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Construção e avaliação de um modelo murino de osteólise raspagem pela exposição a partículas de CoCrMo no afrouxamento asséptico

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DOI:

10.3791/56276

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17 de fevereiro de 2018

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1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um modelo murino de osteólise raspagem por exposição a partículas CoCrMo, que constitui um modelo animal ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células no afrouxamento asséptico.

Resumo

A osteólise induzida por partículas de desgaste é a principal causa de afrouxamento asséptico em artroplastia falha, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro. Devido ao tempo de follow-ups necessário para a detecção e a ocorrência esporádica, é difícil avaliar a osteólise induzida por ofparticle de patogênese em casos clínicos. Daí, modelos animais ideais são necessários para estudos adicionais. O modelo murino de raspagem osteólise estabelecido pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta eficaz e válida para avaliar as interacções entre partículas e várias células no afrouxamento asséptico. Neste modelo, partículas CoCrMo primeiro foram obtidas por alto vácuo três-elétrodo corrente e resuspended em tampão fosfato salina em uma concentração de 50 mg/mL. Em seguida, 50 µ l da suspensão resultante foi aplicado para o meio do calvaria murino após o ponto de separação entre o periósteo craniana por dissecação. Depois de duas semanas, os ratos foram sacrificados e calvaria foram colhidas; avaliações qualitativas e quantitativas foram realizadas pela hematoxilina e eosina manchando e micro computadorizada. Os pontos fortes deste modelo incluem a simplicidade do procedimento, avaliação quantitativa da perda óssea, rapidez de desenvolvimento de osteólise, potencial uso de transgénico ou modelos de nocaute e um custo relativamente baixo. No entanto, este modelo não para ser usado para avaliar a força mecânica e efeitos crônicos de partículas no afrouxamento asséptico. Modelo murino osteólise raspagem gerado pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células, por exemplo, macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, no afrouxamento asséptico.

Introdução

Afrouxamento asséptico é a causa mais comum de artroplastia total de quadril (THA) e falha de total de joelho (ATJ) de artroplastia, que requer cirurgia de revisão1. No entanto, o mecanismo subjacente permanece incerto2. Um seguimento longo é necessário para detectar a osteólise induzida por partículas, cuja ocorrência é rara; Portanto, é um desafio para explorar sua patogênese em casos clínicos. Daí, mais estudos focando mecanismos celulares e tecidos complexos requerem que ambos experimentos na vivo em usam modelos de osteólise induzida por partículas e ensaios em vitro em células relacionadas ao osso homeostase3. Um válido modelo animal é importante para revelar os efeitos de partículas de desgaste na perda óssea, fornecendo evidências para mais celulares ensaios.

Um modelo murino de osteólise raspagem construído pela exposição a partículas CoCrMo é um método eficaz e válido para avaliar as interacções entre partículas e várias células no afrouxamento asséptico. Neste modelo, CoCrMo partículas causam osteólise raspagem por indução de citocinas inflamatórias em macrófagos, ativação de osteoclastos, inibindo a proliferação de osteoblastos e promover apoptose de osteoblastos.

Apenas leva duas semanas para estabelecer esse modelo. Osteólise pode ser visualizada e quantificada por hematoxilina e eosina (H & E) coloração e micro computado tomografia computadorizada (micro-CT)2. Além disso, este modelo tem um relativamente baixo custo e transgênico e nocaute mouse modelos podem ser usados para um grande número de compostos em várias doses3de tela.

O procedimento para estabelecer e avaliar este modelo é simples. Primeiro, CoCrMo partículas foram obtidas por alto vácuo três-elétrodo corrente e resuspended em tampão fosfato salino (PBS), em uma concentração de 50 mg/mL. Em seguida, 50 µ l da suspensão resultante foi aplicado para o meio do calvaria murino após o ponto de separação entre o periósteo craniana por dissecação. Os ratos foram sacrificados após duas semanas, e foram colhidas amostras de calvaria; análises qualitativas e quantitativas foram realizadas por H & E mancha de andmicro-CT.

Um modelo murino de osteólise raspagem construído pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta ideal para avaliar as interações entre partículas CoCrMo e várias células, como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, no afrouxamento asséptico.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Nanjing e institucional Cuidado Animal.

1. CoCrMo partícula preparação

  1. Obter partículas CoCrMo usando um alto vácuo fabricadas três-elétrodo corrente4. Liga CoCrMo lugar no instrumento sob vácuo de Pa 10-3 , 0,04 MPa argônio e hidrogênio 3:2 (v/v) e 650 cátodo A atual.
  2. Medir os diâmetros das partículas CoCrMo.
    1. Adicione 1 mg de CoCrMo partículas em 1,5 mL de etanol anidro.
    2. Resuspenda CoCrMo partículas em etanol anidro por agitação ultra-sônica em 28 kHz e 600 W por 5 min.
    3. Aplique uma gota (cerca de 20 µ l) da suspensão resultante na tabela objetiva de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Capture a série de fotos TEM 200 kV tensão de aceleração e 0,24 resolução nm.
    4. Use o software fornecido para calcular a distribuição de tamanho de diâmetro e partícula média em micrografias TEM.
  3. Descontaminar endotoxinas
    1. 50 g de partículas por 15 min a 121 ° C e 15 libras por polegada quadrada de autoclave.
    2. Detecção de endotoxinas por um ensaio quantitativo de Limulus métodos Lysate (LAL) (< 0,25% EU/mL foi considerado para indicar a ausência de endotoxinas)5.
  4. Resuspenda as partículas em tampão fosfato salino (PBS), em uma concentração de 50 mg/mL como solução6.

2. construção do modelo de osteólise raspagem

  1. Anestesia a 6 semana de idade withpentobarbital de (seis ratos por grupo) de camundongos C57BL/J6 (50 mg/kg). Use o teste do beliscão para avaliar o nível de anestesia. Evitar a secagem dos olhos com soro fisiológico normal.
  2. Coloque os ratos de bruços. Retire a pele sobre o crânio com uma máquina de barbear e desinfectar a pele usando bolas de algodão médico contendo 75% de etanol.
  3. Para a localização do ponto, identifica dois pontos, incluindo os pontos médios entre os dois olhos e ouvidos, respectivamente. Em seguida, determinar a linha entre as duas acima pontos e faça uma incisão na pele ao longo da linha acima com uma tesoura (figura 1A).
  4. Remova o periósteo craniano a calvaria com um bisturi (figura 1B)6.
  5. Sutura de pele em ambas as extremidades com sutura interrompida simples.
  6. Faça uma linha de sutura no meio da incisão sem atar. Segure as duas extremidades da linha de sutura.
  7. Incorpore 50 µ l de suspensão de partículas de CoCrMo (50 mg/mL, em PBS) no meio do calvarias (Figura 1)2.
  8. Nó o último ponto dentro simples sutura interrompida (Figura 1).
  9. Manter os ratos por mais 2 semanas.

3. avaliação do modelo de osteólise raspagem por Microtomografia

  1. Sacrifica os ratos com dióxido de carbono. Decapitar os ratos no plano horizontal. Remova o tecido de cérebro no interior e a pele e pelo do lado de fora. Colha o calvarias para novas experiências.
  2. Limpe suavemente todo o tecido mole sobre o calvaria com uma pinça. Corrigi o calvarias apuradas em paraformaldeído 4% a 4 ° C por 24 h. mergulhar o calvarias em PBS 24 h antes de micro-CT varredura.
  3. Analisar o calvarias de ratos por micro-CT de alta resolução com uma resolução isométrica de 18 µm e as configurações de energia de raios-x de 45 kV e 550 mA.
  4. Realizar a reconstrução tridimensional de dados micro-CT com o software.
  5. Qualitativa e análise quantitativa.
    1. Primeiro, selecione a região quadrada ao redor da sutura mediana como a região de interesse.
    2. Em segundo lugar, medir a densidade mineral óssea (DMO), volume/total de osso volume (BV/TV), número trabecular (Tb.N), espessura trabecular (Tb.Th), separação/espaçamento trabecular (Tb.Sp) e percentual de porosidade total com o software fornecido para micro-CT.
    3. Em terceiro lugar, compare os três grupos para várias medições por One-Way ANOVA. Para post-hoc de análise de variância, aplica o método de Bonferroni2.

4. avaliação do modelo de osteólise raspagem pela coloração H & E

  1. Descalcificar amostras de calvaria em 15% ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-PBS a 4 ° C. Modificar a solução de descalcificação a cada dia por 3 semanas.
  2. Incorporar as amostras descalcificadas em parafina para um 2 x 1 cm x 1 cubo de cm e corte-os em 2 seções de µm na área de deposição de partículas.
  3. Manchar as seções com hematoxilina e eosina conforme descrito anteriormente7.
  4. Capture o micrografias do pathomorphism global por microscopia de luz.

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Resultados

As partículas de CoCrMo in-house nanoescala produzidos foram em torno de 50 nm (erro padrão de 3,56) de diâmetro, conforme quantificada pela TEM (Figura 2). Após a exposição do rato calvarias a CoCrMo partículas, os animais (n = 6 por grupo) foram mantidas por mais duas semanas. Dentro de duas semanas, a incisão raspagem foi completamente curada, e a sutura pode cair. Qualquer infecção local ou pseudartrose maio afetam a avaliação de perda óssea. Após o sacri...

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Discussão

Há dois métodos principais para a osteólise induzida por partículas de desgaste em ratos: o modelo de ar-bolsa e o modelo de osteólise raspagem. No modelo de bolsa de ar, uma bolsa de ar gerada por via subcutânea é estabelecida, seguido pela introdução de partículas de desgaste e implantação para o osso tecido8. A parede da bolsa imita o periósteo no afrouxamento asséptico. No entanto, a implantação de osso é nonvascular sem nenhuma atividade biológica, o que torna difícil avaliar interações diret...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81572111), clínica de ciência e tecnologia projeto Fundação da província de Jiangsu (BL2012002), projeto de pesquisa científica de Nanjing (201402007), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20161385) e a Fundação especial da Associação médico chinês (2015COS0810).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Liga CoCrMo de próteseWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIMatéria-prima para obter nanopartículas de CoCrMo
Fabricado de corrente contínua de três eletrodos de alto vácuoFaculdade de Ciência dos Materiais e Engenharia, Universidade deRatos
C57BL/6J machos de 6 semanas de idadede pesquisa animal modelo da Universidade de NanjingN000013
100% de etanolReagente de NanjingC0691514023Solvente de nanopartículas de CoCrMo para varredura de microscópio eletrônico de
transmissão Tubos de microcentrífuga de 1,5 mlTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW603
Balança microanalíticaShenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. Instrumentodo LTD EX125DZH
., LTDYH-200DHnanopartículas de CoCrMo
Software Compix
Inc.Versão 6.6Para calcular o diâmetro médio e a distribuição do tamanho das partículas.
Panela de esterilização de alta mãoQIULONGYIQIKYQL-100DSPara descontaminar endotoxina
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) EnsaioCharles RiverR13025Para detectar endotoxina 
Tubos de microcentrífuga de 15 mlTaizhou Suyi MedicalB122
Solução salina tamponada com fosfatoBoster Biological TechnologyAR0030Solvente de solução de estoque de nanopartículas de CoCrMo
Pentobarbital SódioSigmaP3761Para anestesiar camundongos
Solução salina normalSACKLERSR8572EP-15Para evitar o ressecamento dos olhos dos camundongos
75% EtanolNanjing ReagenteC0691560275Desinfecção
Bola de algodão médicaShuitao1278298933Disinfecção
BarbeadorKemeiKM-3018Para raspar a pele
TesouraRWD LIFE SCIENCES12005-10Para incisar a pele
SuturaRWD LIFE SCIENCEF34001-01Para suturar a pele
Porta-agulhaRWD LIFE CIÊNCIAF33001-01Para suturar a pele
AgulhaRWD LIFE SCIENCER14003-12Para suturar a pele
Pinça de vasoRWD LIFE SCIENCEF22003-09Para suturar a pele
BisturiRWD LIFE SCIENCES31010-01Para colher pinças de calvária
RWD LIFE SCIENCEF12006-10Para colher calvária
100 µ L pipetasEppendorf3120000240Para embutir partículas suspensão nas calvatias
100 µ L pontas de pipetaAXYGENT-200-YPara incorporar partículas suspensão nas calvatias
5 ml MicrotubosTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% ParaformaldeídoServicebioG1101Fixação
Micro Tomografia Computadorizada SkyScanSkyScan1176
Ácido Etileno Diamina TetracéticoServicebioG1105Parafina de Descalcificação
Servicebio#0001
Máquina de fatiar parafinaLeicaRM2125RTS
Lâmina de vidroServicebioG6004
Vidro de coberturaServicebio200
Kit de coloração HEServicebio#1-5Coloração HE
Microscópio ópticoNikonE200
Nanjing Centro científico co de Shanghai Yuhao do abanador ultrassônico para suspender o microscópio eletrônico da transmissão das de Digit

Referências

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