Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

Summary

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Abstract

O cérebro apresenta simetria marcada em todo o plano sagital. No entanto, a descrição detalhada da dinâmica neural em regiões do cérebro simétrica em animais mamíferos adultos continua elusiva. Neste estudo, descrevemos um procedimento experimental para medição dinâmica de cálcio através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando microscopia de fóton-2 (2P). Esse método permite gravações e quantificações de atividade neural em regiões do cérebro do rato bilateral um de cada vez no mesmo experimento para um prolongado período na vivo. Aspectos-chave desse método, que pode ser concluída dentro de uma hora, incluem procedimentos de cirurgia minimamente invasiva para criar janelas ópticas duas e o uso de imagem de 2P. Embora apenas Demonstramos a técnica na área S1, o método pode ser aplicado a outras regiões do cérebro estar facilitando a elucidação de complexidade estrutural e funcional das redes neurais do cérebro.

Introduction

Cálcio e seu regulamento são essenciais na mediação de vários processos fisiológicos. Monitoração dinâmica de cálcio é útil para a compreensão da função cerebral normal, bem como condições patológicas do cérebro desordens ^{1,2,3,4,5,6 ,7,8}. Imagem GCaMP6s fluorescência é uma poderosa ferramenta para quantificar os números de spike, sincronismo, e frequência, bem como níveis de sináptica entrada tanto in vitro e in vivo de^{10, 9,11}.

O cérebro apresenta simetria marcada em todo o plano sagital. Apesar de recente pesquisa neurológica tem lançar luz sobre a remodelação cortical e atividade neuronal desencadeada por traumática cérebro ou medula espinhal lesão ^6,7, as funções que o tecido intacto de simetricamente correspondentes regiões jogar em recuperação são ainda obscuras.

Neste estudo, descrevemos procedimentos experimentais para criar janelas de ópticas simétricas bilaterais para a imagem latente na vivo . Usando estas janelas ópticas, descrevemos a medição da dinâmica de cálcio de córtices somatossensorial primárias (S1) em ratos transgénicos de GCaMP6s usando microscopia 2P. Na seção de resultados, mostramos também na vivo morfologia dendrítica em pontos de tempo diferentes na região S1 nos ratos transgénicos EGFP utilizando imagens de 2P. O método de observação sobre a dinâmica de rede nas áreas S1 bilaterais é mas um exemplo inicial de windows cranianas abertas como duplas vai ajudar neurocientistas para sondar informações locais e simétricas de processamento do cérebro de mamíferos adultos no normal as condições ou na doença de diferente modelos em vivo.

Protocol

Todos os procedimentos de manipulação cirúrgica e animais foram realizados conforme aprovado sob o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (National Research Council) e as diretrizes da Indiana University School de medicina institucional Cuidado Animal e uso Comitê. A ilustração esquemática da instalação da imagem latente do 2-fóton é mostrada na Figura 1.

1. preparar o Animal para a imagem latente

1. Coloque gaze estéril, cotonetes e autoclavados instrumentos cirúrgicos na área de cirurgia (tabela 1). Liga um Micro grânulo esterilizador para intersurgery esterilização de instrumentos cirúrgicos.
2. Anestesia o mouse (macho ou fêmea, 1,5 – 2,5 meses, 20-25 g) por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (17,2 mg/mL), xilazina (0,475 mg/mL) e acepromazina (0,238) mg/mL (6 µ l/g de massa corporal). Espere até a profundidade apropriada de anestesia é alcançada quando o animal deixa de responder a um estímulo de pitada de dedo do pé e não tem nenhum reflexo corneal. Durante a cirurgia, dar uma dose de reforço de 1/3 da dose original do cocktail como anestésico necessária para manter o estado original de anestésico.
3. Injetar buprenorfina por via subcutânea (s.c.; 0,05 – 0,10 mg/kg) como agente analgésico antes da cirurgia. Aplica a pomada protetora para os olhos do animal para evitar a formação da córnea de secagem e catarata.
4. Coloque um rato transgênico GCaMP6s em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia e cubra com um pano cirúrgico estéril. Estabilize a cabeça do animal com um adaptador segurando de cabeça para os ratos.
5. Raspe a cabeça sobre a maioria do couro cabeludo com uma lâmina de dois gumes. Limpe a área cirúrgica com uma almofada de preparação de álcool estéril seguida de solução de iodo-povidona.

2. crônica janela craniana preparação

1. Fazer um corte retangular do couro cabeludo (2 mm x 3 mm) com um par de tesouras, de um lado (direita) do crânio. Empurre a pele à parte com um cotonete de algodão para criar uma área de exposição de > 3 mm de diâmetro (Figura 3A). Remova o tecido conjuntivo anexado ao crânio raspando suavemente o crânio com uma lâmina cega microcirúrgica (lâmina de bisturi n º 10; A Figura 3).
2. Marque a área S1 suavemente desenhando um círculo (3 mm de diâmetro, centro de coordenação:-1,50 mm do bregma e 2,5 mm da linha média) no crânio usando um dental da broca (Figura 2B).
3. Execute o mesmo procedimento no crânio à esquerda (Figura 2B).
4. Aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato Super ao osso para fornecer uma base para aplicação de cimento dental.
5. Sob um microscópio de dissecação, fina para baixo um sulco circular no crânio em torno da área S1 usando um microdrill de alta velocidade (Figura 3D). O objetivo é criar uma borda suave para a colocação de uma janela óptica para ele.
6. Aplica repetidamente artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF, temperatura) no crânio periodicamente durante o processo de desbaste para facilitar a perfuração e dissipar o calor. Realize a perfuração intermitentemente para evitar o atrito induzido por superaquecimento. Sugam os restos de osso com uma linha de vácuo de casa ou uma bomba de vácuo.
7. Após cerca de 2/3 de profundidade do osso é perfurada, lentamente e com cuidado fina do osso remanescente de 1/3 até um pedaço circular do crânio (retalho ósseo) é completamente grátis do crânio do circundante.
8. Lentamente e com cuidado retire a aba óssea circular com um par de pinças de # 5/45 e expor a dura-máter (Figura 2; Figura 3E).
9. A região do cérebro exposto manter húmida com ACSF (Figura 3E). Evite quaisquer danos aos navios pial, desde que a hemorragia irá alterar o fluxo sanguíneo cerebral, acelerar o cérebro inchaço e severamente degradar a qualidade de imagem.
10. Execute o mesmo procedimento do lado esquerdo (contralateral) do crânio.
11. Para montar a janela óptica, uso ótico adesivo para colagem e cura entre lamela camadas uma de cada vez. Se necessário, aqueça a janela óptica (50 ° C por 12h) na incubadora para realçar a ligação adesiva. A janela óptica contém 2 partes: a parte superior contém um único vidro tampa redondo com um diâmetro de 5 mm e a parte inferior contém 1 – 3 copos de tampa redondos com um diâmetro de 3 mm (Figura 2D).
12. Armazenar a janela óptica no álcool etílico (70 %), vol/vol) e enxague com soro fisiológico estéril antes do uso. Antes da instalação da janela óptica, verifique a janela óptica para imperfeições, incluindo uma quantidade incorreta de alinhamento óptico do adesivo ou imprecisa sob um estereoscópio.
13. Instale a janela óptica sobre a região de craniotomia (Figura 2D). A parte superior da janela óptica repousa sobre o crânio e a parte inferior da janela óptica se encaixa dentro da abertura craniotomized e repousa sobre a dura-máter na presença do CSF (Figura 2D, E).
14. Selar a parte de cima da borda da janela óptica no crânio com a cola de cianoacrilato Super (Figura 2F; Figura 3F).
15. Quando secou a Super cola de cianoacrilato, aplique o cimento dental preto (Dentsply) para cobrir a borda do vidro. Aplique o cimento dental todo o crânio exposto e ferida margens para bloquear a luz (Figura 2-H; Figura 3B).
16. Execute o mesmo procedimento no lado esquerdo.
17. Permitir que o animal se recuperar na rampa de aquecimento e devolver o animal para sua gaiola em casa para recuperação sob acompanhamento adequado. Fornece alimento molhado para facilitar a mastigação e hidratação. Para reduzir a dor, administrar buprenorfina s.c. (0,05 – 2,0 mg/kg) todas as postinjury de 8 – 12 h, durante 2 dias. Permitir que o mouse para recuperar por mais 7-10 dias antes de imagem.

3. dois fotões de imagem

1. No dia do experimento, anestesia o animal com ketamina e xilazina (doses e manutenção da anestesia, como descrito acima). Limpe a janela craniana com etanol a 75% (vol/vol).
2. Coloque o mouse sob uma configuração de imagem consistindo de um microscópio de 2P e o adaptador cabeça segurando, descansando sobre uma almofada de aquecimento com a cabeça imobilizada por meio de barras de ouvido ligadas a um suporte de cabeça de rato.
3. Um lado da janela óptica da imagem de cada vez. Para minimizar as aberrações ópticas, certifique-se de que a janela óptica e crânio certo são orientada perpendicularmente ao eixo óptico do microscópio.
4. Tire uma foto inicial da janela craniana com iluminação de campo claro na ampliação de 4x como um mapa de referência para o registo com angiografias de 2P maiores ampliação (Figura 4A1).
5. Amplie a área de interesse, com ampliação de 10x (Figura 4A2).
6. Selecione uma área de interesse na área de S1 em camadas corticais I ou II (até 150 µm na superfície pial). Se aumento for desejado, use um objectivo X 20.
7. Busca de um campo de visão com vários neurônios. Adquira imagens usando um microscópio de 2P (Figura 4B). Determine o tempo de exposição e nível de luz de excitação (≈910 nm) com base em profundidade e nível de expressão de GCaMP6s, com sinais mais fracos que exigem tempos de exposição mais longos e mesmo menos tempo resolução. Normalmente usamos ~ 4 µs por tempos de exposição de pixel. Adquira imagens em taxas de quadro de 3 a 5 Hz em uma resolução de 512 × 512 pixels.
8. Começa a gravar a série temporal. Armazenar as coordenadas de todas as regiões de interesse (ROI) em relação ao padrão vascular ou para pontos fiduciais em baixa ampliação de imagens. Imagem do ROI mesmo ao longo do tempo. Execute o mesmo procedimento para observar a dinâmica de cálcio da área S1 no hemisfério esquerdo. Calcule as alterações na fluorescência de cada ROI.
9. Adquirir imagens individualmente ou como um filme lapso de tempo (Figura 41-C3, D, E).
10. Estudo cortical sangue fluxo dinâmica na vivo por imagem corantes fluorescentes dextrano injetados na veia da cauda de roedores com microscopia 2P. Use vasculatures como Marcos a reconhecer e o mesmo ROI em sessões de imagem durante longos períodos de imagem.

4. processamento de dados

1. Use o ImageJ e origem para a análise de imagem. Importação de sequências de imagem com ImageJ (Figura 5A-B). Para imagens individuais (ou t-series filmes), selecione um ROI dentro de um neurônio imagem e 2 separado nas proximidades de regiões para medição de fundo (Figura 5). Adquira a intensidade total com um gerente de ROI (Figura 5–C).
   Nota: A Figura 6 mostra imagens representativas de cálcio. Transiente de cálcio (verde) e dos vasos sanguíneos (vermelho) mostram em pontos diferentes de tempo em segundos (figura 6A-D) em um rato no 7D após a instalação inicial da janela. O z-projeção de um período de 3 min de gravação para os canais vermelhos e verdes (Figura 6E) ou canal verde (Figura 6F) também é mostrado. Uma z-projeção exibe uma imagem compactada de todas as imagens do filme do qual um limite bruto e círculo (englobando o neurônio de objeto de interesse em todos os quadros) é selecionado manualmente assim como a seleção do independente nas proximidades de regiões de fundo ( 2 Figura 6).
2. De cada ROI, calcular o fundo média fluorescência FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 e as mudanças de fluorescência da soma (F) expressaram em ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Realizar a análise de pico, passo a passo usando funções do ImageJ, incluindo correção de linha de base, pico constatação/determinação, integração de pico, pico montagem e/ou recursos de análise de pico de Time-Saving.

Representative Results

Discussion

Imagem de dois fotões permite a medição simultânea da actividade de muitas células em uma resolução razoável em até aproximadamente 800 µm abaixo da superfície do cérebro. Integramos 2P e uma técnica de dupla janela óptica com GCaMP6s geneticamente codificado para observar a dinâmica de cálcio em populações de somata neuronal de camada V localizado > 500 µm abaixo da pia. Com uma janela aberta óptica em cada lado do crânio, o método permite gravações de atividade neural em todas as regiões do cérebro de mamíferos simétrica para prolongada e estável de cálcio em vivode imagem. Aspectos-chave desse método incluem 2P imagem da atividade neuronal e o desempenho da cirurgia minimamente invasiva para criar janelas ópticas dual crânio aberto nas regiões simétricas de S1.

Examinando a atividade de rede nas regiões bilaterais de S1 é que um exemplo de como duas windows cranianas poderia ser usado para sondar informações locais e simétricas processamento no cérebro de um adulto em vivo. Esse método também pode ser usado para estudar a atividade neuronal (por exemplo, usando o Thy1 –GCaMP6s ratos) e plasticidade cortical B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J do tecido intacto das regiões simétricas correspondentes em recuperação após desaferentação devido a uma lesão unilateral do CNS. O método também pode ser usado para examinar a atividade cortical em resposta às estratégias de estimulação periférica, tais como optogenetic, estímulos elétricos ou químicos. Embora apenas Demonstramos a técnica na área S1, esta abordagem poderia ser empregada para investigar as atividades em outras áreas simétricas no cérebro vivo, tais como os neurônios da camada V do córtex motor primário (M1). Observações sobre reorganização das regiões do cérebro podem fornecer um substrato neural para comportamento motor adaptativo, que desempenha um papel crítico na recuperação postinjury da função. Também permite medição crônica da atividade simétrica de células geneticamente identificadas durante o comportamento em ratos cabeça-corrigido.

Tecnicamente, os investigadores devem preste muita atenção à qualidade e consistência do windows cranianas duas. Janela craniana crânio diluído técnica ¹² é altamente recomendado para os iniciantes a prática. Espinhas são compartimentos de cálcio por causa de sua morfologia e locais mecanismos de influxo e extrusão. Neste estudo, nós usamos B6. Ratos de HJrs/J CG-Tg (Thy1– YFP) como um exemplo para demonstrar a espinha dendrítica dinâmica na vivo (Figura 4). Uma instalação de janela de vidro aberto-crânio pode causar espinha alta rotatividade e respostas gliais reativas após cirurgia ¹². Em contraste, com a técnica de janela diluído-crânio, espinhos e dendrites podem ser bem preservadas.

Escolhas de dimensões e espessuras de janelas ópticas será dependentes do campo de visão desejado, a curvatura do crânio, espessura do crânio e o tipo de imagem ¹³. Pressão insuficiente dos esfregaços ópticos sobre a dura-máter pode causar espessamento da dura-máter, regrowth do crânio e aumentou o movimento do cérebro. Em contraste, pressão excessiva de esfregaços a óptica possa impedir o fluxo sanguíneo cortical.

Para a montagem da janela óptica, cola e curar camadas adicionais de esfregaços, um de cada vez com adesivo óptico e luz UV de comprimento de onda longa. Para ajudar a fortalecer a ligação adesiva, aquecer a janela fabricada (50 ° C por 12 h) em uma incubadora. Armazenar a lamela de janela óptica em etanol a 70% (vol/vol) e, antes da cirurgia, lave-o com soro fisiológico estéril. A janela óptica precisa ser examinado por imperfeições (como uma quantidade incorreta de alinhamento óptico do adesivo ou imprecisa) sob um estereoscópio antes do uso para evitar o fracasso. Se o adesivo óptico é muito fino, espaços de ar pode ser um vincado, que pode causar aberrações ópticas ou desprendimento de vidro de tampa na implantação. Em contraste, muito adesivo óptico pode causar estouro além das bordas da janela cranial.

Em resumo, aqui descrevemos um procedimento experimental para medição dinâmica de cálcio ou dendrítica morfologia craniana janelas de 2 simétricas primárias somatossensorial corticais regiões Thy1-GCaMP6s e Thy1ratos transgénicos – YFP, respectivamente, usando microscopia de 2P. Esta técnica pode facilitar grandemente dissecando a complexa relação estrutural e funcional das redes neurais.

Materials

C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. 
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	–	–	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO<sub>3</sub>, 1.25 mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, 2 mM CaCl<sub>2</sub>, 1 mM MgCl<sub>2</sub> and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.