Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.
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Artigo de método
Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mudanças no pH intracelular (pHi) desempenham um papel importante na regulação de muitas funções celulares, incluindo o metabolismo, proliferação e diferenciação. Normalmente, pHi dinâmica é determinada em culturas de células, que são passíveis de medição e manipular experimentalmente pHi. No entanto, o recente desenvolvimento de novas ferramentas e metodologias tornou possível estudar a dinâmica de pHi no tecido intacto, ao vivo. Para a investigação de Drosophila , um desenvolvimento importante foi a geração de uma linha de transgénica carregando um biossensor pHi, mCherry::pHluorin. Aqui, descrevemos um protocolo que usamos rotineiramente para imagem ao vivo Drosophila ovarioles para medir pHi na linhagem de células-tronco (FSC) folículo epiteliais em linhas transgénicas tipo selvagem de mCherry::pHluorin; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para outros tecidos, incluindo os discos de asa e o epitélio do olho. Descrevemos técnicas para expressar mCherry::pHluorin na linhagem FSC, mantendo o tecido ovariano durante a imagem latente, ao vivo e aquisição e analisando imagens para obter valores de pHi.
Introdução
Estudos recentes revelaram um papel para alterações em pHi durante celular diferenciação e displasia na vivo1,2. Estes estudos encontraram que pHi é notavelmente consistente nas células do mesmo tipo na mesma fase de diferenciação, mas que muda como células de transição de uma fase para outra. Em alguns casos, bloquear as mudanças na pHi parcialmente interrompe a diferenciação, sugerindo que a mudança na pHi não é apenas uma consequência de alterações no destino da célula, mas em vez disso, ajuda a promover a mudança no destino da célula, talvez através de efeitos no pH sensíveis à regulamentação prot....
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Protocolo
Nota: para medir pHi na linhagem FSC, podemos calcular a relação das intensidades de fluorescência da pHluorin para mCherry em células de folículo em condições fisiológicas, pFCs e FSCs e converter os rácios em valores de pHi com padrão as curvas de calibração para cada célula tipo 7. Primeiras, viver experiências de imagem são realizadas para medir intensidades de fluorescência de pHluorin e mCherry em germaria dissecado em um buffer que contém NaHCO 3, que imita condições fisiológicas 1 , 7. curvas padrão, próxima são geradas por medir intensidades de fluorescência pHlu....
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Resultados
Aqui descrevemos o processo de medição pHi no epitélio do folículo, que envolve várias etapas. Primeiro, os ovários são dissecados de moscas do genótipo apropriado usando ferramentas para dissecar e montagem (Figura 1). Os ovarioles são então fotografadas usando microscopia de fluorescência quantitativa e as imagens são analisadas para obter medições de pHi. Para cada imagem, os tipos de células de interesse são identificados conforme descrito na secção 3.1 (.......
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Discussão
Aqui, descrevemos um método para medir o pHi de células na linhagem FSC dentro sua tecido. Este protocolo foi desenvolvido e refinado nos últimos cinco anos, desde que primeiro começamos a estudar pHi em tecido ovariano de Drosophila . Durante esse tempo, o protocolo tem sido usado com sucesso por vários investigadores em nosso laboratório e em pelo menos quatro diferentes girando disco e microscópios de exploração do laser. Reprodutibilidade da nossa observação original, que aumenta de pHi como células na linha.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Bryne Ulmschneider contribuições para o protocolo e Diane Barber para sugestões sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Instituto Nacional de subvenção de saúde GM116384 ao Nystul de T.G. e D.L. Barber.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::p Hluorin[1] | |||
| y1 w*; P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Nome | >Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Produtos químicos para preparação de tampão | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glicose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma | Aldrich S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Uso para fazer KHPO4 pH 7,4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Uso para fazer KHPO4 pH 7,4 |
| Concanavalina A, Alexa Fluor 647 Conjugado | Thermo Fisher Scientific | C21421 | Diluição de 0,25 mg/ml |
| Nigericina | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Ferramentas de dissecação e montagem | |||
| 2 Dumont Pinça Inox (Tamanho 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 agulhas de seringa de calibre 23 | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| Prato de dissecação de vidro de 9 poços | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Graxa | a vácuo Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM lamínulas de vidro | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Lamínulas de vidro redondas, 12 mm de diâmetro, 0,13-0,16 mm de espessura | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| Câmara de montagem 3-D | fabricada | medida.stl e .ipt arquivos para impressora 3-D incluídos como arquivos suplementares | |
| Nome | Empresa< | strong>Número de catálogo | Comentários |
| Outros equipamentos | |||
| Medidor de pH | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Modelo: Accumet AB15 |
| Microscópio de dissecção | Olympus Corporation | 0H11436 | Modelo: Microscópio confocal SZ2-ST |
| Microscópio confocal de varredura a laser Leica Biosystems SP5 ou SP8 com objetiva de 40 vezes; com abertura numérica de 1,3 |
Referências
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G.
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Reimpressões e permissões
