Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.
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Artigo de método
Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo terapêutico para a doença arterial periférica e doença isquêmica do coração é aumentar o fluxo sanguíneo em áreas isquêmicas causada por estenose hemodinâmica. Cirurgia vascular é uma opção viável em casos selecionados, mas para os pacientes sem indicações para cirurgia como progressão descansar a dor, isquémia crítica dos membros ou grandes perturbações à vida ou trabalho, há poucas possibilidades de mitigação de sua doença. Terapia celular através de perfusão monócito aprimorado através da estimulação da formação de colaterais é uma das algumas opções não-invasiva.
Nosso grupo examina arteriogenesis após transplante de monócitos em camundongos, usando o modelo de isquemia do membro posterior. Anteriormente, temos demonstrado melhora na perfusão do membro posterior usando o transplante de monócitos syngeneic tétano-estimulado. Além dos efeitos sobre a formação de colaterais, o crescimento do tumor poderá ser afectado por esta terapia também. Para investigar esses efeitos, utilizamos um modelo do rato de membrana basal, como matriz injetando a matriz extracelular do sarcoma Engelbreth-Holm-enxame no flanco do mouse, após a oclusão da artéria femoral.
Após os estudos de tumor artificial, usamos a microscopia intravital para estudar na vivo -vasculogênese e monócitos orientação dentro das artérias colaterais. Estudos anteriores descreveram o exame histológico de modelos animais, o que pressupõe análise subsequente para post-mortem artefatos. Nossa abordagem visualiza hospedagens de monócitos para áreas de collateralization em sequências de tempo real, é fácil de executar e investiga o processo de arteriogenesis e tumor angiogênese in vivo.
Introdução
Doenças cardiovasculares, incluindo doença coronariana ou doença arterial periférica, são as causas mais comuns de morte globalmente1. Terapia celular é uma abordagem promissora para tratar a doença cardiovascular, especialmente para pessoas que não são capazes de se submeter a intervenções cirúrgicas. Há várias abordagens para usar células ou as suas substâncias secretadas como uma ferramenta terapêutica2,3, com o objetivo geral de melhorar a perfusão e manter a função do tecido isquêmico e underperfused. Uma tentativa de atingir este objetivo é melhorar a arteriogenesis, o que aumenta....
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Protocolo
nosso estudo foi realizado com a permissão do estado de Saxônia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, de acordo com a seção 8 da lei alemã de proteção animal. (§ 8, n. º 1 da lei alemã de proteção animal de 18.05.2016 - BGBI. Eu s. 1206, 1313, § 31 de TierSchVersV de 13.08.2013).
Nota: para os experimentos aqui, 8 a 12 camundongos BALB/c machos de semana foram utilizados, e monócitos humanos de doadores de sangue foram utilizados para a visualização de monócitos através de microscopia intravital.
1. preparação da célula
Nota: para o isolamento de monócitos, por favor, veja noss....
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Resultados
A microscopia intravital para o exame do tumor e o crescimento de vasos colaterais desencadeada por monócitos pode ajudar a revelar novos aspectos nos mecanismos moleculares de vasculogênese e arteriogenesis. As células devem ser preparadas e injetado cuidadosamente usando as etapas do protocolo. Diferenças podem levar a variações entre experiências simples. Os monócitos devem ser injetados no sistema venoso (Figura 1) para manter efeitos sistêmicos e evitar .......
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Discussão
O método descrito aqui lança luz sobre o desenvolvimento das artérias colaterais, o comportamento de monócitos destes vasos e o processo de arteriogenesis. As etapas de aplicação do presente protocolo são fáceis de aprender e pode ser usado em outros campos da ciência. Apesar dessas vantagens, existem algumas desvantagens. Por exemplo, equipamento microscópico é necessário para executar as técnicas descritas. Obtenção de equipamento para um experimento é insustentável, por isso é importante colaborar com outras instituiç.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela ELSE-Kröner-Stiftung e a DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundação de pesquisa alemã) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de pesquisa colaborativa). Agradecimento especial a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Universidade Otto-von-Guericke Magdeburg, Alemanha, para suporte técnico.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10% de soro fetal de bezerro (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| 1% de penicilina/estreptomicina | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Seringa de insulina Omnifix -F de 1mL | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha | ||
| Seringa de 50 ml | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Alemanha | Seringa injetora 50 ml com cânula | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 semanas de idade, macho, C57BL/6, camundongos BalbC | Charles River, Sulzfeld, Alemanha | ||
| Fita adesiva | TESA SE, Hamburgo, Alemanha | ||
| Aquisição de software | Leica, Wetzlar, Alemanha | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Versão: 2.7.3.9723 | |
| Cânulas | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemanha | 29G, 30G | |
| Placa de cultura de células | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha | ||
| Meio de cultura de células | Fabricado pelo nosso grupo com componentes | Medium199, 10% Soro fetal de bezerro, 1% Antibiótico (penicilina/estreptomicina)Centrífuga | |
| Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemanha | Allegra X-15R centrífuga | ||
| Creme depilatório | Veet, Mannheim, Alemanha | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, EUA | ||
| Agente de desinfecção | Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Alemanha | ||
| Bisturi descartável nº 10 | Navalha de segurança de penas Co.Ltd, Osaka, Japão | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Balão Erlenmeyer | GVB, Herzogenrath, Alemanha | ||
| Etanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Alemanha | ||
| Soro Fetal para Bezerros | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Suíça | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Luvas | Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Alemanha | ||
| Almofada de aquecimento | Labotect GmbH, Gö ttingen, Alemanha | Placa Quente 062 | |
| Fator estimulador de colônias de macrófagos humanos | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | SRP3110 | |
| Filtros de leucócitos humanos | Incubadora de preservação | ||
| Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Alemanha | |||
| Isoflurano | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Alemanha | ||
| Cetamina (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlim, Alemanha | ||
| Tubos de separação de leucócitos (tubos com filtro) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Alemanha | ||
| Microscópio óptico | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Alemanha | Axiovert 40 C | |
| Meio de separação de linfócitos LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Áustria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Nova Jersey, EUA | ||
| Médio M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria | ||
| Bancada de trabalho microbiológica | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Alemanha | Hera safe | |
| Lâmina de microscópio | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Suporte para microscópio com incubadora e unidade de aquecimento | Leica DMI 6000, Pecon, Alemanha | ||
| Tampão de lavagem de monócitos | Fabricado pelo nosso grupo com componentes | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Limitador de mouse | Vários | ||
| microscópios multifótons | Leica, Wetzlar, Alemanha | Microscópio confocal Leica SP5, Cameleon, NaCl coerente | |
| (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlim, Alemanha | ||
| Câmara de contagem Neubauer | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Alemanha | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Alemanha | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha | ph 7,4 | |
| penicilina/estreptomicina | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Percoll | Fabricado pelo nosso grupo com componentes | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Solução de Percoll | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Suécia | ||
| Pipetas | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 10µ L/100µ L/200µ L/1000µ L | |
| Pipetas sorológicas | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Cabeças de pipetagem | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | ||
| Tubo de poliestireno | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EUA | ||
| Escala | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gieß en, Alemanha | ||
| Unidade de sucção | Integra bioscience, Fernwald, Alemanha | Conforto Vacusafe | |
| Tesoura cirúrgica | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, EUA | ||
| Solução azul de tripano 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha | ||
| Tubos com tampa | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha | 15ml, 50ml Cellstar | |
| xilazina (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Dü sseldorf, Alemanha |
Referências
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al.
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Reimpressões e permissões
