uma enzima proteolítica em condições suaves na segunda fase. O KH dializado possui um alto teor de proteínas.
Efeitos do método descrito aqui são penas de aves de capoeira de processamento em um KH através de hidrólise alcalina-enzimática e testar o efeito das propriedades hidratantes de KH aplicada à cosmética emulsão O/W. As propriedades hidratantes são investigadas por métodos não-invasivos instrumental na vivo. Os métodos mais frequentes para medir a função de hidratação e barreira de pele de SC incluem medição de propriedades elétricas da pele (condutância ou capacitância). Diferentes métodos para investigar hidratação SC incluem perto método imaginando multiespectral infravermelho (NIM), espectroscopia de ressonância magnética nuclear, tomografia de coerência óptica ou transferência térmica transiente23. Função de barreira de SC se correlaciona com a TEWL de SC e é medido pelo método de câmara ventilada, método de câmara sem ventilação e câmara aberta método24.
Propriedades das formulações modelo são determinadas usando o sonda Multi adaptador 5 MPA com três tipos de sondas. A primeira coisa, corneometer CM 825, medidas da pele hidratação avaliando alterações na capacidade elétrica da superfície da pele; o capacitor de medição mostra alterações na capacidade da superfície da pele em unidades de corneometric. O corneometer dá apenas uma avaliação relativa da pele hidratação25. Para TEWL, a segunda sonda, tewameter TM 300, é usada para medir o gradiente de densidade de evaporação de água (em um instrumento de câmara aberta com base na lei de Fick difusão) da pele indiretamente por dois pares de sensores (temperatura e umidade relativa) indicando a quantidade de água transportada por uma área definida e o período de tempo (g/m2/h). Este método pode detectar até mesmo a menor perturbação do de função de barreira da pele26. O pH da pele é um indicador da barreira e função antimicrobiana do SC27. A acidez do manto da pele foi medida por uma sonda de pele PH 905 (terceira) conectada à estação 5 MPA. Esta sonda especialmente projetada consiste de um eletrodo de vidro achatadas para contacto com a pele cheia, ligado a um voltímetro. O sistema de medidas possíveis alterações devido à atividade de cátions hidrogênio em torno da camada muito fina de formas semi-sólidas medido no topo da sonda. As alterações na tensão são exibidas como pH28.
Apresentamos experiências divididas em três seções: (1) preparação do KH de galinha penas por duas etapas hidrólise alcalina-enzimática e sua purificação pela diálise (remoção de sais e frações low-molecular), (2) preparação de cosméticos formulações contendo 2, 4 e 6% KH e (3) testar as propriedades de KH medindo pele, TEWL e a hidratação da pele pH. Testes foi realizado em 10 mulheres com idade média de 27,2 anos e em 10 homens com idade média de 26,2 anos. O método de seleção dos voluntários e os testes em si foram conduzidos em conformidade com os princípios éticos internacionais de investigação biomédica utilizando cobaias humanas29; todas as pessoas que deram seu consentimento antes da inclusão no estudo. Antes de testar iniciou, os voluntários foram convidados a preencher um questionário sobre seu estado de saúde. Os voluntários comprometidos com a Evite aplicar qualquer produto cosmético para os sites de teste e regiões circundantes, durante as 24 horas antes e durante o período de teste; Além disso, foram permitidos somente breve noite lavagens com água corrente.
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Protocolo
Voluntários foram recrutados entre os funcionários e estudantes da nossa Universidade. O método de seleção foi conduzido de acordo com "as diretrizes éticas internacionais para biomédica pesquisa envolvente cobaias humanas. Conselho para organizações internacionais de ciências médicas, Genebra (2002)." KH é um ingrediente cosmético comum usado em produtos para cabelos (xampus, condicionadores, etc.) e, portanto, não é necessária a aprovação do Conselho de revisão institucional.
1. processo de penas de galinha em KH
- Colete penas de galinha de uma granja.
- Lave quaisquer impurezas insolúveis e restos de sangue das penas de galinha com um excesso suficiente de água fresca em execução (frio). Coloque as penas em uma placa plana e seca durante a noite a 50 ° C.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. - Moer 50 penas g secas em um moinho de corte (apropriado para materiais macios de dureza média da amostra e materiais fibrosos) em uma finura final de 1,0 mm. em alternativa, a finura final de penas moídas pode ser mais alto, mas não mais de 3,0 mm.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. -
Desengordurar as penas
Nota: O método mais eficaz e económico de desengorduramento de penas de aves de capoeira é usando uma enzima lipolítica comercial.- Em um recipiente de 27-L caldeira de aço inoxidável com controle de temperatura, misture as penas com água pré-aquecida até 40 ± 2 ° C em um 1:75 de relação de peso. Adicionar uma enzima lipolítica (atividade 100 KLU/g) em uma dose de 1,5-2,0% (relacionadas com pesados-em penas secas) e suavemente agitar o conteúdo com um agitador sobrecarga por 5 min.
- Ajuste o pH da mistura de 9,0 ± 0,2, o valor correspondente para a atividade máxima da enzima lipolítica adicionando NaOH ou 1% H3PO4 solução a 1%. Agitar a mistura por 5 min com um palito, sobrecarga e em seguida, verifique e re-ajustar o nível de pH usando um medidor de pH/mV de bancada de laboratório.
- Suavemente agitar a mistura com um agitador sobrecarga por 24 h a 40 ± 0,5 ° C. Alternativamente, incubar a mistura a 40 ± 0,5 ° C e durante as primeiras 6 horas de incubação, mexa o conteúdo em intervalos de 1 h.
- Filtrar a mistura por uma peneira fina (tamanho de 100 µm) e lavar as penas desengorduradas com um fluxo de água doce (frio) em execução. Seca as penas em uma placa plana a 50 ° C em uma câmara de secagem durante a noite.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
- Realize a primeira fase da hidrólise de penas de galinha. Misture as penas com solução de água KOH de 0,3% em um peso proporção 01:50 e mexa delicadamente com um agitador superior a 60 ± 0,5 ° C por 24 h. O pH da mistura diminui de aproximadamente 12,5 no início da incubação de aproximadamente 11,0 no final da incubação. Depois de terminar a primeira fase de hidrólise, ajustar o pH da mistura para o nível correspondente à atividade máxima da enzima proteolítica com 10% H3PO4 (neste caso, a um nível de 9,0 ± 0,2) pela adição de 1% de NaOH.
- Realize a segunda fase da hidrólise de penas de galinha. Adicione à mistura, a enzima proteolítica em uma dose de 5,0% (relacionados à matéria seca, da quantidade de penas pesadas-no início da primeira fase da hidrólise). Suavemente agitar com um agitador superior a 60 ± 0,5 ° C para 8 h aquecer a mistura (no mesmo recipiente 27-L caldeira aço inoxidável) para um ponto de ebulição (100 ° C) e deixe ferver por 10 minutos para inativar a enzima.
- A solução de KH (preparado na etapa 1.6) separar o remanescente não dissolvido por filtragem através de papel de filtro de baixa densidade em um funil de Buchner com ligeira pressão-vácuo; Como alternativa, use uma centrífuga.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por vários dias se uma solução de KH é armazenada a 5 ± 1 ° C. - No balde de plástico (26 cm de diâmetro x 26 cm de altura) Dialize o KH utilizando membrana MWCO 12K para remover sais e pequenos peptídeos. Despeje 400 mL da solução de KH na tubulação da diálise e Dialize ele contra 4 L de água destilada para 80 h à temperatura ambiente; Mude a água destilada após 18, 36 e 60 h.
- Converter uma solução dializada de KH em um prato de antiadesivo (por exemplo, silicone) na proporção de 500ml para 1.000 cm2 placa área, vácuo seco em uma película fina a 40 ± 0,5 ° C durante a noite, moer para formar um pó fino e mantê-lo em um recipiente fechado num exsicador.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por vários meses se o pó KH é armazenado num local seco.
2. preparar formulações cosméticas com KH
Nota: Usado para testar o OB era uma base comercial de O/W creme hidrófila e composto de aqua, parafina, parafina líquido, cetearyl álcool, Laureth 4, hidróxido de sódio, carbomer, metilparabeno e propilparabeno.
- Preparar formulações contendo 2, 4 e 6% KH (de acordo com o peso de base da pomada). Pesar a quantidade de pó KH dentro de um vaso de polietileno (7 cm de diâmetro x 10 cm de altura) e adicionar o OB pelo montante que garante que o peso total da formulação é igual a 50 g; Veja a receita no quadro 1.
| Formulação de cosmética | Peso de pomada base [g] | Peso do hidrolisado de queratina [g] | Peso total [g] | |||||
| Pomada de base | 50 | 0 | 50 | |||||
| Pomada de base + 2% KH | 49 | 1 | ||||||
| Pomada de base + 4% KH | 48 | 2 | ||||||
| Pomada de base + 6% KH | 47 | 3 | ||||||
Tabela 1: Peso-em quantidades de hidrolisado de base e queratina pomada para preparar formulações cosméticas.
- Homogeneizar a mistura com um liquidificador de 3 lâminas de laboratório por 10 min a 134.16 x g e misture utilizando um agitador de sobrecarga mecânico. Manter as formulações preparadas a 5 ± 1 ° C e aquecê-los em temperatura ambiente por 2 h antes da utilização.
Nota: Homogeneizando a mistura de OB com KH pode ser feito com um palito, não-digital também. Num agitador não-digital, existem escalas com a velocidade aproximada (em rpm) também. Agitação suave vai funcionar melhor para esta etapa.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por até 5 meses se as formulações são armazenadas em 5 ± 1 ° C.
3. testar as propriedades de KH por medição de hidratação da pele, TEWL e pH
Nota: Realizar todas as medições em um quarto climatizado a 23 ± 2 ° C e a umidade relativa de 56 ± 3%.
- Lugar 5 tiras de papel de filtro (tamanho 2 x 4 cm) na solução fisiológica (0,90% NaCl) e deixá-los por aproximadamente 1 minuto na solução.
- Aplicar duas tiras para o lado interno do antebraço direito e três para o lado interno do antebraço esquerdo e corrigi-los para 4h com esparadrapos. Esta etapa é para desengordurar a pele e eliminar as características individuais da pele no local. Após 4 h, remover as tiras e demark as áreas com uma caneta permanente, veja a Figura 1.
Figura 1: método para localização de formulações de teste no antebraço dos membros superiores direito e esquerdos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Aplicar 0,1 mL das formulações testadas em cada local dos sites desengordurados antebraço utilizando seringas e espalhe-o sobre toda a superfície marcada. No antebraço esquerdo, não aplicar nada para o primeiro site (é o controle), aplicar o OB para o segundo local e o OB + 2% KH para o terceiro. Aplicar o OB + 4% KH e OB + 6% KH no braço direito.
- Medir cada amostra em cada local e cada intervalo (1, 2, 3, 4, 24 e 48 h) e tirar 5 leituras com a sonda de medidor de hidratação da pele para a hidratação da pele, 15 leituras com a sonda do medidor TEWL para pele TEWL e 1 leitura com a sonda de medidor de pH da pele para o pH da pele. Não permitir que voluntários aplicar qualquer produto cosmético para os sites de teste e áreas adjacentes durante o período de teste; Eles são permitidos breve noite lavagens com água corrente.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. - Processe as leituras resultantes por características de base numéricas das estatísticas descritivas, usando software de planilha eletrônica. Das 5 hidratação leituras medidas para cada amostra, ignorar as menores e as leituras mais altas e calcular apenas 3 leituras para a média aritmética e desvio-padrão. Das 15 TEWL leituras medidas para cada amostra, ignorar os 5 primeiros e calcular apenas 10 leituras para média aritmética e desvio-padrão.
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Resultados
O KH preparado de acordo com o procedimento aqui apresentado (ver Figura 2) é amarelo na cor, facilmente solúvel em água com teor elevado de proteínas (sólidos inorgânicos representam < 2.0%); o pH da solução 1,0% de KH é 5.3 e preenche os requisitos para hidrolisados de grau cosmético. O rendimento do KH de 50 g de matéria-prima é aproximadamente 30%. A distribuição de peso molecular de KH foi determinada por SDS-PAGE e é mostrada na Fig...
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Discussão
A vantagem de hidrólise alcalina-enzimática é que ele pode ser modificado de acordo com as aplicações futuras do KH. Por exemplo, em aplicações de cosméticos capilares onde uma cor levemente acastanhada de um produto não é um obstáculo, uma temperatura mais elevada na hidrólise pode ser aplicada levando a um maior rendimento de KH. Além disso, o tempo de processamento durante as duas fases do processo tecnológico significativamente afeta o processo global de eficiência – rendimento de KH sobe para 85%.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este artigo foi escrito com o apoio do projeto IGA/FT/2017/007 de Tomas Bata Universidade em Zlin.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material ou produtos químicos | |||
| LIPEX 100T | Novozymes | LJP30020 | Lipex - enzima produzida por fermentação submersa de um microrganismo geneticamente modificado, atividade 100 KLU/g |
| Savinase Ultra 16L | Novozymes | PXN40001 | Savinase - enzima produzida por fermentação submersa de um microrganismo geneticamente modificado, atividade 16 KNPU-S/g |
| Hidróxido de potássio, KOH | Sigma-Aldrich | 302510289 | Hidróxido de potássio, KOH, 97,0 %, Mr 56,11 |
| Solução de ácido fosfórico, H3PO4 | Sigma-Aldrich | W290017 | Solução de ácido fosfórico, H3PO4, concentração de 85 % em peso em água, Mr 98,00 |
| Solução fisiológica de cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | 52455 | Comprimidos de solução fisiológica de NaCl BioUltra; 1 comprimido em 1000 mL de água produz 0,9% de NaCl |
| Hidróxido de sódio, NaOH | Penta s.r.o. | 40216 | Hidróxido de sódio, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00 |
| AmiFarm (Cremor base-A) | Fagron | 608425 | Óleo hidrofílico em água (O/A) à base de creme; a composição: água, parafina, parafina líquida, cetearil alkohol, Laureth 4, hidróxido de sódio, carbômero, metilparabeno, propilparabeno. |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| IKA EUROSTAR POWER agitadores de controle-visc | IKA-labortechnik | Z404020 | Agitador de laboratório digital, para tarefas até a faixa de alta viscosidade, 230V, 1/cs |
| IKA Agitador de hélice, 3 pás | IKA-labortechnik | R 1381 | Agitador de hélice, 3 pás, agitador Ø: 45 mm, eixo Ø: 8 mm, comprimento do eixo: 350 mm |
| Tampas de tubos de diálise | Sigma-Aldrich | Z371017-10EA | Tampas de tubos de diálise, vermelho, tamanho 110 mm |
| Tubo de diálise membrana de celulose | Sigma-Aldrich | D9402-100FT | Membrana de celulose para tubos de diálise, largura plana média de 76 mm (3,0 pol.) |
| DOMO Panela com inox | DOMO Elektronic | DO42325PC | Caldeira de conservação em aço inoxidável, 2000 W, recipiente de 27 L (diâmetro 37 cm, altura 30 cm), controle de temperatura 30-100 &graus; C, operação Visor LCD |
| Hettich zentrifugen Universal 32 | Gemini bv | 2770 GS1R | Centrífuga de bancada intermediária, velocidade 18000 rpm |
| LT 3 dispositivo de agitação | Fischer Scientific | 6470.0002 | Dispositivo de agitação orbital |
| KERN 440-47N | Kern | 440-47N | Balança de laboratório |
| KERN 770 | Kern | 770 -N | Balança analítica de laboratório |
| VENTICELL 222 - Komfort | BMT, MMM Grupo | C 131749 | Forno de secagem, controle de temperatura 30-100 > C, controle de circulação de ar |
| Vacucell 55 - EVO | BMT, MMM Grupo | B 050328 | Forno de secagem a vácuo, controle de temperatura 30-100 > C |
| PULVERISETTE 19 | Fritsch | 19.1030.00 | Moinho de corte universal, rotor com arestas de corte em V e facas fixas |
| Sistema Adaptador de Sonda Múltipla MPA 5 | Courage & Kazaka Electronic | 10225237 | MPA 5 Station - equipamento para medição de hidratação, TEWL e pH |
| Medidor de pH da pele Sonda PH 905 | Courage & | para medir especificamente o pH na superfície da pele ou no couro cabeludo | |
| Sonda Corneometer CM 825 | Courage & | para determinar o nível de hidratação da superfície da pele (Estrato córneo). | |
| Tewameter TM 300 | Coragem & Sonda eletrônica | Kazaka para avaliação da perda de água transepidérmica (TEWL) | |
| Heidolph RZR 2020 | Heidolph | 13-225-007-03-1 | Agitador suspenso, ajuste mecânico de velocidade e transmissão contínua; faixa de velocidade 40-2000 rpm |
| Agitador mecânico Heidolph BR 10 | Heidolph | Z336688-1EA | Rotor de lâmina agitador cruzado |
| Fagor FS 12 | Fagor | BTT-138 | Frigorífico de laboratório com espaço de congelação |
| WTW bench medidor de pH/mV | WTW | Z313165 | Medidores de pH e pH/condutividade de bancada de alto desempenho para medições laboratoriais de rotina e de alta precisão em laboratórios de investigação ou controlo de qualidade |
| Contentor | RPC Balde de plástico Superfos | 13-L, diâmetro 26 cm, altura 26 cm | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Software | |||
| Microsoft Office 2010 | Microsoft | ||
| C+K software | Courage e Khazaka Electronic GmbH | MPA 5 station operating software |
Referências
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