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Artigo de método

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

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DOI:

10.3791/56302

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4 de outubro de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Análises bioquímicas e estruturais das proteínas glicosilados requerem relativamente grandes quantidades de amostras homogêneas. Aqui, apresentamos um método químico eficiente para site-specific glicosilação de proteínas recombinantes purificado a partir de bactérias pela segmentação reativa Cys tióis.

Resumo

Do estroma interação molécula-1 (STIM1) é um tipo-eu proteína transmembrana localizado no retículo endoplasmático (ER) e membranas de plasma (PM). ER-residente STIM1 regula a atividade de PM Orai1 canais em um processo conhecido como armazenar entrada operado de cálcio (Ca2 +), que é o principal Ca2 + sinalização processo que orienta a resposta imune. STIM1 sofre N- glicosilação pós-traducional em dois locais de Asn luminal dentro do Ca2 + sensoriamento domínio da molécula. No entanto, a bioquímica, biofísica, e efeitos biológicos de estrutura de N- glicosilados STIM1 foram mal compreendidos até recentemente devido a uma incapacidade para obter facilmente altos níveis de proteína de - glicosilados homogênea N. Aqui, descrevemos a implementação de uma em vitro abordagem química que une partes de glicose para sites de proteína específica aplicáveis para entender os efeitos subjacentes do N- glicosilação na estrutura da proteína e mecanismo. Usando a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de solução avaliamos tanto eficiência da modificação, bem como as consequências estruturais do acessório glicose com uma única amostra. Esta abordagem pode ser adaptada facilmente para estudar as proteínas miríade glicosilados encontradas na natureza.

Introdução

Armazene operado de cálcio (Ca2 +) entrada (SOCE) é a principal via pela qual as células imunes ocupam Ca2 + do espaço extracelular para o citoplasma. Em linfócitos T, células T receptores situados na membrana plasmática (PM) ligam antígenos que ativam quinases de proteína tirosina (revistos em 1,2,3). Uma cascata de fosforilação leva à ativação da fosfolipase-γ (PLCγ), que posteriormente, Medeia a hidrólise da membrana fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em diacilglicerol e inositol 1, 4,5-triphosphate (IP3 ). IP3 é um pequeno mensageiro diffusible que liga ao IP3 receptores (IP3R) sobre o retículo endoplasmático (ER), assim, abrindo este canal receptor e permitindo Ca2 + para fluir para baixo o gradiente de concentração da emergência lúmen para o citosol (revisto em 4). Receptor de sinalização da proteína G acoplada e receptores de tirosina quinase em uma variedade de outra células não-excitáveis e excitável tipos chumbo para a mesma produção de IP3 e a ativação do IP3Rs.

Devido a Ca2 + armazenamento capacidade finita do PS, o IP3-liberação mediada e resultante aumento citosólico Ca2 + é apenas transitório; no entanto, esta depleção do ER luminal Ca2 + profundamente efeitos do estroma interação molécula-1 (STIM1), um tipo-eu transmembrana (TM) proteína encontrada principalmente no ER membrana 5,6,7. STIM1 contém um lúmen-orientado Ca2 + sensoriamento domínio composto por um par de EF-mão e estéril α-motif (EFSAM). Três domínios coiled-coil citosólica orientado são separados da EFSAM pelo domínio do TM único (revisto em 8). Em cima de ER luminal Ca2 + da prostração, EFSAM sofre uma desestabilização acoplados oligomerização 7,9 que faz com que rearranjos estruturais do TM e domínios coiled-coil 10. Estas mudanças estruturais culminaram em uma captura de STIM1 ER-PM entroncamentos 11,12,13,14 através de interações com remodelamento PM 15, 16 e de Orai1 subunidades 17,18. Orai1 proteínas são as subunidades de PM que montam para formar Ca2 + canais de de21, 19,20,22. As interações de STIM1-Orai1 nos cruzamentos de ER-PM facilitam uma aberto Ca2 + lançamento ativado Ca2 + (CRAC) canal conformação que permite a circulação de Ca2 + para o citosol das altas concentrações do no espaço extracelular. Em células do sistema imunológico, as sustentado citosólico Ca2 + elevações através de canais de CRAC induzem a Ca2 +- calmodulina/calcineurina dependente desfosforilação do fator nuclear das células T ativadas que posteriormente entra no núcleo e começa o Regulamento transcricional de genes, promovendo a ativação de células T 1,3. O processo de ativação de canal CRAC por STIM1 23,24 via induzida pelo agonista ER luminal Ca2 + depleção e a resultante sustentado citosólico Ca2 + elevação é coletivamente denominado SOCE 25. O papel vital da SOCE em células T é evidente por estudos demonstrando que hereditários mutações em ambos os STIM1 e Orai1 podem causar imunodeficiência combinada grave síndromes 3,19,26, 27. EFSAM inicia SOCE após detecção ER-luminal Ca2 + depleção através da perda de Ca2 + coordenação no canônico EF-lado, finalmente levando à desestabilização acoplados auto associação 7, 28,29.

Glycosylation é a ligação covalente e processamento de estruturas de oligossacarídeo, também conhecido como os glicanos, através de várias etapas biossintéticas no ER e Golgi (revisto em 30,32,33). Existem dois tipos predominantes de glicosilação em eucariontes: N-vinculado e O-ligada, dependendo do aminoácido específico e átomo colmatar o enlace. Na N- glicosilação, os glicanos são anexados a amida de cadeia lateral do Asn, e na maioria dos casos, a etapa de iniciação ocorre no PS como o polipeptídeo cadeia move-se para o lúmen 34. O primeiro passo do N- glicosilação é a transferência de uma núcleo de quatorze-açúcar estrutura composta de glicose (Glc), manose (homem) e N- acetilglicosamina (GlcNAc) (ou seja, Glc3homem9GlcNAc2) da emergência lipídios de membrana por uma oligosaccharyltransferase 35,36. Outras medidas, tais como a clivagem ou transferência de resíduos de glicose, são catalisadas nas urgências por glycosyltransferases e glicosidases específico. Algumas proteínas que deixe o ER e mover para o Golgi podem ser ainda mais processados 37. O- glicosilação refere-se à adição dos glicanos, geralmente para o grupo hidroxila de cadeia lateral de resíduos Ser ou Thr, e essa modificação ocorre inteiramente no complexo de Golgi 33,34. Existem várias estruturas de glicano - Oque podem ser feitas de N- acetilglicosamina, fucose, galactose e ácido siálico com cada monossacarídeo adicionado sequencialmente 33.

Enquanto nenhuma sequência específica foi identificada como pré-requisito para muitos tipos de O- glicosilação, uma sequência de consenso comum tem sido associada com a N-ligados a modificação: Asn-X-Ser/Thr/Cys, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro 33. STIM1 EFSAM contém dois desses sites - glicosilação do consenso N: Asn131-Trp132-Thr133 e Asn171-Thr172-Thr173. De fato, estudos anteriores mostraram que EFSAM pode ser N- glicosilados em células de mamíferos em Asn131 e Asn171 38,39,40,41. No entanto, estudos anteriores sobre as consequências da N- glicosilação na SOCE tem sido incongruentes, sugerindo suprimida, potencializado ou nenhum efeito por esta modificação borne-translational na SOCE ativação 38,= "xref" > 39 de40,,41. Assim, a investigação sobre as consequências de biofísicas, bioquímicas e estruturais subjacentes de EFSAM N- glicosilação é vital para compreender os efeitos regulatórios da modificação. Devido à exigência de altos níveis de proteínas homogêneas nesses experimentos em vitro , foi aplicada uma abordagem local-seletiva covalentemente anexar partes de glicose para EFSAM. Curiosamente, Asn131 e Asn171 de glicosilação causou mudanças estruturais que convergem dentro do núcleo EFSAM e aumentar as propriedades biofísicas que promovem SOCE mediada por STIM1 42.

O sistema químico de glycosyl grupos de tióis Cys tem sido bem estabelecido por uma obra seminal que primeiro demonstrou a utilidade desta abordagem de enzima livre para entender os efeitos específicos do site da glicosilação na proteína função 43 , 44. mais recentemente e com respeito a STIM1, os resíduos de Asn131 e Asn171 foram uma mutação de Cys e glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] foi usado para ligar covalentemente glicose para a enciclopédia tióis 42. Aqui, descrevemos esta abordagem que não só usa o mutagenesis de incorporar resíduos de Cys local específicos para a modificação, mas também se aplica a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) solução para avaliar rapidamente a eficiência de modificação e estrutural perturbações como resultado da glicosilação. Notavelmente, esta metodologia geral é facilmente adaptável para estudar os efeitos de ambos O- ou N- glicosilação de qualquer recombinantes produzidos a proteína.

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Protocolo

1. reação em cadeia da polimerase (PCR)-mediada mutagenesis local-dirigido para a incorporação de CIS em um vetor de expressão de animal de estimação-28a bacteriana.

  1. Determinar a concentração do animal de estimação-28a vector (ou seja, ADN encalhado dobro) usando um coeficiente de extinção ultravioleta (UV) de 0,020 (μg/mL) cm -1 em 260 nm.
  2. Sintetizar um par de primers mutagénicas complementares para cada mutação Cys tais que eu) há um mínimo de 15 nucleotídeos complementares ao modelo antes a incompatibilidade de primeira base e 15 nucleotídeos complementares ao modelo após a incompatibilidade de base final, ii) comprimento total da primeira demão não exceda 45 nucleotídeos e iii) uma guanina ou citosina está localizada na posição do primeiro e o último nucleotídeo de cada primer (tabela 1). Certifique-se de síntese da primeira demão é executada usando uma purificação de escala e cartucho de 0.025 μmol.
  3. Usando uma alta fidelidade DNA polimerase, configurar misturas de reação de PCR de dois 20 µ l: uma contendo o primer para a frente e o segundo contendo o primer reverso. Prepare cada mistura que contêm concentrações finais de 1 buffer de x PCR com 1,5 mM de MgCl 2, dNTPs de 0,2 mM, 0.5 cartilha μM, 0,4 μL DMSO, modelo de 1,25 ng/μL DNA, 0,02 U/μL alta fidelidade DNA polymerase.
  4. Ciclo termicamente as misturas separadas usando um protocolo de três etapas: 98 ° C por 30 s (desnaturação), 53-56 ° C por 30 s (recozimento), 72 ° C por 30 s kilobase(kb) -1 (extensão) do modelo de DNA. Repetir o programa de temperatura por 5 ciclos e adicionar uma etapa de extensão final a 72 ° C para 7,5 min.
  5. Após o inicial do PCR com primers para diante e reversos em tubos separados, combinar os produtos em um único tubo (ou seja, 40 μL de total) e continuar a reação de PCR para um adicional de 20 ciclos usando os mesmos parâmetros de ciclismo, conforme descrito na etapa 1.4.
  6. 15 electrophorese μL da mistura de reação de PCR em uma agarose a 1% (p/v) gel usando 0,5 x Tris, ácido acético, etileno diamina tetra acético (EDTA) executando o tampão (TAE). Como controles, electrophorese uma quantidade equivalente de modelo de DNA que não tem sido amplificado por PCR e uma alíquota de escada de DNA de referência que contém bandas de marcador tanto maiores e menor que o tamanho esperado do produto do PCR.
  7. Após eletroforese em 120 V por 40 min, mergulhe o gel em água contendo 0,5 brometo de etídio μg/mL e agitar durante 30 min à temperatura ambiente. Confirmar o modelo full-length tem sido amplificado pelas primeiras demão mutagénicas como um aumento da intensidade fluorescente brometo de ethidium relativo da banda amplificada em comparação com a banda de modelo de controle sob luz UV (302 nm).
    1. Se nenhuma amplificação é aparente, repetir a PCR depois de ajustar a temperatura do recozimento em incrementos de 0,5 ° C entre a faixa de temperatura de 53-56 ° C.
  8. Mediante confirmação de amplificação do modelo pelas primeiras demão mutagénicas, tratar o restante ~ 25 μL da mistura de reação de PCR com a enzima de restrição DpnI para digerir o modelo metilado DNA. Use DpnI 0,5 µ l (10 unidades) por mistura de reacção 25 μL do PCR e uma concentração final de 1 × DpnI amortecedor da reação. Incubar durante 2,5 h a 37 ° C.
  9. Digestão do modelo, a seguir adicionar ~ 5-10 μL da mistura digerida para 100 µ l de calor choque competentes células DH5α Esherichia coli em um tubo de microcentrifugadora 1,75 mL. Incubar a mistura de DNA de células no gelo por 60 min.
  10. Choque térmico da mistura de celular-DNA no tubo microcentrifuga a 42 ° C, durante 45 s em um bloco de calor seco. Após a incubação a mistura no gelo por 3 min, adicionar 900 μL de caldo temperatura Luria-Bertani (LB) para as células e transferir a suspensão total de células em um tubo de fundo redondo de estéril 14 mL.
  11. Incube a suspensão de eritrócitos a 37 ° C por 90 min com agitação constante a 190 rpm.
  12. Transferir posteriormente, a suspensão de células em um tubo de microcentrifugadora 1,75 mL e centrifugar 10.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
  13. Após a centrifugação, remover 900 μL do sobrenadante e ressuspender as células bacterianas pipetando gentil nas restantes 100 μL de lb.
  14. Transferir a suspensão concentrada de células resultante em uma placa LB-ágar contendo antibiótico que é seletivo para o vetor de expressão (ou seja, 60 μg/mLKanamycin). Assepticamente espalhar a suspensão uniformemente na placa de ágar e incubar durante 16 ~ h a 37 ° C.
  15. No dia seguinte, inocular uma única colônia da placa em 5 mL de líquido LB contendo a pressão de seleção de antiobiotic (ou seja, 60 μg/mL canamicina). Crescer a cultura líquida durante a noite a 37 ° C com agitação constante a 37 ° C.
  16. Isolar e purificar o plasmídeo propagado partir de células de Escherichia coli usando um kit disponível comercialmente baseado o processo de Lise alcalina 45.
  17. Confirmar a mutação de interesse está presente e no quadro de leitura por sequenciamento de DNA de Sanger da plasmídeo 46.

2. Uniforme 15 expressão N-etiquetou a proteína em BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Nota: proteínas recombinantes diferentes exigem condições de expressão diferente. O seguinte é o procedimento otimizado para a expressão da proteína humana STIM1 EFSAM.

  1. Transformar o vetor de expressão abrigando as mutações de Cys (ou seja, animal de estimação-28a-EFSAM) em BL21 ΔE3 codão (+) calor choque pilhas competentes e placa em placas LB-ágar contendo a pressão de seleção antibiótico conforme descrito nas etapas 1.9-1.14) com o as modificações a seguir: placa diretamente uma alíquota de 150 μL da suspensão de célula total μL ~ 1.000 na placa de ágar LB sem a necessidade de concentrar as células em um tubo de microcentrifugadora por centrifugação.
  2. No dia seguinte, transferir assepticamente uma única colônia para um Erlenmeyer contendo 20 mL de LB suplementado com o antibiótico apropriado (ou seja, 60 canamicina para μg/mL para o animal de estimação-28a-EFSAM) de 200 mL. Crescer este líquido cultura durante a noite (ou seja, ~ 16 h) a 37 ° C, com agitação constante no ~ 190 rpm.
  3. No mesmo dia como passo 2.2, preparar M9 médio por 15 a expressão da proteína N-rotulado por autoclavagem 1L de M9 buffer sais (ou seja, 42 mM Na 2 HPO 4, 22mm KH 2 PO 4, 8,6 mM NaCl, pH 7,4) em um frasco de Erlenmeyer de 4 L. Legal, uma vez que filtrar uma mistura de 20% (p/v) D-glicose, 1m CaCl 2, tiamina 1 M, 1 M MgSO 4, biotina 1 mg/mL e 0,2 g/mL 15 N-NH 4 Cl através de um filtro de seringa estéril 0,2 μm para a solução salina estéril de 1 L M9 para que o concentrações finais desses componentes são 0,2% (p/v) D-glicose, 100 μM CaCl 2, 50 tiamina μM, 1 mM de MgSO 4, 1 μg/mL biotina e 1 mg/mL 15 N-NH 4 CL.
  4. No dia seguinte, assepticamente, transferir a cultura starter líquido durante a noite de 20 mL para um tubo cônico estéril 50 mL e centrifugar a 2.400 × g durante 15 min para as células de Pelotas.
  5. Após a decantação o meio LB, resuspenda o pellet de células resultante em 10 mL de meio mínimo M9 e transferir a mistura ressuspenso em 1 L de meio mínimo M9 com antibiótico (ou seja, 60 canamicina de μg/mL).
  6. Crescer a 1 L de M9 meio mínimo contendo a cultura bacteriana a 37 ° C e constante ~ 190 rpm tremer até a densidade óptica em 600 nm (OD600) atinge ~0.6-0.8.
  7. Quando é atingido o intervalo de specfified OD600, adicionar 200 μM de isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para induzir a expressão da proteína.
  8. Após a adição de IPTG, continuar incubando as pilhas para a expressão da proteína à temperatura ambiente com agitação constante a ~ 190 rpm para ~ 16 h (ou seja, durante a noite).
  9. No dia seguinte, colher as bactérias por centrifugação a 10.000 ~ × g, 4 ° C por 30 min.
  10. Decantar o LB e transferir o sedimento celular em um tubo cónico de 50 mL. Armazenar a pelota a-80 ° C até purificação.

3. Purificação de proteínas recombinantes de e. coli.

Nota: proteínas recombinantes diferentes exigem procedimentos de purificação distintas. O seguinte é o protocolo para 6 & #215; Purificação de EFSAM com sua Tag de corpos de inclusão expressado de construção de animal de estimação-28a.

  1. Manualmente homogeneizar a pelota de célula bacteriana congelado em 6m guanidina-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) e 5 mM β-Mercaptoetanol usando uma pipeta de transferência motorizado 10 mL. Adicionar aproximadamente 40 mL de HCl-guanidina por 5 mL de wet centrifugado para esta etapa.
  2. Seguir um 90 min incubação à temperatura ambiente com rotação constante em um forno de hibridização, centrifugar a mistura no ~ 15.000 × g, 8 ° C por 40 min separar os detritos celulares insolúveis (ou seja, sedimento) da proteína solúvel mistura (ou seja, sobrenadante).
  3. Adicionar 750 µ l de uma 50% (v/v) Ni 2 +-agarose ácido nitrilotriacético talão da pasta para o esclareceu lisada e incube por outro 90 min à temperatura ambiente com inversão em um forno de hibridização.
  4. , Posteriormente, capturar a proteína com sua tag 6 × vinculada a Ni 2 +, a recolher os grânulos de agarose em uma coluna de purificação de proteínas de fluxo de gravidade. Permitir o lisado a fluir através da coluna completamente antes de mover-se para a etapa 3.5.
  5. Lave os grânulos coletados três vezes com 10ml de ureia de 6 M, 20 mM Tris-HCl pH 8 e 5 mM β-Mercaptoetanol. Certifique-se de que o todo 10ml passa através da coluna antes da cada 10ml subsequente Wash.
  6. Eluir as proteínas em uma série de frações de 2 mL, usando ureia de 6 M, pH 20 mM Tris-HCl 8, imidazol 300 mM e 5 mM β-Mercaptoetanol com um tempo de incubação s 90 entre frações. Certifique-se de que o todo 2ml passa através da coluna antes de cada etapa de eluição subsequentes.
  7. Nesta fase, confirmar a proteína de interesse está presente nas fracções eluted por Coomassie azul manchada de sódio Dodecil sulfato do gel de polyacrylamide eletroforese (SDS-PAGE) usando o método de Laemmli 47. Avaliar o tamanho da proteína, a quantidade e a pureza por comparação contra bandas de marcador de peso molecular padrão que são ambos menor que e maior do que o esperado peso molecular da proteína de interesse.
  8. As frações da proteína eluted da piscina em uma membrana de diálise com 3.500 peso molecular Da corte e incubar em buffer redobramento 1L (20 mM Tris, 300 mM de NaCl, 1 milímetro DTT, 5 mM CaCl 2, pH 8) a 4 ° C durante a noite enquanto o buffer está sendo agitado por um magneti agitador de c.
  9. Depois de ~ 16 h de tempo redobramento, adicionar ~ 1 U de trombina por mg de proteína directamente para o saco de diálise e incubar a 4 ° C para um adicional h ~ 24.
  10. Verificar a extensão da × 6 sua clivagem marca pela coloração de azul de Coomassie de ~ 15 μL proteína alíquotas retiradas do saco de diálise antes e após a incubação com trombina que são electrophoresed em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) usando de desnaturação o método de Laemmli 47. Se uma mudança de ~ 2 kDa na migração é observada correspondente ao peso molecular da clivada 6 × sua marca, continuar a etapa 3.11; se uma fração de restos de proteínas não digeridas que é detectável pela coloração de azul de Coomassie, adicione ~0.2 U de trombina por mg de proteína directamente para o saco de diálise e incubar a 4 ° C para um adicional h ~ 24.
  11. Uso tamanho exclusão ou troca iônica da cromatografia mais purificar a proteína. Por cromatografia de troca de ânion de EFSAM, remover a solução da proteína do saco de diálise e concentrado ~ 10 vezes usando um concentrador de ultrafiltração centrífuga com 10.000 peso molecular Da corte. Posteriormente, re-diluir a solução ~ 20-fold em um buffer livre de NaCl (20 mM Tris, 5 mM CaCl 2, 1 milímetro DTT, pH 8).
  12. Equilibrar uma coluna de troca de ânion pré-embalados com 10 volumes de coluna do buffer livre de NaCl descrito na etapa 3.11. Equilibrar usando buffer carregado em uma seringa luer-lock, não contendo nenhuma bolha de ar empurrando a solução através da coluna em forma de gota a gota e evitando pressões de seringa que causam fluxos constantes da solução de saída da coluna. Use um trocador de ânion forte (por exemplo, quitosana agarose com grupos funcionais de quaternário de amônio).
  13. Carregar a proteína solução diluída em tampão isento de NaCl (etapa 3.11) na coluna, conforme descrito na etapa 3.12.
  14. Eluir as proteínas em um gradiente [ou seja, 0 - 60% (v/v)] do aumento de NaCl de buffer (20 mM Tris, 1 M de NaCl, 5 mM CaCl 2, 1 milímetro DTT, pH 8) usando um sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida de duas bombas. Definir o sistema FPLC coletar frações mL de ~1-1.5 e monitorar o perfil de eluição de proteínas usando a absorvância de UV 280 nm e um fluxo taxa de 0,5 mL/min.
  15. Identificar os picos de eluição e frações que contêm a proteína de interesse, bem como a pureza da proteína por manchadas de azul de Coomassie SDS-PAGE gel usando o método de Laemmli 47.
  16. Frações de piscina mostrando > 95% (ou seja, tomadas como frações que mostram apenas uma banda única proteína no azul de Coomassie manchado géis) em um saco de diálise e troca em buffer experimental de interesse pela diálise conforme descrito na etapa 3.8.

4. Fixação química de glicose-5-MTS a proteína pela diálise.

  1. Prepare um 55mm solução stock de N-(β-D-glucopyranosyl)-N '-[2-methanethiosulfonyl) etil] ureia (glicose-5-MTS), dissolvendo-se 10 mg do composto em 500 μl de 100% (v/v) DMSO. Armazenar não utilizada glicose-5-MTS solubilizado em DMSO em -20 ° C.
    2. Buffer de
  2. preparar a amostra de proteína para a modificação por dializando 1,5 mL de proteína de ~ 60 μM em 1 L de modificação composta de MOPS 20 mM, 150 mM de NaCl, 5 mM CaCl 2 e 0,1 mM TCEP, pH 8.3. Use um corte de peso molecular de membrana de diálise que é menor que o tamanho da proteína seja modificada (por exemplo, usar um 3.500 Da corte para o ~ 17.500 Da EFSAM).
  3. Após 24 h a 4 ° C, transferir a amostra proveniente do saco de diálise em um tubo de microcentrifugadora. Adicionar o DMSO-solubilizado glicose-5-MTS para uma concentração final de 2 mM.
  4. Incubar a amostra no escuro por 1h à temperatura ambiente. Durante o período de incubação de 1 h, misturar a solução tocando suave do tubo de cada 10 min.
  5. Posteriormente, re-trocar a proteína para o buffer experimental final não contendo nenhum agente redutor em diálise a 4 ° C, conforme descrito na etapa 4.2 ou por ultrafiltração centrífuga. Para o procedimento de ultrafiltração, concentrar a amostra de proteína ~1.5 mL de < mL 0,5 e diluem-se posteriormente com o concentrador mesmo com o buffer de experimental. Repita essa etapa de diluição concentração duas vezes adicionais para que a troca total é um mínimo de 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. Para EFSAM, use 20 mM Tris, 150 mM de NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7,5, como o experimental buffer.
  6. Preparar a amostra para espectrometria de massa de ionização electrospray por diálise ou ultrafiltração troca conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.5, respectivamente, em 25mm bicarbonato de amônio ou acetato de amónio de 25 mM. Se utilizar a diálise, certifique-se de você troca pelo menos três vezes para remover quaisquer sais residuais de 2 NaCl e CaCl.
  7. Determinar a massa exata (ou seja, ± 1 Da) da proteína de interesse usando ionização electrospray mass espectrometria 48 , 49. Espera que cada adição covalente de glicose para um tiol Cys através do produto químico de methanethiosulfonate para adicionar a proteína 281.3 Da massa (ou seja, adicionar 360.4 para a glicose-5-MTS e subtrair Da 79.1 para o CH 3, então 2 saindo do grupo durante a ligação covalente o acessório).

5. Avaliação de solução NMR de modifperturbações de eficiência e estrutural autent.

Proteína
  1. certifique-se a concentração do modificado é > 100 μM após a penhora de glicose e a troca de buffer final. Para EFSAM, estimar a concentração de proteína usando um coeficiente de extinção UV em 280 nm de 1,54 (mg mL – 1) cm – 1.
  2. a solução de proteína com 60 μM de suplemento de ácido 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) para calibração de shims e pulso e 10% (v/v) D 2 O para bloquear o sinal. Para uso de sinal-ruído elevado 600 amostras μL em tubos de frequência-combinadas 5mm NMR, inserido em um espectrômetro de 600 MHz mínimo equipado com uma sonda criogênica de HCN ressonância tripla.
  3. Coletar espectros de HSQC N padrão 1 H - 15 como anteriormente detalhada 50 , 51 em temperatura, 1 H e 15 N larguras de varredura, transiente e incremento ajustes apropriados para a amostra particular. Para espectros EFSAM, uso de 20 ° C, 256 transientes de 1 H, 64 incrementos de cota de 15 N e 1 H e 15 N varrer larguras definidas para 1.800 e 8.000 Hz, respectivamente.
  4. Após a aquisição do espectro de proteína glicosilada, adicionar ditiotreitol (DTT) para a amostra NMR de um estoque de 1 M para uma concentração final de 15 mM. A DTT remove a fracção de glicose a proteína por redução do acessório mediada por dissulfeto.
  5. Adquirir um segundo 1 H - 15 N HSQC nestas condições reduzidas/sem modificações, fornecendo um espectro de referência para avaliar as perturbações de eficiência e estrutural de modificação causadas pelo acessório glicose.
  6. Processar dados NMR usando NMRPipe como detalhado anteriormente 52. Certifique-se de que o processamento minimamente inclui conversão de dados, eliminação, supressão de solvente, transformada de Fourier e visualização inicial dos espectros.
  7. Avaliar eficiência de modificação, medindo os valores de deslocamento químico no espectro modificado e reduzido usando o plugin NEASY na CARA 53 e intensidades de pico de Amida. Certifique-se para avaliar a intensidade do pico de Amida Cys ambos na glicose anexado e reduziram de espectros. Se a amida Cys não pode confiantemente ser localizada em ambos os espectros, use as intensidades de resíduos adjacentes a Cys como uma leitura.
  8. Calcular a eficiência como a intensidade de amida do espectro Cys-modificado dividida pela intensidade de amida de Cys-reduzido (isto é, DTT-tratada) espectro, multiplicado por 100:
    figure-protocol-1, onde m é a intensidade de Amida no espectro Cys-modificado e que R é a intensidade de Amida no espectro Cys-reduzido. Alternativamente, avaliar a eficiência média em vários picos de Amida:
    figure-protocol-2, onde a eficiência i é a separadamente determinada eficiência calculada para cada um resíduo, eu e n é o número total de resíduos utilizados no cálculo.
  9. Calcular perturbações de deslocamento químico (CSP) de diferenças entre ambos os espectros observados no 15 N e dimensões de 1 H de cada pico e normalizando para o maior 15 N gama shift química usando shift química a seguinte equação:
    figure-protocol-3, onde ΔH é a mudança de ppm na dimensão de prótons e ΔN é a mudança de ppm na dimensão nitrogênio.

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Resultados

A primeira etapa desta abordagem requer a mutagênese dos resíduos de glicosilação candidato a Cys resíduos, que podem ser modificados usando a glicose-5-MTS. EFSAM tem sem resíduos de Cys endógenos, então não há considerações especiais que precisam ser feitas antes do mutagênese. No entanto, nativo Cys de resíduos devem ser uma mutação de resíduos não-modificável antes de realizar a química descrita. Ao efeito minimamente a estrutura nativa, sugerimos realizar um alinhamento global da seq...

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Discussão

Proteína glycosylation é uma modificação pós-traducional onde açúcares estão covalentemente ligados a polipeptídeos principalmente através de ligações com cadeias laterais de aminoácidos. Até 50% de proteínas de mamíferos são glicosilados 54, onde as proteínas glicosilados posteriormente podem ter uma variada gama de efeitos de alterando a afinidade de ligação biomolecular, influenciando a proteína dobráveis, alterando a atividade do canal, visando moléculas para celular tráfico, para citar alguns...

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Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá (05239 de P.B.S), Fundação Canadense para a inovação/Ontario Research Fund (de P.B.S), Fundação de lutar próstata câncer - Telus Ride para o pai (PBS) e Ontário Bolsa de pós-graduação (para Y.J.C. e N.S.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Phusion DNA PolimeraseThermo Fisher ScientificF530SUse na etapa 1.3.
Generuler 1kb DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1163Use na etapa 1.6.
Enzima de restrição DpnINew England Biolabs, Inc.R0176Utilizar no passo 1.8.
Kit de Plasmídeo Mini PrestoGeneAid, Inc.PDH300Use na etapa 1.16.
BL21 DE3 códon (+) E. coliAgilent Technologies, Inc.230280Utilização no passo 2.1.
DH5a E. coliInvitrogen, Inc.18265017Use na etapa 1.9.
Filtro de Seringa de 0,22 mmMillipore, Inc.SLGV033RSUse na etapa 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Resina de AgaroseThermo Fisher Scientific88221Use na etapa 3.3.
3.500 Da MWCO Tubulação de DiáliseBioDesign, Inc.D306Utilizar nos passos 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 e 4.6.
Trombina bovinaBioPharm Laboratories, Inc.SKU91-055Use na etapa 3.9.
Coluna de Troca de Ânions HiTrap Q FF de 5 mLGE Healthcare, Inc.17-5156-01Use na etapa 3.11.
Glicose-5-MTSToronto Research Chemicals, Inc.G441000Use na etapa 4.1.
Concentradores centrífugos de ultrafiltração Vivaspin 20Sartorius, Inc.VS2001Use nas etapas 3.11, 4.2, 4.5 e 4.6.
PageRuler Escada de Proteína Larga Não CoradaThermo Fisher Scientific26630Use nas etapas 3.7, 3.10 e 3.15
HiTrap Q FF Coluna de Troca de ÂnionsGE Healthcare, Inc.17-5053-01Use na etapa 3.12.
Sistema de Cromatografia Líquida de Proteína Rápida Pura AKTAGE Healthcare, Inc.29018224Use na etapa 3.14.
Espectrômetro de RMN Varian Inova de 600 MHzAgilent Technologies, Inc.Use nas etapas 5.2 e 5.5.

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