Uma rede sem fio, Interface bidirecional para gravação na Vivo e estimulação da atividade Neural em livremente, comportando-se ratos

Resumo

Uma rede sem fio, sistema bidirecional para multi-canal neurais gravações e estimulação em livremente se comportando ratos é introduzido. O sistema é leve e compacto, tendo assim um impacto mínimo sobre o repertório comportamental de animal´s. Além disso, este sistema bidirecional fornece uma ferramenta sofisticada para avaliar relações causais entre os padrões de ativação do cérebro e comportamento.

Resumo

Na vivo eletrofisiologia é uma técnica poderosa para investigar a relação entre a actividade cerebral e comportamento em uma escala de milissegundos e micrômetro. No entanto, métodos atuais dependem principalmente de gravações de cabo tethered ou apenas usam sistemas unidirecionais, permitindo a gravação ou a estimulação da atividade neural, mas não no mesmo tempo ou no mesmo alvo. Aqui, uma nova rede sem fio, dispositivo bidirecional para gravação multicanal simultânea e estimulação da atividade neural em livremente se comportando ratos é descrito. O sistema funciona através de um único estágio de cabeça portátil que transmite a atividade gravada e pode ser direcionado em tempo real para a estimulação do cérebro usando um software multicanal baseado em telemetria. O palco principal é equipado com um pré-amplificador e uma bateria recarregável, permitindo gravações de longo prazo estáveis ou estimulação para até 1 h. importante, o palco principal é compacto, pesa 12 g (incluindo bateria) e, portanto, tem um impacto mínimo sobre o animal´s repertório comportamental, tornando o método aplicável a um amplo conjunto de tarefas comportamentais. Além disso, o método tem a grande vantagem que o efeito da estimulação cerebral na atividade neural e comportamento pode ser medido simultaneamente, fornecendo uma ferramenta para avaliar as relações causais entre os padrões de ativação específicas do cérebro e comportamento. Esta característica torna o método particularmente valioso para o campo da estimulação profunda do cérebro, permitindo avaliação precisa, monitoramento e ajuste dos parâmetros de estimulação durante experimentos comportamentais a longo prazo. A aplicabilidade do sistema foi validada utilizando o colículo inferior como um modelo de estrutura.

Introdução

Uma questão fundamental em neurociência é atividade como elétrica em circuitos neurais definidos gera determinadas formas de comportamento. Na vivo eletrofisiologia é uma técnica poderosa para abordar esta questão, fornecendo uma ferramenta para gravar ou estimular a atividade elétrica no cérebro, enquanto os animais estão realizando determinadas tarefas comportamentais. No entanto, os sistemas atuais frequentemente dependem cabo tethered gravações^1,2, provavelmente restringir a mobilidade e impedindo a plena expressão do repertório comportamental de animal´s. Além disso, na maior parte sistemas unidirecionais são usados, permitindo que qualquer gravação^3,4,5 ou estimulação^6,7 da atividade neural, mas não no mesmo tempo ou mesmo alvo, tornando-se difícil de desvendar as relações causais entre os padrões de ativação específicas do cérebro e comportamento. Apenas alguns sem fio, sistemas bidirecionais para preparações na vivo estão atualmente disponíveis. No entanto, eles são geralmente pesados (40-50 g) e consistem de dois portáteis unidades separadas, ou seja, um palco principal e uma mochila conectada para poder baseado em bateria alimentação^8,9,10, tornando-os menos flexível e aumentando o risco de desconexão do cabo, por exemplo, durante o Self enfeitando o comportamento. Nenhum dos acima mencionados sistemas sem fio oferecer unidades de microeletrodos implantáveis para adquirir um conceito integrado completo da atividade neural durante o comportamento ethologically válido completo com alta reprodutibilidade das condições experimentais.

Aqui, uma nova rede sem fio, dispositivo bidirecional para gravações na vivo e estimulação da atividade neural em livremente se comportando ratos é introduzido. O sistema de Wireless de Thomas (TWS) opera através de um único removível cabeça estágio que pode transmitir a atividade multicanal, usando até quatro canais de gravação independente e pode ser direcionado para estimulação elétrica do cérebro em tempo real. Além disso, uma unidade de microeletrodos cronicamente implantável compatível com o TWS foi desenvolvida que permite tanto a estimulação neural e a gravação. Também é apresentada uma interface de usuário gráfica do software TWS, para gravação e estimulação. Este estudo descreve a implementação de validação e na vivo de todo o dispositivo.

Para validar o sistema TWS o colículo inferior foi escolhido como uma estrutura neural alvo porque uma resposta comportamental evidente pode ser provocada pela sua estimulação elétrica. É amplamente conhecido que a estimulação elétrica do colículo inferior provoca incondicionadas 'medo-like' respostas comportamentais em ratos, como precaução, posturas lateralmente, arqueando as costas, congelamento e comportamento de fuga (fuga). Esse padrão de resposta imita reações a temer evocado por desafios ambientais, tais como um acontecimento nocivo percebido, ataque ou ameaça à sobrevivência^11,12,13. Supunha-se que sendo capaz de provocar um comportamento tão claro e inequívoco proporciona um verdadeiro desafio para os TWS.

Protocolo

todos os protocolos e experimentos estavam em conformidade com as actuais directrizes europeias (2010/63/UE) e aprovado pelas autoridades regionais (Regierungspräsidium Gießen, senhor 20/35 Nr.25/2015).

1. animais

1. adultos ratos Wistar machos (200-250 g) em grupos de 3-4 em condições padrão de laboratório pelo menos uma semana antes da cirurgia para permitir que a aclimatação da casa.
2. Dois dias após a cirurgia, ratos de casa em pares. Cobrir gaiolas simples com tampas de acrílico altas. Evitar tampas convencionais feitas de grelha metálica, desde que os implantes podem ficar presos, aumentando o risco de que eles se tornam danificado e/ou instável ao longo do tempo.

2. Cirurgia estereotáxica

1. antes de iniciar a cirurgia, organizar e preparar o equipamento e os materiais a seguir:
   1. obter equipamento cirúrgico estéril, consistindo de tesoura estéril, sem corte-extremidade pinças, espátulas, cirúrgicas cortador, broca dental e brotos de algodão.
   2. obter drogas e produtos químicos, incluindo o isoflurano, xilocaína, cloridrato de tramadol, pomada do olho de dexpantenol, 3% de peróxido de hidrogênio, povidona iodo e 70% de etanol.
   3. Obter o material de fixação, incluindo parafusos de aço inoxidável, resina acrílica, colagem ultravioleta e protetor de cap.
   4. Obter uma unidade de microeletrodos, (i) consiste em um eletrodo de gravação única (vidro de quartzo isolado microeletrodos de platina de tungstênio, com forma de ponta cônica, diâmetro exterior: 80 µm, ponta cónica, impedância de 1 kHz: 500 kOhm) ou um tetrode (vidro de quartzo isolados de microeletrodos de platina/tungstênio 4 núcleos, diâmetro exterior: 100 µm, ponta cónica, impedância de 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) um eletrodo de estimulação (fio de platina/irídio (90% de platina, 10% de irídio), núcleo de diâmetro 125 µm, diâmetro externo de 150 µm, impedância < 10 kOhm) conectado a uma placa de contato e (iii) um eléctrodo de referência de fio de platina (diâmetro do eixo, 100 µm; figura 1A).
   5. Obter eléctrodo colado com cola solúvel em água para a unidade de microeletrodos e testados para funcionalidade pelo menos 2h de antecedência ( figura 1B).
   6. Obter um sistema convencional amarrado, consistindo de um pré-amplificador diferencial, um amplificador principal e uma bandpass filtro amplificador para gravações.
   7. Obter material adicional, tais como luvas, soro fisiológico, seringas e almofada de aquecimento.
   8. Obter em casa gaiolas (L x W x h: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Procedimento
   Nota: implantação do eletrodo é executada durante uma cirurgia estereotáxica convencional sob anestesia de isoflurano.
   1. Certifique-se de que o experimentador está usando luvas, máscara cirúrgica e jaleco.
   2. Iniciar colocando o animal em uma câmara de indução de anestesia (isoflurano 4-5%, o fluxo de oxigênio 1 L/min, duração ~ 5 min).
   3. Teste para perda de reflexos (reflexos de cauda e dedo do pé) com fórceps para confirmar a anestesia profunda.
   4. Coloque a cabeça do animal em uma máscara de anestesia fixada em torno da barra de incisivo superior da armação estereotáxica e ajustar a anestesia (2-3% de isoflurano, fluxo de oxigênio 0,7-0,8 L/min).
   5. Corrigir e alinhar horizontalmente o animal ' cabeça de s no aparato estereotáxica usando barras de orelha e incisivo superior bar
   6. Raspar o campo cirúrgico usando tesouras cirúrgicas ou uma tesoura e esterilizar com iodopovidona.
   7. Colocar o animal em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia e tratar os olhos com bálsamo de olho dexpantenol para impedi-los de secagem.
   8. Injetar xylocaine (0,3 a 0,4 mL, por via subcutânea, s.c.) no centro do campo cirúrgico.
   9. Teste para perda de reflexos novamente.
   10. Fazer uma pequena incisão (1,5 cm) com um bisturi no meio do campo cirúrgico para expor o crânio. Separar a pele suavemente e remover o tecido residual usando a pinça, tesoura e espátula.
   11. Limpe cuidadosamente o crânio usando peróxido de hidrogênio-revestido cotonetes.
   12. Furos 4-5 pequenas (4,7 mm) no crânio para fixação de parafusos de aço inoxidável.
   13. Conectar o microeléctrodo unidade/eléctrodo ao pré-amplificador e anexar para o micromanipulador estereotáxica ( figura 1B e 1C).
   14. Um buraco (aproximadamente 7 mm) no crânio acima da área de destino usando as coordenadas de um atlas do cérebro de acordo com o animal utilizado. No presente estudo, posicione as pontas de eletrodo vistas o colículo inferior, utilizando as seguintes coordenadas, com o bregma, servindo como referência: anterior/posterior, − 8.8 mm; medial/lateral, 1,5 mm; e dorsal/ventral, 3,5 mm ¹⁴.
   15. Absorver qualquer sangue com cotonetes.
   16. Introduzir verticalmente a unidade de microeletrodos até as pontas de eletrodo atingem o alvo.
   17. Posicione o cabo de terra ao longo dos parafusos de aço inoxidável e sob a pele.
   18. Monitor spike atividade e cuidadosamente ajustar a posição do eletrodo com micromanipulador até atingir uma zona de neurônios ativos na estrutura alvo e detectar atividade neural com uma relação sinal-ruído adequada para spike classificação.
   19. Fixar a unidade de microeletrodos no crânio com colagem ultravioleta e cobrir o contato de placa e parafusos com resina acrílica.
   20. Injetar soro fisiológico (1 mL i.p.) e tramadol (25 mg/kg, s.c.) para prevenir a desidratação e assegurar analgesia pós-operatória, respectivamente.
   21. Desconectar a unidade de microeletrodos do porta-eletrodo usando um pincel embebida em água.
   22. Paragem de anestesia, remova cuidadosamente o rato da armação estereotáxica. Desconecte o pré-amplificador o microeléctrodo unidade
   23. Conectar-se a proteção de cap na unidade de microeletrodos implantada e desconectá-lo somente durante os procedimentos experimentais.
   24. Manter os animais em pares na casa-gaiola a partir do segundo dia após a cirurgia.
   Animais de
   25. monitor diariamente para possível ferida infecção, peso corporal, condição de saúde e comportamento geral por um período de 7 dias após a cirurgia. Após este período de recuperação, realizar na vivo eletrofisiologia e experimentos comportamentais.
       Nota: O procedimento cirúrgico dura entre 60-90 min. Durante a cirurgia, cauda filme reflexos devem ser continuamente monitorizados e ajustado de anestesia, se necessário.

3. Na Vivo Eletrofisiologia

1. equipamento e procedimento
   Nota: gravações eletrofisiológicas e estimulação são executadas usando o TWS.
   1. Obter uma fase de cabeça com um pré-amplificador integrado e bateria ligada (gravação de quatro canais; analógica, gravação de intervalo de entrada: 0-12 mV pk-pk; saída de estimulação: ±625 µA; L x W x h: 24 milímetros x 22 x 12 mm; peso: 6 g sem bateria, 12 g com bateria; bateria tempo até 1 h). Nesta fase a cabeça é apropriada ser conectado diretamente à unidade de microeletrodos implantados através de um conector multipolar em miniatura ( Figura 2).
   2. Obter uma bateria (acumulador de iões de lítio, 3.7-4.2 V DC, 230 mAh, 27 x 20 mm x 6 mm, tempo de operação de 1 h) montado em cima do palco principal ( Figura 2). Se for necessário usar a substituição da bateria recarregável com capacidade de 450 mA para aproximadamente tempo de operação de 2,5 h. Certifique-se que uma luz verde acende-se na fase de cabeça enquanto a bateria está conectada ao proprietário.
   3. Obter um transceptor (transmissor-receptor) conectado a um computador pessoal via porta USB padrão e permite uma operação sem fio para até 5 m ( Figura 2E).
   4. Obter um computador pessoal com software TWS para estimulação elétrica e gravação da atividade neural ( Figura 3 e Figura 4 < / strong>).
   5. Obter um pré-amplificador amarrado e um sistema de aquisição de dados utilizado durante a cirurgia (ver item 2.1.5) para gravações e um gerador de estímulo para a estimulação, a fim de comparar a eficácia do TWS em acordado ratos uma semana após a cirurgia.
      Nota: A estimulação elétrica é fornecida e atividade extracelular dos neurônios único é gravada a partir da mesma unidade de microeletrodos implantados usando ambos os sistemas. Os parâmetros de estimulação (intensidade de corrente, pulso e frequência) devem ser ajustados para cada animal de acordo com a região do cérebro como alvejada. No presente estudo, um 150-250 µA, 2500 Hz corrente foi usada para estimular o colículo inferior.
2. Comportamental ensaios
   Nota: uma vez que nenhuma barreira de metal é introduzida entre o transceptor e o estágio de cabeça animal, a TWS é aplicável a um amplo conjunto de tarefas comportamentais. Como testes de comportamentais exemplares, foi usado em campo aberto para medição de atividade comportamental geral e da elevada além de labirinto, um teste padrão para avaliar o comportamento de ansiedade em roedores ¹⁵. Uma câmera de vídeo foi colocada centralmente acima campo aberto e elevada mais labirinto para gravações comportamentais.
   1. Antes do teste comportamental, lidar com cada animal em três dias consecutivos (5 min a cada dia). Antes de cada período de tratamento de conectar o palco principal com bateria para a unidade de microeletrodos implantada anteriormente. Não faça qualquer gravação ou estimulação durante o manuseio.
   2. Campo aberto
      1. Coloque o rato no centro do campo aberto (40 x 40 cm x 40 cm; vermelho ~ 30 Lux de luz) e deixe-o explorar o aparelho pelo menos 5 min sob gravação neural.
      2. Determinar o limiar de fuga - intensidade de corrente mínima produzindo correr ou saltar. No presente estudo, entregar uma estimulação de 2500 Hz de alta frequência (largura de pulso: 100 µs; intervalo de pulso: 100 µs) para o colículo inferior em intervalos de 1 min, aumentando a intensidade de corrente em 20-50 µA passos até ratos mostraram escapar comportamento.
      3. Voltar o rato da gaiola em casa, limpar o campo aberto (solução de ácido acético 0,1%) e secá-lo
         Nota: A fim de comparar a eficácia da estimulação da TWS com o sistema tradicional de amarrados acima descrito o procedimento foi realizado utilizando ambos os sistemas.
   3. Elevada e mais labirinto
      Nota: plus-labirinto usado nesses experimentos foi feito de acrílico cinzento e consistia de dois braços abertos (50 cm comprimento x 10 cm de largura) e dois fecharam braços (50 cm comprimento x 10 cm de largura, com muros altos de 40 cm) que estendia uma pla central TForm elevada 50 cm acima do chão ¹⁶.
      1. Colocar o rato no centro do virado plus-maze para um braço aberto e deixe-o explorar livremente o aparelho sob gravação contínua durante 5 min.
      2. Gravar o número de entradas em, e o tempo gasto nos braços abertos e fechados ao longo de um período de 5 min.
      3. Retornar o rato para sua gaiola em casa, limpo (solução de ácido acético 0,1%) e seque o labirinto antes de cada teste
   4. Perfusão e histologia
      1. anestesiar o rato com xilazina/cetamina (150 mg/kg e 100 mg/kg, respectivamente; i.p.).
      2. Ligar a unidade de eletrodo implantado no cabo de estimulação e aplicar a estimulação elétrica (atual intensidade 50 µA, largura de pulso: 100 µs; intervalo de pulso: 100 µs) durante 90 s a fim de produzir uma pequena lesão ao redor da ponta do eletrodo.
      3. , Desconecte o cabo de estimulação e perfundir o animal através do ventrículo esquerdo com soro fisiológico, seguido por 200 mL de paraformaldeído 4% em tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,3 (para uma descrição detalhada, consulte referência ¹⁷ ).
      4. Remover o cérebro e mergulhá-lo para 4h no fixador fresco em 4 ° C.
      5. Certifique-se que a temperatura da câmara do criostato principal está a -20 ° C.
      6. Congelar o cérebro ao gelo seco e corte-os em 50 µm secções coronal usando um criostato serial.
      7. Mancha as seções com cresylviolet para localizar as posições das pontas do eletrodo, de acordo com o atlas por Paxinos e Watson ¹⁴.

Resultados

Dados técnicos do TWS

O sistema sem fio oferece 4 canais de gravação independente e canal 1 estimulação. Atividade extracelular foi pego pelo eléctrodo de núcleo único de gravação e repassada para o sinal de entrada de alta impedância do sistema sem fio. O sinal gravado foi (x200) pre-amplificado por um pré-amplificador de entrada diferencial, C.A.-acopladas e bandpass filtrada (sinal fixo de largura de banda, 500 Hz... 5 kHz) para gravar apenas multi-unidade atividade, porque no presente estudo o interesse principal era a atividade da unidade de registro e potenciais de campo não local. O principal-amplificador de ganho programável integrado oferece ganho ajustável-software para os quatro canais de gravação (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). A cadeia de sinal completo do sistema sem fio oferecidos valores de ganho global de x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 e x12800. Após a amplificação e a filtragem, o sinal analógico foi digitalizado por um conversor digital analógico, modulado em uma portadora de alta frequência e transmitido por um transceptor de rádio usando a faixa ISM de 2.4-2.5 GHz. O mesmo tipo de transceptor, utilizou-se do outro lado do caminho de transmissão. Este transceptor segundo foi conectado a um computador pessoal através de uma porta USB. O caminho de transmissão foi usado para transmissão de dados bidirecional para enviar os sinais gravados extracelulares do animal para o computador e vice-versa, os parâmetros de controle para amplificação de sinal e estimulação do computador para o animal.

Usando o TWS, foi possível gravar a atividade cerebral de múltiplas unidades e modificar o comportamento do animal, estimulando o colículo inferior, enquanto o rato estava movendo-se livremente no campo aberto com êxito. O transceptor foi colocado até 5 m de distância do animal e foi conectado ao computador através de um USB port (ver Figura 2). Uma comparação entre as qualidades de sinal gravado rendeu com o amarrados e o sistema sem fios é demonstrado na Figura 5. A TWS registros multi-unidade atividade com uma qualidade de sinal similar como um sistema de gravação com fio. O microestimulador é um verdadeiro estimulador sem fio atualiza os parâmetros de estimulação em tempo real, ou seja, o sinal de estimulação, cujos parâmetros são definidos com o software TWS é passado para o eletrodo de estimulação conectado ao palco principal dentro de algumas milissegundos depois de apertar o botão de estimulação. Portanto, foi possível alterar os parâmetros de estimulação sem levar o animal fora da gaiola. Esta característica tem a vantagem que um pode minimizar o tempo para experimentos de estimulação.

Um software TWS foi especialmente projetado para permitir o controle de todos os recursos do sistema sem fio (por exemplo, gravação e estimulação) através de interface gráfica de um usuário (Figura 3 e Figura 4). Para microestimulação, utilizou-se um sinal de estimulação que foi desenvolvido usando a interface gráfica do usuário do software TWS. O estimulador da TWS foi usado em um modo de estimulação equilibrado de corrente constante de carga. O padrão de estimulação foi enviado sem fio para o estimulador de corrente constante integrado na unidade sem fio cabeça de palco. Estimulação atual foi aplicada entre um microeléctrodo trabalho colocado em alvo de interesse (como por exemplo o colículo inferior no presente estudo) e um eletrodo de contador distante maior que serviu como o eléctrodo de terra ou referência do TWS. Dependendo da impedância do eletrodo de estimulação e conformidade de tensão do estimulador de corrente constante, é possível usar uma variedade de estimulação máxima atual de ±625 µA, embora um tanto inferior limite atual foi exigido nas experiências de presente. Aqui, bifásico carga equilibrada estimulação constante-atual foi usada com correntes de pico até 300 µA. Em caso de estimulação bifásica, o primeiro pulso é usado para obter o efeito fisiológico e o segundo pulso geralmente reverte processos eletroquímicos que ocorrem durante a estimulação de pulso¹⁸. O palco principal TWS fornece padrões de estimulação em tempo real definida através da interface gráfica do usuário do software TWS (ver Figura 4).

O software TWS é dividido em três seções principais: (i) janela principal com controles para gravação e estimulação, uma janela de gerador de estímulo (ii) com todas as opções de configuração para os parâmetros do sinal de estimulação e uma janela do reprodutor (iii) para reproduzir o arquivos de dados gravados. A janela principal permite ao usuário exibir os sinais gravados de até 4 canais de gravação, definir o ganho para todos os canais e iniciar/parar a gravação dos sinais de exibido. Os dados do sinal são armazenados em um arquivo do disco duro do computador. O caminho do arquivo é definido no menu de configuração. Além dos parâmetros de gravação, a janela principal permite iniciar e parar o processo de estimulação. A estimulação constante atual que é passada através do eletrodo de estimulação no cérebro animal é exibida em tempo real na tela da janela principal. Os parâmetros do sinal de estimulação são pré-ajustados na janela de configurações de parâmetro de estímulo. É possível definir mono ou bifásico trens de pulso de estimulação e para definir a estimulação comumente usada todos os parâmetros de pulso, como por exemplo largura, amplitude de pulso, de pulso, tempo entre pulsos, etc. (para detalhes, ver Figura 4). A função do pulso de estimulação que resulta dos valores de parâmetro pré-selecionado é mostrada em uma exibição gráfica da janela do gerador de estimulação.

O software TWS foi projetado de acordo com aspectos de usabilidade. A usabilidade do software é um factor essencial para garantir o bom andamento do experimento estimulação/gravação sem fio e um ambiente de trabalho seguro e confortável. Também ajuda a melhorar a reprodutibilidade do experimento.

Dados de gravação unitárias e estimulação elétrica

Extracelular multi-unidade atividade sucessivamente foi gravada no colículo inferior do eléctrodo implantado do mesmo usando o TWS e um sistema convencional de gravação amarrados. A Figura 5 mostra representativos dados brutos gravados usando ambos os sistemas, enquanto o animal se movia livremente em campo aberto. Comparação direta dos sinais sugere formas de onda de pico semelhante e os níveis de ruído (Figura 5A e 5B). Uma demonstração da forma spike é retratada na 'e B'.

Desde que os ratos não tentou remover o palco principal TWS após a cirurgia e durante os dias subsequentes, foi assumido que não interfere significativamente com os seus movimentos e não causar desconforto. Assim, usando o TWS, um problema comum em gravações amarrados de ratos foi evitada, tais como a remoção e mastigação dos conectores e cabos. Com efeito, ratos com o estágio de cabeça TWS foram capazes de explorar o campo aberto e mais labirinto (sEE 1 filme) expositoras normais cruzamentos, criação e grooming comportamentos.

Além disso, os parâmetros de estimulação usados com o convencional sistema amarrado ou TWS evocou o mesmo resultado comportamental, escapar aqui o comportamento. A partir de 100 µA, a amplitude de corrente de estimulação foi aumentada passo a passo até o limite de fuga - mínima intensidade de corrente produzindo correr ou saltar - foi alcançado e o comportamento de fuga foi provocado. Os limites individuais de fuga de 4 ratos foram semelhantes quando usando ambos os sistemas (Figura 5).

Figura 1: Microeletrodos TWS unidade (1) gravação único eletrodo/tetrode, eletrodo de estimulação (2), placa de conexão de fibra (3) eletrodo, cabos de conexão (4) flexível, fio terra (5), placa (6) conector, conector (7) masculino ou feminino para sistema TWS (A); TWS microeletrodos unidade ligada do pré-amplificador (8) e o porta (9); (B) pronto para ser anexado a uma armação estereotáxica (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Vista superior do palco TWS cabeça montado módulo (A) sem fonte de alimentação do acumulador. Total de dimensões: altura 12,5 m, profundidade de 24mm (19,3 mm + 4,7 mm), largura 22,1 mm, peso: 5,96 vista inferior g. (B) mostrando o conector de unidade de eletrodo; fonte de alimentação de acumulador, altura 9 mm, profundidade de 26 mm, largura de 20 mm, peso 6 g (C); uma visão geral dos componentes TWS usado para este teste: cabeça (1) unidade de palco com acumulador montado no crânio animal´s, unidade de (2) receptor conectado ao computador porta USB, software de TWS (3) (D); foto de um rato livremente movendo e mostrando o palco principal TWS conectado à unidade de microeletrodos implantados anteriormente (E) e software de TWS mostrando sinais gravados exemplares (F). O palco principal TWS fornece padrões de estimulação em tempo real definida através de interface gráfica do usuário do software TWS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: interface de usuário gráfica de software TWS, gravação de tela. O desempenho de gravação da TWS com um única gravação bipolar eletrodo, implantado no colículo inferior, é retratado na tela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: interface gráfica do usuário do TWS software. tela de estimulação (A) e especificações de parâmetro de estimulação (B). Parâmetros do sinal de estimulação (C) como a largura de pulso (PxW), amplitude de pulso (PxA), inter atraso pulso (IPD), tempo entre pulsos (TBP), pulso por trem (PPT) e o tempo entre trens (TBT) são ajustáveis através da interface gráfica do usuário do TWS software. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Comparação qualitativa entre um sinal multi-unidade extracelularmente gravado com o TWS (A) e uma configuração de gravação com fio (B). Ambas as gravações foram obtidas da mesma TWS microeletrodos unidade (impedância 0.5MOhm) implantada no colículo inferior. A axial distância entre os dois contatos de eletrodo gravação foi aproximadamente 400 µm. A largura de banda de gravação do sistema com fio e o TWS foram idêntico (500 Hz... 5 kHz), os sinais foram amostrados com 40 kHz (com fio sistema) e 32 (TWS). Ambos os sistemas registrados multi-unidade atividade com uma qualidade de sinal semelhante. Não há nenhuma diferença clara em disparar taxas entre o TWS e gravações com fio. Forma de onda de potencial de ação do neurônio de ambas as gravações são mostrados na 'e B'. Parâmetros de estimulação semelhantes eram necessários para 4 ratos atingir o limiar de fuga utilizando um sistema amarrado (TS) ou TWS (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: Um rato exemplar exibindo comportamento exploratório normal durante o teste de labirinto mais A TWS permite que o animal entrar com os braços abertos e fechados sem fios tornando entrelaçado até no aparelho de teste, ainda é pequeno e leve o suficiente para que apenas minimamente interfere na tarefa em si. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Discussão

Apresentou-se aqui, um sistema sem fio amplamente acessível gravação e estimulação para Estudos eletrofisiológicos e comportamentais em animais movimentando-se livremente. A TWS foi validado em ensaios comportamentais usando o colículo inferior como um modelo de estrutura. A abordagem TWS tem várias vantagens sobre os já existentes. Em primeiro lugar, o sistema usa um único portátil TWS cabeça-palco equipado com um pré-amplificador e uma bateria recarregável, permitindo gravações de longo prazo estáveis para até 1 h com a mesma bateria e distância de operações sem fio de até 5 m. em segundo lugar, é o palco principal do TWS luz e compacto, pesando 12 g incluindo a bateria e foi desenvolvido para evitar o rato de remoção de fase de cabeça e mastigar os fios. Foi bem tolerado pelos animais desde nenhum impacto sobre o repertório comportamental de animal´s com e sem o TWS cabeça fase observou-se, tornando o sistema aplicável a um amplo conjunto de tarefas comportamentais. Em terceiro lugar, o sistema transmite em tempo real. Em quarto lugar, através da estimulação da atividade neural e gravação simultânea bidirecional, o sistema fornece uma ferramenta sofisticada para avaliar as relações causais entre os padrões de ativação cerebral específica e comportamento, assim, superar as deficiências de sistemas unidirecionais. Esta característica torna o método particularmente valioso para o campo da estimulação profunda do cérebro, que geralmente requer avaliação precisa, monitoramento e ajuste dos parâmetros de estimulação durante experimentos comportamentais a longo prazo. Finalmente, uma unidade de microeletrodos cronicamente implantável foi desenvolvida com gravação integrada, estimulação e eletrodo de referência que pode ser facilmente implantado durante uma cirurgia estereotáxica convencional. Deste ponto de vista, a TWS é um sistema integrado sem fios que aumenta a reprodutibilidade de experimentos de estimulação e gravação. A qualidade da gravação da TWS foi mostrada para ser similar à qualidade de gravação rendida com um sistema de gravação com fio comercialmente disponível (ver Figura 5).

É amplamente conhecido que a estimulação elétrica do colículo inferior em ratos provoca clara fuga comportamento caracterizado por correr ou saltar, que imita a reações de medo eliciada por desafios ambientais^{11,12, 13}. Este comportamento foi induzido no presente estudo, estimulando o colículo inferior usando o TWS ou o tradicional sistema amarrado. Para testar a eficácia da estimulação do TWS, os limiares de fuga – mínima intensidade de corrente produzindo correr ou saltar – foram comparados usando ambos os sistemas. Ratos com o estágio de cabeça TWS são capazes de correr rapidamente, pulando e saindo do campo aberto, ou seja, Exibir comportamento de fuga típico, com maior liberdade de movimento. Importante, os limiares de fuga foram semelhantes em relação ao tradicional sistema amarrado. Juntos, um paradigma bastante desafiador foi usado para testar a resistência do TWS, que domina-lo em uma maneira hassle-livre.

A TWS também é adequado para experimentos de estimulação elétrica crônica, uma vez que a unidade de microeletrodos implantada permite uso crônico. A TWS permite ajustar os parâmetros de estimulação com precisão em uma maneira de detectar com precisão a frequência e a quantidade de estimulação atual que é eficaz para eliciar uma resposta comportamental. Além disso, o mesmo animal foi estimulado com o limite atual mesmo 3 dias depois e a mesma resposta comportamental desejada foi provocada. Isto sugere que o tecido ao redor da ponta do eletrodo de estimulação não foi danificado pela estimulação atual que normalmente requer maior estimulação atual amplitudes de estímulos repetidos para eliciar a mesma resposta comportamental.

Além disso, é possível reduzir significativamente o tempo experimental, porque o micro TWS-estimulador atualiza parâmetros de estimulação em tempo real quando o experimentador altera-las na interface gráfica do usuário. Para a necessidade de pesquisa pré-clínica, outros estimuladores elétricos¹⁹ costumava ser reprogramado para atualização de parâmetro de estímulo. Nesses casos, o aparelho é programado por amarrar o animal via cabo a uma unidade de programação. Isso não é necessário ao usar o TWS.

Finalmente, a bateria é fixada para o início da fase de cabeça TWS e eletricamente conectado ao palco principal através de um conector de ímã de dois pinos para fácil troca da bateria. A vantagem é que, durante o experimento, é possível trocar a bateria sem desligar o estágio de cabeça TWS da unidade do eletrodo implantado, que é muito mais confortável para o animal. Durante o presente estudo, nós usamos uma bateria cujo tempo de operação é de apenas 1h. No caso do experimento leva mais de 1 h, é recomendável ter uma bateria carregada adicional disponível. A TWS pode ser conectado a substituição de baterias recarregáveis com capacidade de (i) 230 mA para o tempo de operação de 1 h, ou (ii) 450 mA para aproximadamente tempo de operação de 2,5 h. Ambos os tipos de baterias podem ser totalmente recarregados em 15 min.

Em resumo, o presente estudo descreve a operação do TWS projetado para estimulação neural e gravação de livremente se comportando pequenos animais. Apresenta também um conjunto completamente integrado de unidade de microeletrodos implantável, palco principal, receptor e softwares. A qualidade da gravação sem fio e estimulação é semelhante ao que do amarrados gravação de sistema com a vantagem de ser mais confortável, mais leve e mais seguro para o animal. Portanto, TWS pode ser usado para substituir o sistema amarrado, desde que não se restringe a mobilidade do animal e fornece um método flexível para controlar a estimulação e gravação neural sob circunstâncias onde outras abordagens seria difícil ou impossível. Portanto, TWS pode ser uma ferramenta importante para investigar a atividade como elétrica em circuitos neurais definidos gera determinadas formas de comportamento, uma questão fundamental em neurociência.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Thomas Wireless System (TWS) versão 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	O Thomas Wireless System (TWS) versão 2.0 é um sistema de telemetria multicanal portátil com laptop, um sistema operacional Microsoft Windows pré-instalado e software de controle TWS. O TWS inclui: baixo ruído 4 canais pré-ruído; e amplificador principal programável com largura de banda fixa, constante de canal único– estimulador de corrente para aplicação de pulsos de corrente bifásica, microestimulador programável por software, sistema de conectores implantáveis e uma unidade básica de estágio de cabeça para montagem em um animal. O sistema é fornecido com um transceptor com conexão de porta USB para laptops ou computadores pessoais de mesa, o software de controle executado no sistema operacional Windows da Microsoft. O sistema TWS pode ser usado para estimulação neural extracelular e registro em pequenos animais de comportamento livre (por exemplo, ratos, porquinhos-da-índia). Este sistema pode ser adaptado para ser usado em animais maiores (por exemplo, primatas) também.
Software para Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	incluído em AN001165	O software para o sistema sem fio Thomas está sendo executado no sistema operacional Microsoft Windows e fornece a interface gráfica do usuário (GUI) para o Thomas Wireless System (TWS). A GUI TWS oferece controle completo das funções TWS de gravação de 4 canais e estimulação de 1 canal.
Tetrodo implantável para gravação (4 canais) e estimulação (canal único)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Tetrodo implantável para gravação (4 canais) e estimulação (canal único) para uso com Thomas Wireless Systems (TWS). Especificações do tetrodo de gravação: material da fibra do tetrodo: fibra de tungstênio de platina isolada com vidro de quartzo, diâmetro externo da fibra do tetrodo: 100µ m, forma da ponta D, impedância 0,5-0,8MOHm; Eletrodo de referência: forma da ponta: D; Impedância: 300-500kOhm; Material: quartzglass isolado platina/tungstênio; Especificação do eletrodo de estimulação: material da fibra: platina/irídio, diâmetro: 125µ m, isolado com laca, forma da ponta : D, impedância: < 10kOhm, as dimensões do eletrodo podem ser especificadas pelo usuário final
Microeletrodo implantável para gravação (canal único) e estimulação (canal único)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Microeletrodo implantável para gravação (canal único) e estimulação (canal único) para uso com Thomas Wireless Systems (TWS). Especificações do eletrodo de gravação: material da fibra do eletrodo: fibra de tungstênio de platina isolada com vidro de quartzo, diâmetro externo da fibra do eletrodo: 80µ m/250µ m (especifique), forma da ponta D, impedância 0,5-0,8MOHm; Eletrodo de referência: forma da ponta: D; Impedância. 300-500kOhm; Material: quartzglass isolado platina/tungstênio; Especificação do eletrodo de estimulação: material da fibra: platina/irídio, diâmetro: 125µ m, isolado com laca, forma da ponta : D, impedância: < Suporte de 10kOhm
para implantação de eletrodos	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Haste metálica dobrada especial para implantação de microeletrodos para porta-eletrodos padrão. A haste é usada para segurar um eletrodo implantável. O eletrodo implantável é fixado à haste com cola especial solúvel em água Thomas RECORDING (AN001080). (O suporte do eletrodo não está incluído)
Fonte de alimentação do acumulador de substituição para o sistema sem fio Thomas (3,7V/230mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Bateria recarregável de substituição (acumulador) para o sistema sem fio Thomas com capacidade de 230mA por aproximadamente 1h de tempo de operação. (tamanho: 27 mm x 20 mm x 6 mm, peso aprox. 6g)
Fonte de alimentação do acumulador de substituição para o sistema sem fio Thomas (3,7V/450mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Bateria recarregável de substituição (acumulador) para o sistema sem fio Thomas com capacidade de 450mA por mais de 1h de tempo de operação. (tamanho: 48 mm x 30 mm x 4 mm, peso aprox. 11g)
Carregador de acumulador para Thomas Wireless System (TWS) acumulador recarregável	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Carregador de rede elétrica para acumuladores recarregáveis Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 e AN001209)
Cola solúvel em água	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	Thomas RECORDING A cola de eletrodo solúvel em água é um produto especialmente selecionado para uso com microeletrodos implantáveis em pesquisas neurocientíficas. Suas propriedades únicas garantem uma conexão rígida entre o eletrodo e o dispositivo de montagem, embora seja facilmente removível com água morna. A cola de eletrodo solúvel em água Thomas RECORDING pode ser usada imediatamente, sem qualquer preparação demorada. Thomas RECORDING cola de eletrodo solúvel em água não é prejudicial aos seres humanos, animais ou ao meio ambiente. Quantidade: 1 caixa de 10 gramas
Pré-amplificador diferencial miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	O Pré-amplificador Diferencial Miniatura, Modelo MDPA-2 é um pré-amplificador de entrada diferencial de 2 canais projetado para gravações de baixo ruído de tecido excitável. Destina-se ao registro extracelular em conjunto com a implantação de microeletrodos implantáveis para aplicações de animais em movimento livre com o Thomas Wireless System (TWS). O pré-amplificador diferencial miniatura de 2 canais (MDPA-2) é conectado aos microeletrodos implantáveis para fornecer o estágio inicial de amplificação de dez vezes. Idealmente, os eletrodos de platina/tungstênio isolados com vidro de quartzo Thomas RECORDING são usados para produzir resultados de gravação ideais com altas amplitudes de sinal e baixos níveis de ruído. O MDPA-2 possui entradas adicionais de aterramento comum e eletrodo de referência.
Cabo de conexão	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	Cabo de conexão para conectar o pré-amplificador diferencial miniatura Thomas (MDPA-2) a um amplificador principal e a uma fonte de alimentação do acumulador.
Fonte de alimentação recarregável para o pré-amplificador miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Fonte de alimentação do acumulador recarregável para o pré-amplificador diferencial miniatura (MDPA-2).
Carregador de acumulador (US)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Carregador de acumulador para a AN000328 de alimentação (conector de tomada elétrica US)Carregador
de acumulador (EU)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Carregador de acumulador para a AN000328 de alimentação (conector de tomada de rede UE)
Pré-amplificador diferencial/amplificador principal/filtro passa-banda	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	O amplificador principal TREC AC (LabAmp-03) é um amplificador principal diferencial de canal único para aplicações neurofisiológicas (por exemplo, gravação extracelular com microeletrodos). Este instrumento foi projetado para funcionar com o pré-amplificador diferencial em miniatura, modelo MDPA-2. O canal único do LabAmp-03 contém um estágio de amplificador diferencial de alto ganho e baixo ruído, seguido por filtros de baixa e alta frequência. O amplificador tem dois amplificadores de filtro diferentes, um filtro de atividade de unidade única (SUA) - amplificador e um amplificador de filtro de potencial de campo local (LFP), ambos são conectados paralelamente no caminho do sinal. O modo de gravação oferece dois níveis de ganho de sinal (x10, x100) em um primeiro estágio e 4 níveis adicionais (x5, x10, x25 e x50) em um estágio final do amplificador. Cada amplificador tem diferentes características de passagem de banda para atividade de unidade única (SUA) 500Hz… 20kHz e potenciais de campo local (LFP) 0,1Hz… 140Hz. Um monitor de áudio e um discriminador de janela estão integrados no dispositivo. O LabAmp-03 possui um monitor de áudio integrado com alto-falante. Esta unidade fornece reprodução de áudio de sinais eletrofisiológicos. A unidade combina um amplificador de áudio em um pacote compacto e robusto. Isso é especialmente adequado para monitorar disparos neurais e contrações musculares. A entrada do monitor de áudio é conectada internamente ao SUA-Filter ampsaída do amplificador. O LabAmp-03 é fornecido com fonte de alimentação externa para uma faixa de tensão de operação de energia elétrica de 100-240V AC/50-60Hz.
Osciloscópio USB	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Este osciloscópio de PC de 2 canais é perfeito para uso móvel em um laptop e instalação permanente em gabinetes de controle, equipamentos industriais e muitas outras aplicações onde é necessário um osciloscópio pequeno, leve e poderoso. Este osciloscópio é conectado à saída de sinal do amplificador principal é para exibição da atividade extracelular registrada durante a implantação dos microeletrodos implantáveis para o Thomas Wireless System (TWS). O usuário pode adquirir os dados de medição através das várias interfaces de dados diretamente no PC com o software para PC incluído.
Gerador de estímulo	Sistemas multicanais	STG3008-FA	O Gerador de Estímulo para Corrente (STG) e a Estimulação Acionada por Tensão cumprem três funções: estimulação acionada por corrente, estimulação acionada por tensão, controle e temporização. O STG está disponível com 2, 4 ou 8 canais de saída independentes. Apresentando unidades de isolamento integradas para cada canal de saída, o STG é capaz de fornecer qualquer forma de onda arbitrária.
Protetor de tampa para o eletrodo	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Tampa protetora para unidade de eletrodo implantável para o Thomas Wireless System
Equipamento			Tesouras, pinças de ponta romba, espátulas, tesouras cirúrgicas, brocas odontológicas e cotonetes
Drogas e produtos químicos			Isoflurano, xilocaína, cloridrato de tramadol (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Alemanha), colírio de dexpantenol (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Alemanha), peróxido de hidrogênio a 3%, iodopovidona (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Alemanha) e etanol a 70%;
Material de fixação incluindo			parafusos de aço inoxidável (BN650 M1,2x5; 4,7 mm), resina acrílica (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Alemanha), cola ultravioleta (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Alemanha) e protetor de tampa (Thomas Recording GmbH, Giessen, Alemanha);
Material			Luvas, almofada de aquecimento, seringas e soro fisiológico.
Instrumento Estereotáxico para Pequenos Animais (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	O modelo deve ser escolhido de acordo com o animal (rato, porquinho-da-índia, macacos, etc.) utilizado no estudo
Câmera de vídeo	EverFocus		EverFocus, modelo: EQ150
Campo aberto			Feito de acrílico transparente ou cinza, com formato redondo medindo 40x40x40cm
Labirinto			em cruz elevadoConfeccionado em acrílico cinza e composto por dois braços abertos (50 cm de comprimento x 10 cm de largura) e dois braços fechados (50 cm de comprimento x 10 cm de largura, com paredes de 40 cm de altura) que se estendiam de uma plataforma central elevada 50 cm acima do chão.