Name: Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a registrar atividade neural bilateral no córtex somatossensorial de camundongos Thy1-GCaMP6s usando janelas ópticas duplas e microscopia de dois fótons. Este método permite imagem prolongada de cálcio in vivo.

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Estamos muito gratos a Wenbiao Gan (Skirball Institute, departamento de Fisiologia e da neurociência, New York University School of Medicine, EUA) para orientação técnica excelente e Patti Raley, Medical Editor (departamento de cirurgia neurológica, Indiana Da faculdade de medicina), para editar o manuscrito. Agradecemos o Dr. Jinhui Chen (Instituto de pesquisa de Neurociências Stark, da faculdade de medicina da Universidade de Indiana, EUA) para fornecer B6. Ratos de HJrs/J CG-Tg (Thy1- YFP). Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação do diretor do Hospital Geral da região militar de PLA Chines da Jinan 2016ZD03 (XJL) e NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, mérito revisão prêmio I01 BX002356 os E.U. departamento de veteranos Assuntos, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana da medula espinhal e cérebro lesão Research Foundation, Mari Hulman George Endowment fundos (XMX).

Todos os procedimentos de manipulação cirúrgica e animais foram realizados conforme aprovado sob o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (National Research Council) e as diretrizes da Indiana University School de medicina institucional Cuidado Animal e uso Comitê. A ilustração esquemática da instalação da imagem latente do 2-fóton é mostrada na Figura 1.
1. preparar o Animal para a imagem latente
<ol><li>Coloque gaze estéril, cotonetes e autoclavados instrumentos cirúrgicos na área de cirurgia (tabela 1). Liga um Micro grânulo esterilizador para intersurgery esterilização de instrumentos cirúrgicos.</li>
	<li>Anestesia o mouse (macho ou fêmea, 1,5 – 2,5 meses, 20-25 g) por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (17,2 mg/mL), xilazina (0,475 mg/mL) e acepromazina (0,238) mg/mL (6 µ l/g de massa corporal). Espere até a profundidade apropriada de anestesia é alcançada quando o animal deixa de responder a um estímulo de pitada de dedo do pé e não tem nenhum reflexo corneal. Durante a cirurgia, dar uma dose de reforço de 1/3 da dose original do cocktail como anestésico necessária para manter o estado original de anestésico.</li>
	<li>Injetar buprenorfina por via subcutânea (s.c.; 0,05 – 0,10 mg/kg) como agente analgésico antes da cirurgia. Aplica a pomada protetora para os olhos do animal para evitar a formação da córnea de secagem e catarata.</li>
	<li>Coloque um rato transgênico GCaMP6s em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia e cubra com um pano cirúrgico estéril. Estabilize a cabeça do animal com um adaptador segurando de cabeça para os ratos.</li>
	<li>Raspe a cabeça sobre a maioria do couro cabeludo com uma lâmina de dois gumes. Limpe a área cirúrgica com uma almofada de preparação de álcool estéril seguida de solução de iodo-povidona.</li>
</ol>2. crônica janela craniana preparação
<ol><li>Fazer um corte retangular do couro cabeludo (2 mm x 3 mm) com um par de tesouras, de um lado (direita) do crânio. Empurre a pele à parte com um cotonete de algodão para criar uma área de exposição de > 3 mm de diâmetro (Figura 3A). Remova o tecido conjuntivo anexado ao crânio raspando suavemente o crânio com uma lâmina cega microcirúrgica (lâmina de bisturi n º 10; A Figura 3).</li>
	<li>Marque a área S1 suavemente desenhando um círculo (3 mm de diâmetro, centro de coordenação:-1,50 mm do bregma e 2,5 mm da linha média) no crânio usando um dental da broca (Figura 2B).</li>
	<li>Execute o mesmo procedimento no crânio à esquerda (Figura 2B).</li>
	<li>Aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato Super ao osso para fornecer uma base para aplicação de cimento dental.</li>
	<li>Sob um microscópio de dissecação, fina para baixo um sulco circular no crânio em torno da área S1 usando um microdrill de alta velocidade (Figura 3D). O objetivo é criar uma borda suave para a colocação de uma janela óptica para ele.</li>
	<li>Aplica repetidamente artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF, temperatura) no crânio periodicamente durante o processo de desbaste para facilitar a perfuração e dissipar o calor. Realize a perfuração intermitentemente para evitar o atrito induzido por superaquecimento. Sugam os restos de osso com uma linha de vácuo de casa ou uma bomba de vácuo.</li>
	<li>Após cerca de 2/3 de profundidade do osso é perfurada, lentamente e com cuidado fina do osso remanescente de 1/3 até um pedaço circular do crânio (retalho ósseo) é completamente grátis do crânio do circundante.</li>
	<li>Lentamente e com cuidado retire a aba óssea circular com um par de pinças de # 5/45 e expor a dura-máter (Figura 2; Figura 3E).</li>
	<li>A região do cérebro exposto manter húmida com ACSF (Figura 3E). Evite quaisquer danos aos navios pial, desde que a hemorragia irá alterar o fluxo sanguíneo cerebral, acelerar o cérebro inchaço e severamente degradar a qualidade de imagem.</li>
	<li>Execute o mesmo procedimento do lado esquerdo (contralateral) do crânio.</li>
	<li>Para montar a janela óptica, uso ótico adesivo para colagem e cura entre lamela camadas uma de cada vez. Se necessário, aqueça a janela óptica (50 ° C por 12h) na incubadora para realçar a ligação adesiva. A janela óptica contém 2 partes: a parte superior contém um único vidro tampa redondo com um diâmetro de 5 mm e a parte inferior contém 1 – 3 copos de tampa redondos com um diâmetro de 3 mm (Figura 2D).</li>
	<li>Armazenar a janela óptica no álcool etílico (70 %), vol/vol) e enxague com soro fisiológico estéril antes do uso. Antes da instalação da janela óptica, verifique a janela óptica para imperfeições, incluindo uma quantidade incorreta de alinhamento óptico do adesivo ou imprecisa sob um estereoscópio.</li>
	<li>Instale a janela óptica sobre a região de craniotomia (Figura 2D). A parte superior da janela óptica repousa sobre o crânio e a parte inferior da janela óptica se encaixa dentro da abertura craniotomized e repousa sobre a dura-máter na presença do CSF (Figura 2D, E).</li>
	<li>Selar a parte de cima da borda da janela óptica no crânio com a cola de cianoacrilato Super (Figura 2F; Figura 3F).</li>
	<li>Quando secou a Super cola de cianoacrilato, aplique o cimento dental preto (Dentsply) para cobrir a borda do vidro. Aplique o cimento dental todo o crânio exposto e ferida margens para bloquear a luz (Figura 2-H; Figura 3B).</li>
	<li>Execute o mesmo procedimento no lado esquerdo.</li>
	<li>Permitir que o animal se recuperar na rampa de aquecimento e devolver o animal para sua gaiola em casa para recuperação sob acompanhamento adequado. Fornece alimento molhado para facilitar a mastigação e hidratação. Para reduzir a dor, administrar buprenorfina s.c. (0,05 – 2,0 mg/kg) todas as postinjury de 8 – 12 h, durante 2 dias. Permitir que o mouse para recuperar por mais 7-10 dias antes de imagem.</li>
</ol>3. dois fotões de imagem
<ol><li>No dia do experimento, anestesia o animal com ketamina e xilazina (doses e manutenção da anestesia, como descrito acima). Limpe a janela craniana com etanol a 75% (vol/vol).</li>
	<li>Coloque o mouse sob uma configuração de imagem consistindo de um microscópio de 2P e o adaptador cabeça segurando, descansando sobre uma almofada de aquecimento com a cabeça imobilizada por meio de barras de ouvido ligadas a um suporte de cabeça de rato.</li>
	<li>Um lado da janela óptica da imagem de cada vez. Para minimizar as aberrações ópticas, certifique-se de que a janela óptica e crânio certo são orientada perpendicularmente ao eixo óptico do microscópio.</li>
	<li>Tire uma foto inicial da janela craniana com iluminação de campo claro na ampliação de 4x como um mapa de referência para o registo com angiografias de 2P maiores ampliação (Figura 4A1).</li>
	<li>Amplie a área de interesse, com ampliação de 10x (Figura 4A2).</li>
	<li>Selecione uma área de interesse na área de S1 em camadas corticais I ou II (até 150 µm na superfície pial). Se aumento for desejado, use um objectivo X 20.</li>
	<li>Busca de um campo de visão com vários neurônios. Adquira imagens usando um microscópio de 2P (Figura 4B). Determine o tempo de exposição e nível de luz de excitação (≈910 nm) com base em profundidade e nível de expressão de GCaMP6s, com sinais mais fracos que exigem tempos de exposição mais longos e mesmo menos tempo resolução. Normalmente usamos ~ 4 µs por tempos de exposição de pixel. Adquira imagens em taxas de quadro de 3 a 5 Hz em uma resolução de 512 × 512 pixels.</li>
	<li>Começa a gravar a série temporal. Armazenar as coordenadas de todas as regiões de interesse (ROI) em relação ao padrão vascular ou para pontos fiduciais em baixa ampliação de imagens. Imagem do ROI mesmo ao longo do tempo. Execute o mesmo procedimento para observar a dinâmica de cálcio da área S1 no hemisfério esquerdo. Calcule as alterações na fluorescência de cada ROI.</li>
	<li>Adquirir imagens individualmente ou como um filme lapso de tempo (Figura 41-C3, D, E).</li>
	<li>Estudo cortical sangue fluxo dinâmica na vivo por imagem corantes fluorescentes dextrano injetados na veia da cauda de roedores com microscopia 2P. Use vasculatures como Marcos a reconhecer e o mesmo ROI em sessões de imagem durante longos períodos de imagem.</li>
</ol>4. processamento de dados
<ol><li>Use o ImageJ e origem para a análise de imagem. Importação de sequências de imagem com ImageJ (Figura 5A-B). Para imagens individuais (ou t-series filmes), selecione um ROI dentro de um neurônio imagem e 2 separado nas proximidades de regiões para medição de fundo (Figura 5). Adquira a intensidade total com um gerente de ROI (Figura 5-C). Nota: A Figura 6 mostra imagens representativas de cálcio. Transiente de cálcio (verde) e dos vasos sanguíneos (vermelho) mostram em pontos diferentes de tempo em segundos (figura 6A-D) em um rato no 7D após a instalação inicial da janela. O z-projeção de um período de 3 min de gravação para os canais vermelhos e verdes (Figura 6E) ou canal verde (Figura 6F) também é mostrado. Uma z-projeção exibe uma imagem compactada de todas as imagens do filme do qual um limite bruto e círculo (englobando o neurônio de objeto de interesse em todos os quadros) é selecionado manualmente assim como a seleção do independente nas proximidades de regiões de fundo ( 2 Figura 6).</li>
	<li>De cada ROI, calcular o fundo média fluorescência FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 e as mudanças de fluorescência da soma (F) expressaram em ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.</li>
	<li>Realizar a análise de pico, passo a passo usando funções do ImageJ, incluindo correção de linha de base, pico constatação/determinação, integração de pico, pico montagem e/ou recursos de análise de pico de Time-Saving.</li>
</ol>

<ol><li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch-specific+dendritic+Ca%282%2B%29+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li>
<li>Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+mouse+higher+visual+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of mouse higher visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Katona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+Dendritic+Spines+in+the+Hindlimb+Representation+of+the+Sensory+Cortex+after+Spinal+Cord+Hemisection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), e0132077(2015).</li>
<li>Keck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+and+homeostatic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+functional+imaging+in+behaving+rats+using+voluntary+head+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint.</a> Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).</li>
<li>Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+Microcircuit-Level+Substrates+for+Attention+Are+Disrupted+in+Mouse+Models+of+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism.</a> Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).</li>
<li>Wachowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+dissection+of+odor+information+processing+in+vivo+using+GCaMPs+expressed+in+specified+cell+types+of+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Imagem de dois fotões permite a medição simultânea da actividade de muitas células em uma resolução razoável em até aproximadamente 800 µm abaixo da superfície do cérebro. Integramos 2P e uma técnica de dupla janela óptica com GCaMP6s geneticamente codificado para observar a dinâmica de cálcio em populações de somata neuronal de camada V localizado > 500 µm abaixo da pia. Com uma janela aberta óptica em cada lado do crânio, o método permite gravações de atividade neural em todas as regiões do cérebro de mamíferos simétrica para prolongada e estável de cálcio em vivode imagem. Aspectos-chave desse método incluem 2P imagem da atividade neuronal e o desempenho da cirurgia minimamente invasiva para criar janelas ópticas dual crânio aberto nas regiões simétricas de S1.
Examinando a atividade de rede nas regiões bilaterais de S1 é que um exemplo de como duas windows cranianas poderia ser usado para sondar informações locais e simétricas processamento no cérebro de um adulto em vivo. Esse método também pode ser usado para estudar a atividade neuronal (por exemplo, usando o Thy1 -GCaMP6s ratos) e plasticidade cortical B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J do tecido intacto das regiões simétricas correspondentes em recuperação após desaferentação devido a uma lesão unilateral do CNS. O método também pode ser usado para examinar a atividade cortical em resposta às estratégias de estimulação periférica, tais como optogenetic, estímulos elétricos ou químicos. Embora apenas Demonstramos a técnica na área S1, esta abordagem poderia ser empregada para investigar as atividades em outras áreas simétricas no cérebro vivo, tais como os neurônios da camada V do córtex motor primário (M1). Observações sobre reorganização das regiões do cérebro podem fornecer um substrato neural para comportamento motor adaptativo, que desempenha um papel crítico na recuperação postinjury da função. Também permite medição crônica da atividade simétrica de células geneticamente identificadas durante o comportamento em ratos cabeça-corrigido.
Tecnicamente, os investigadores devem preste muita atenção à qualidade e consistência do windows cranianas duas. Janela craniana crânio diluído técnica 12 é altamente recomendado para os iniciantes a prática. Espinhas são compartimentos de cálcio por causa de sua morfologia e locais mecanismos de influxo e extrusão. Neste estudo, nós usamos B6. Ratos de HJrs/J CG-Tg (Thy1- YFP) como um exemplo para demonstrar a espinha dendrítica dinâmica na vivo (Figura 4). Uma instalação de janela de vidro aberto-crânio pode causar espinha alta rotatividade e respostas gliais reativas após cirurgia 12. Em contraste, com a técnica de janela diluído-crânio, espinhos e dendrites podem ser bem preservadas.
Escolhas de dimensões e espessuras de janelas ópticas será dependentes do campo de visão desejado, a curvatura do crânio, espessura do crânio e o tipo de imagem 13. Pressão insuficiente dos esfregaços ópticos sobre a dura-máter pode causar espessamento da dura-máter, regrowth do crânio e aumentou o movimento do cérebro. Em contraste, pressão excessiva de esfregaços a óptica possa impedir o fluxo sanguíneo cortical.
Para a montagem da janela óptica, cola e curar camadas adicionais de esfregaços, um de cada vez com adesivo óptico e luz UV de comprimento de onda longa. Para ajudar a fortalecer a ligação adesiva, aquecer a janela fabricada (50 ° C por 12 h) em uma incubadora. Armazenar a lamela de janela óptica em etanol a 70% (vol/vol) e, antes da cirurgia, lave-o com soro fisiológico estéril. A janela óptica precisa ser examinado por imperfeições (como uma quantidade incorreta de alinhamento óptico do adesivo ou imprecisa) sob um estereoscópio antes do uso para evitar o fracasso. Se o adesivo óptico é muito fino, espaços de ar pode ser um vincado, que pode causar aberrações ópticas ou desprendimento de vidro de tampa na implantação. Em contraste, muito adesivo óptico pode causar estouro além das bordas da janela cranial.
Em resumo, aqui descrevemos um procedimento experimental para medição dinâmica de cálcio ou dendrítica morfologia craniana janelas de 2 simétricas primárias somatossensorial corticais regiões Thy1-GCaMP6s e Thy1ratos transgénicos - YFP, respectivamente, usando microscopia de 2P. Esta técnica pode facilitar grandemente dissecando a complexa relação estrutural e funcional das redes neurais.

Cálcio e seu regulamento são essenciais na mediação de vários processos fisiológicos. Monitoração dinâmica de cálcio é útil para a compreensão da função cerebral normal, bem como condições patológicas do cérebro desordens 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imagem GCaMP6s fluorescência é uma poderosa ferramenta para quantificar os números de spike, sincronismo, e frequência, bem como níveis de sináptica entrada tanto in vitro e in vivo de10, 9,11.
O cérebro apresenta simetria marcada em todo o plano sagital. Apesar de recente pesquisa neurológica tem lançar luz sobre a remodelação cortical e atividade neuronal desencadeada por traumática cérebro ou medula espinhal lesão 6,7, as funções que o tecido intacto de simetricamente correspondentes regiões jogar em recuperação são ainda obscuras.
Neste estudo, descrevemos procedimentos experimentais para criar janelas de ópticas simétricas bilaterais para a imagem latente na vivo . Usando estas janelas ópticas, descrevemos a medição da dinâmica de cálcio de córtices somatossensorial primárias (S1) em ratos transgénicos de GCaMP6s usando microscopia 2P. Na seção de resultados, mostramos também na vivo morfologia dendrítica em pontos de tempo diferentes na região S1 nos ratos transgénicos EGFP utilizando imagens de 2P. O método de observação sobre a dinâmica de rede nas áreas S1 bilaterais é mas um exemplo inicial de windows cranianas abertas como duplas vai ajudar neurocientistas para sondar informações locais e simétricas de processamento do cérebro de mamíferos adultos no normal as condições ou na doença de diferente modelos em vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6J-Tg (Thy1-GCaMP6s) GP4.3Dkim / J</td><td>Jackson</td><td>24275</td><td>Pode ser qualquer cepa produzida pelo indicador neuronal geneticamente codificado e efetor que expressa o indicador de cálcio fluorescente verde, GCaMP, em subconjuntos de neurônios excitatórios no córtex.</td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.</td><td>Jackson</td><td>7919</td><td>Pode ser qualquer cepa que expresse EGFP em subconjuntos de neurônios dentro de populações específicas no córtex; fornecendo uma coloração brilhante e vital semelhante a Golgi.</td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 5, padrão, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Dumont no. 5SF fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Micro Esterilizador de Esferas</td><td>Southern Labware</td><td>B1201</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Harishige' s SG-4N Adaptador de Cabeça</td><td>Tritech Research</td><td>SG-4N</td><td>Pode ser qualquer marca de escolha.</td></tr><tr><td>Kit Completo de Micro-Broca Ideal</td><td>para Aparelhos Harvard</td><td>72-6065</td><td>Pode ser qualquer marca de escolha.</td></tr><tr><td>Rebarbas para Micro Broca</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Pode ser qualquer marca de escolha.</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura redondo, 3 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0720</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura redondo, 5 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0700</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Adesivo óptico Norland</td><td>Produtos Norland</td><td>7106</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Loctite liquid super glue</td><td>WB Mason</td><td>LOC1647358</td><td>Pode ser qualquer marca de escolha.</td></tr><tr><td>Kit de cimento Grip, pó e solvente</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha. Misture 5 partes de pó de cimento dental branco (Grip Cement) com uma parte de tinta em pó Têmpera preta (para proteger da luz; alguns usuários preferem uma proporção de 10:1).</td></tr><tr><td>Espuma de gel</td><td>Moore Medical</td><td>2928</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Tesoura de micro dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td>Pode ser qualquer marca de sua escolha.</td></tr><tr><td>Líquido cefalorraquidiano artificial (PSA)</td> <td>-</td><td></td> <td>O ACSF contém 125 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,25 mM de NaH2PO4, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 e 20 mM de glicose. Borbulhe o ACSF com oxigênio (95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono) e ajuste o pH para 7,4. Preparar uma nova solução de ACSF antes de cada experiência.</td></tr></tbody></table>

imagem de atividade neural no córtex somatossensorial primário usando thy1-gcamp6s de ratos transgênicos

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

O cérebro apresenta simetria marcada em todo o plano sagital. No entanto, a descrição detalhada da dinâmica neural em regiões do cérebro simétrica em animais mamíferos adultos continua elusiva. Neste estudo, descrevemos um procedimento experimental para medição dinâmica de cálcio através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando microscopia de fóton-2 (2P). Esse método permite gravações e quantificações de atividade neural em regiões do cérebro do rato bilateral um de cada vez no mesmo experimento para um prolongado período na vivo. Aspectos-chave desse método, que pode ser concluída dentro de uma hora, incluem procedimentos de cirurgia minimamente invasiva para criar janelas ópticas duas e o uso de imagem de 2P. Embora apenas Demonstramos a técnica na área S1, o método pode ser aplicado a outras regiões do cérebro estar facilitando a elucidação de complexidade estrutural e funcional das redes neurais do cérebro.

Usando a janela óptica bilateral, obtivemos resultados de 2 experimentos separados. O primeiro experimento empregado EGFP-expressando ratos para as varizes dendríticas de imagem. Figura 4 1-3 mostra exemplos de imagens capturadas em pontos diferentes de tempo após o implante de janela óptica. Observe que o número e localização das ramificações dendríticas e espinhos são notavelmente estáveis entre os 2 pontos de vista (Figura 4, E, z-projeção).
O segundo experimento empregado ratos transgénicos Thy1 -GCaMP6s para medir o cálcio intracelular transitório, ilustrando assim como a fisiologia do cálcio pode ser medida dentro de um único neurônio no vivo (Figura 6). Esta técnica pode ser usada para gravar e quantificar a atividade espontânea em populações de neurônios piramidais de camada V localizados em tão profunda como &gt; 500 µm abaixo da pia. Respostas espontâneas médias ao longo do tempo (calculado como as médias respostas em cada ponto de tempo) podem ser calculadas através de numerosos ensaios. A técnica de 2P tem a vantagem de detectar atividade simultaneamente nas populações neuronais grandes ou dispersas durante um período prolongado com pequena perturbação mecânica para o cérebro em comparação com as gravações multielectrode.
Para gerar uma medida média aceitável, 5 – 10 ensaios são recomendados. O número de tentativas será dependente de respostas espontâneas ou variabilidade inerente das respostas a um estímulo particular. Se todas as etapas são seguidas à risca, conforme descrito acima, um pesquisador com formação na técnica ambos janela craniana crânio diluído e na vivo 2P cálcio imagem deve ser capaz de obter gravações de 100 – 200 neurônios de ambos os lados de 1 – 2 animais por dia.
Após a análise do pico, uma coleção de resultados, tais como a localização real do pico, a real amplitude, a área e a largura total no máximo meia (FWHM) para cada pico pode ser obtida.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig1.jpg"> Figura 1 : Ilustração esquemática dos componentes de uma janela óptica craniana para a imagem latente de (2P) 2-fóton. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig2.jpg"> Figura 2 : Desenho esquemático mostra principais etapas para a preparação de uma janela cranial. (A) sob um microscópio de dissecação, retire a pele sobre a região cirúrgica, usando um par de tesouras cirúrgicas. (B) uso um microdrill de alta velocidade para produzir um sulco circular (diâmetro de 3 mm) no crânio sobre a área de S1 até o osso de sincronismo dentro da ranhura se separar o osso circundante. (C) retire lentamente o retalho ósseo para expor a dura-máter subjacente. (D) montar a janela óptica com esfregaços com 2 diâmetros diferentes. A lamela superior possui um diâmetro maior (5 mm) e os esfregaços inferiores (geralmente 1-3) têm um diâmetro menor (3 mm). A espessura dos esfregaços para ser instalado vai depender da espessura do crânio. (E) lugar da lamela para a abertura circular do crânio para criar uma janela óptica. A parte inferior dos esfregaços deve caber dentro da abertura craniana. Fundo dos esfregaços suavemente deve contactar a dura-máter. (F) selo janela bordas no crânio com cola de cianoacrilato. (G) quando o cianoacrilato seca, aplicar o cimento dental preto lateral na parede de cola. (H) preencher a janela craniana com DDQ2O e usar objectivos de imersão de água para a imagem latente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig3.jpg"> Figura 3 . Criação de janelas bilaterais no crânio. (A), A imagem fotográfica mostra 2 cranianas janelas ópticas de cada lado do crânio sobrejacente a área S1. (B) alta ampliação da região in a box da imagem (A) mostrando janelas ópticas bilaterais, expondo a dura-máter e vasos sanguíneos subjacentes. Barra de escala = 680 µm. (C), o crânio exposto. (D) a criação de um sulco circular dentro do qual um retalho ósseo central é visto. Barra de escala = 900 µm. (E) após a remoção da aba óssea, a abertura craniana estava cheio de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF). Barra de escala = 720 µm. (F) instalação da janela óptica sobre a abertura craniana e selar a borda da janela com super cola. A dura-máter e os vasos sanguíneos são visíveis através da janela óptica. Barra de escala = 600 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig4.jpg"> Figura 4 : Cálcio e dendrítica imagem. (A1) Identificar regiões de interesse usando vasos sanguíneos (BV) como pontos de referência em Thy1-GCaMP6s de ratos. (A2) Identifica as mesmas pilhas etiquetadas (setas vermelhas) ao longo do tempo usando os mesmos pontos de referência e registro. (B) representante Z-projeção dos sinais de cálcio nos neurônios (setas vermelhas) do córtex somatossensorial primário (S1). Barra de escala = 10 µm. (C1-3) a visualização de dendrites (verdes) e um vaso sanguíneo (vermelho) em B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J em diferentes profundidades na camada II da região S1 em 1 dia após a instalação da janela óptica. (D) Z-projeção de várias imagens na mesma região em 1 dia. (E) Z-projeção de várias imagens na mesma região em 7 dias após a instalação da janela óptica. Observe a notável estabilidade do número e localização dos espinhos adultos e ramificações dendríticas entre 1 dia e 7 dias após a instalação da janela óptica. Barra de escala = C-E 5 µm (C-E). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig5.jpg"> Figura 5 : Rastreamento de sinal do cálcio. (, B) Exemplos de filmes importados t-series com ImageJ para análise de dados de 2 neurônios (neurônio 1 e neurônio 2, respectivamente). (C) A planilha mostra dados sobre a intensidade de iluminação da região de interesse (ROI; dentro do neurônio e 2 distintas regiões vizinhas como medidas de fundo). (D) cálculo do pico: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (o fundo média fluorescência [FB] e as mudanças de fluorescência da soma expressa em ΔF/F [F]). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig6.jpg"> Figura 6 . Imagens representativas cálcio. (-D) Transiente de cálcio (verde) e os vasos sanguíneos (vermelhos) em pontos diferentes de tempo em segundos em um mouse em 7 dias após a instalação da janela óptica. Seta amarela: um neurônio relativamente menos ativo. Seta branca: um neurônio de cravação. (E, F) Z-projeção de um período de gravação de 3 min para o vermelho (vasos sanguíneos) e canais verde (cálcio) (E) e canal verde só (F). (G) Selected neurônios e suas áreas adjacentes de fundo são marcadas. Barra de escala = 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Este método permite o registro e quantificação da atividade neural em regiões corticais bilaterais do camundongo por um período prolongado in vivo. A técnica de dois fótons tem a vantagem de detectar atividade simultaneamente em grande ou dispersa população neuronal por um longo período. As implicações dessa técnica se estenderam para a investigação de padrões de atividade em populações neuronais definidas em diferentes regiões do cérebro vivo.12 horas antes de iniciar o procedimento, aqueça as janelas ópticas a 50 graus Celsius em 70% de etanol. Uma janela óptica consiste em um vidro de cobertura superior de cinco milímetros de diâmetro redondo e uma porção inferior contendo um vidro de cobertura de três milímetros redondo. Ao final da incubação do aquecimento, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um anestesizado de 20 a 25 gramas 1/2 a 2 1/2 mês de idade, o rato Thy1 GCaMP6s, e aplique pomada aos olhos do animal.Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento coberta com uma cortina estéril e use um adaptador de tenção de cabeça para os ratos estabilizarem a cabeça. Raspe a maior parte do couro cabeludo com uma navalha de duas bordas, e limpe a pele exposta com almofadas de preparação de álcool estéril sequencial e esfregões de solução de povidone-iodo. Em seguida, use um par de tesouras para fazer um corte retangular de dois por três milímetros no couro cabeludo no lado direito do crânio.Usando um cotonete, empurre a pele de lado para criar uma área de exposição de mais de três milímetros de diâmetro, e use uma lâmina microcirúrgica cega para remover suavemente o tecido conjuntivo ligado ao crânio. Com uma broca dentária, marque suavemente um círculo de três milímetros de diâmetro ao redor da área S1. Depois de fazer um círculo semelhante no lado esquerdo do crânio, aplique uma fina camada de supercola cianoacrilato em ambos os lados do osso para fornecer uma base para uma aplicação de cimento dental.Sob um microscópio dissecando, use uma micro broca de alta velocidade para diminuir uma ranhura circular no lado direito do crânio ao redor da área S1 para criar uma borda lisa, aspirando os detritos ósseos com um vácuo conforme necessário. Depois de uma profundidade óssea de aproximadamente 2/3 ter sido alcançada, lentamente e cuidadosamente fina o 1/3 restante do osso até que um retalho ósseo circular tenha sido completamente liberado do crânio circundante. Use um par de fórceps 5/45 para remover lentamente e cuidadosamente o pedaço circular do osso para expor a dura, tomando cuidado para evitar danificar os vasos de pial.Depois de remover um retalho ósseo do lado esquerdo do crânio da mesma maneira, enxágue a janela óptica para o lado direito do crânio com soro fisiológico estéril, e verifique se há imperfeições sob um microscópio estéreo. Instale a janela óptica sobre a região da craniotomia com a parte superior da janela repousando sobre o crânio e a parte inferior dentro da abertura craniotomizada, descansando sobre a dura, na presença de fluido espinhal cerebral. Use a supercola de cianoacrilato para selar a parte superior da borda óptica da janela para o crânio.Quando a cola secar, aplique cimento dental preto na borda do vidro, o resto do lado direito do crânio exposto e as margens da ferida para bloquear a luz. Em seguida, instale a janela óptica esquerda e permita que o animal se recupere com o monitoramento até a recumbência total. Sete a dez dias após o procedimento, coloque o animal anestesiado no adaptador de tenção de cabeça em uma almofada de aquecimento sob um microscópio de dois fótons, tomando cuidado para que a janela óptica e o lado direito do crânio sejam orientados perpendicularmente ao eixo óptico do microscópio.Adquira uma imagem inicial do mapa de referência da janela craniana usando iluminação de campo brilhante na ampliação quatro vezes. Após a aquisição de múltiplas imagens da mesma região de interesse, imagem a dinâmica do cálcio dentro da área S1 no hemisfério esquerdo e calcule as mudanças na fluorescência de cada região de interesse em ambos os lados do crânio. Nestas imagens representativas, dendritos e um vaso sanguíneo dentro de um mouse expresso em EGFP foram visualizados em diferentes profundidades na camada dois da região S1 um dia após a instalação da janela óptica.As imagens de projeção Z foram capturadas nos dias um e sete após a implantação da janela óptica, ilustrando um número notavelmente estável e localização de ramos e colunas dendríticas durante o período experimental. A medição do transitório de cálcio intracelular em camundongos transgênicos Thy1 GCaMP6s permite a quantificação da atividade espontânea de cálcio e populações de neurônios piramifecionais de camada cinco localizados tão profundos quanto 500 micrômetros abaixo da pia, bem como o cálculo do número médio de respostas espontâneas ao longo do tempo. Um pesquisador treinado tanto na preparação da janela craniana quanto em técnicas in vivo de imagem de cálcio de dois fótons deve ser capaz de obter gravações de 100 a 200 neurônios em ambos os lados do crânio em um a dois animais por dia.Com uma janela óptica aberta em cada lado do crânio, o método permite o registro da atividade neural em regiões cerebrais míferas simétricas para imagens de cálcio prolongadas e estáveis in vivo. Este método também pode ser usado para estudar a atividade cortical e a plasticidade após lesões unilaterais ao sistema nervoso periférico ou central. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como instalar janelas cranianas bilaterais para medir a dinâmica do cálcio usando microscópio de dois fótons em camundongos transgênicos Thy1 GCaMP6s.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a gravação da atividade neural do cérebro através de uma janela óptica em camundongos transgênicos. Os camundongos expressam uma proteína fluorescente que permite a detecção de atividades neurais. Uma pequena parte do crânio é cuidadosamente removida para instalar uma janela óptica, e o crânio é então coberto com cimento preto para bloquear a luz antes da imagem.

Instalação de janelas ópticas no cérebro de camundongos transgênicos para imagens de atividades neurais

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp..  (2022) Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

Este protocolo detalha como aplicar e executar gravações da fotometria da multi-fibra, como corrigir para artefatos cálcio-independentes, e considerações importantes para a imagem latente da fotometria da duplo-cor.

Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

Visualização in vivo da atividade espontânea no córtex sensorial de camundongos neonatais com resolução de neurônio único

O presente protocolo descreve imagens de cálcio in vivo para medir as respostas de conjuntos de neurônios lombares-6 DRG a estímulos somáticos e viscerais. Comparações completas podem ser feitas entre neurônios que respondem a diferentes estímulos. Este protocolo é valioso para investigar mecanismos de dor visceral e estimulação somática, como a acupuntura.

in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

Este estudo apresenta uma manipulação cirúrgica para expor o T-DRG em camundongos anestesiados para imagens de cálcio in vivo , juntamente com registros de ECG síncronos. Este método representa uma ferramenta de ponta para estudar a estimulação elétrica nervosa periférica e as entradas de órgãos viscerais torácicos, bem como suas interações no nível sensorial primário.

Imagem de cálcio dos gânglios da raiz dorsal torácica (DRG) in vivo e registro de ECG para estudar a estimulação de nervos periféricos

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a registrar atividade neural bilateral no córtex somatossensorial de camundongos Thy1-GCaMP6s usando janelas ópticas duplas e microscopia de dois fótons. Este método permite imagem prolongada de cálcio in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

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