Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Resumo

Análises bioquímicas e estruturais das proteínas glicosilados requerem relativamente grandes quantidades de amostras homogêneas. Aqui, apresentamos um método químico eficiente para site-specific glicosilação de proteínas recombinantes purificado a partir de bactérias pela segmentação reativa Cys tióis.

Resumo

Do estroma interação molécula-1 (STIM1) é um tipo-eu proteína transmembrana localizado no retículo endoplasmático (ER) e membranas de plasma (PM). ER-residente STIM1 regula a atividade de PM Orai1 canais em um processo conhecido como armazenar entrada operado de cálcio (Ca^{2 +}), que é o principal Ca^{2 +} sinalização processo que orienta a resposta imune. STIM1 sofre N- glicosilação pós-traducional em dois locais de Asn luminal dentro do Ca^{2 +} sensoriamento domínio da molécula. No entanto, a bioquímica, biofísica, e efeitos biológicos de estrutura de N- glicosilados STIM1 foram mal compreendidos até recentemente devido a uma incapacidade para obter facilmente altos níveis de proteína de - glicosilados homogênea N. Aqui, descrevemos a implementação de uma em vitro abordagem química que une partes de glicose para sites de proteína específica aplicáveis para entender os efeitos subjacentes do N- glicosilação na estrutura da proteína e mecanismo. Usando a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de solução avaliamos tanto eficiência da modificação, bem como as consequências estruturais do acessório glicose com uma única amostra. Esta abordagem pode ser adaptada facilmente para estudar as proteínas miríade glicosilados encontradas na natureza.

Introdução

Armazene operado de cálcio (Ca^{2 +}) entrada (SOCE) é a principal via pela qual as células imunes ocupam Ca^{2 +} do espaço extracelular para o citoplasma. Em linfócitos T, células T receptores situados na membrana plasmática (PM) ligam antígenos que ativam quinases de proteína tirosina (revistos em ^1,2,3). Uma cascata de fosforilação leva à ativação da fosfolipase-γ (PLCγ), que posteriormente, Medeia a hidrólise da membrana fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP₂) em diacilglicerol e inositol 1, 4,5-triphosphate (IP₃ ). IP₃ é....

Protocolo

1. reação em cadeia da polimerase (PCR)-mediada mutagenesis local-dirigido para a incorporação de CIS em um vetor de expressão de animal de estimação-28a bacteriana.

1. Determinar a concentração do animal de estimação-28a vector (ou seja, ADN encalhado dobro) usando um coeficiente de extinção ultravioleta (UV) de 0,020 (μg/mL) cm ^-1 em 260 nm.
2. Sintetizar um par de primers mutagénicas complementares para cada mutação Cys tais que eu) há um mínimo de 15 nucleotídeos complementares ao modelo antes a incompatibilidade de primeira base e 15 nucleotídeos complementares ao modelo após a incompatibilidade de base final, ii) compr....

Resultados

A primeira etapa desta abordagem requer a mutagênese dos resíduos de glicosilação candidato a Cys resíduos, que podem ser modificados usando a glicose-5-MTS. EFSAM tem sem resíduos de Cys endógenos, então não há considerações especiais que precisam ser feitas antes do mutagênese. No entanto, nativo Cys de resíduos devem ser uma mutação de resíduos não-modificável antes de realizar a química descrita. Ao efeito minimamente a estrutura nativa, sugerimos realizar um alinhamento global da seq.......

Discussão

Proteína glycosylation é uma modificação pós-traducional onde açúcares estão covalentemente ligados a polipeptídeos principalmente através de ligações com cadeias laterais de aminoácidos. Até 50% de proteínas de mamíferos são glicosilados ⁵⁴, onde as proteínas glicosilados posteriormente podem ter uma variada gama de efeitos de alterando a afinidade de ligação biomolecular, influenciando a proteína dobráveis, alterando a atividade do canal, visando moléculas para celular tráfico, para citar alguns.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Phusion DNA Polimerase	Thermo Fisher Scientific	F530S	Use na etapa 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	FERSM1163	Use na etapa 1.6.
Enzima de restrição DpnI	New England Biolabs, Inc.	R0176	Utilizar no passo 1.8.
Kit de Plasmídeo Mini Presto	GeneAid, Inc.	PDH300	Use na etapa 1.16.
BL21 DE3 códon (+) E. coli	Agilent Technologies, Inc.	230280	Utilização no passo 2.1.
DH5a E. coli	Invitrogen, Inc.	18265017	Use na etapa 1.9.
Filtro de Seringa de 0,22 mm	Millipore, Inc.	SLGV033RS	Use na etapa 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Resina de Agarose	Thermo Fisher Scientific	88221	Use na etapa 3.3.
3.500 Da MWCO Tubulação de Diálise	BioDesign, Inc.	D306	Utilizar nos passos 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 e 4.6.
Trombina bovina	BioPharm Laboratories, Inc.	SKU91-055	Use na etapa 3.9.
Coluna de Troca de Ânions HiTrap Q FF de 5 mL	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	Use na etapa 3.11.
Glicose-5-MTS	Toronto Research Chemicals, Inc.	G441000	Use na etapa 4.1.
Concentradores centrífugos de ultrafiltração Vivaspin 20	Sartorius, Inc.	VS2001	Use nas etapas 3.11, 4.2, 4.5 e 4.6.
PageRuler Escada de Proteína Larga Não Corada	Thermo Fisher Scientific	26630	Use nas etapas 3.7, 3.10 e 3.15
HiTrap Q FF Coluna de Troca de Ânions	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	Use na etapa 3.12.
Sistema de Cromatografia Líquida de Proteína Rápida Pura AKTA	GE Healthcare, Inc.	29018224	Use na etapa 3.14.
Espectrômetro de RMN Varian Inova de 600 MHz	Agilent Technologies, Inc.		Use nas etapas 5.2 e 5.5.