Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Resumo

Nós descrevemos um método fácil, rápido e relativamente barato para a geração de gene-interrompeu Streptococcus mutans cepas; Esta técnica pode ser adaptada para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.

Resumo

Métodos típicos para a elucidação da função de um gene específico envolvem análises comparativas de fenotípicas de uma estirpe em que o gene de interesse foi interrompido e a estirpe selvagem-tipo. Uma construção de DNA do gene-interrupção contendo um gene marcador de resistência a antibióticos adequados é útil para a geração de linhagens gene-interrompido em bactérias. No entanto, métodos de construção convencional, que exigem etapas clonagem de gene, envolvem protocolos complexos e demorados. Aqui, um método relativamente fácil, rápido e econômico para ruptura do gene alvo de Streptococcus mutans é descrito. O método utiliza uma fusão 2-passo da cadeia polimerase (PCR) para gerar a construção de perturbação e eletroporação para transformação genética. Este método não requer uma reação enzimática, além do PCR e além disso, oferece maior flexibilidade em termos do projeto de construção de interrupção. Emprego de eletroporação facilita a preparação de células competentes e melhora a eficiência de transformação. O método atual pode ser adaptado para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.

Introdução

Análise de função do gene normalmente envolve uma comparação fenotípica entre uma estirpe selvagem-tipo e uma tensão em que um determinado gene de interesse foi interrompido. Esta técnica de gene-interrupção tem sido utilizada para análises de função do gene em uma ampla gama de táxons, de bactérias a mamíferos. Uma construção de gene-interrupção é necessária para a geração da estirpe gene-interrompido; Essa construção de Ácido desoxirribonucleico (DNA) consiste no gene marcador de resistência aos antibióticos fundido para o upstream e downstream flanqueiam regiões do gene alvo e é incorporada no genoma da através de recombinação homóloga. A estirpe de gene-interrompi....

Protocolo

1. primer Design

1. preparar cartilhas para fusão 2-passo do PCR e verificação de ruptura de gene.
   Nota: A tabela 1 mostra as sequências de primer utilizadas no presente protocolo. a Figura 1 mostra uma ilustração esquemática do método PCR 2-etapa fusão usado para gerar o S. mutans Δ esferoplastos.
   1. Primers de design para a substituição da região-alvo no genoma com a resistência a espectinomicina gene (spc ^r) ⁷. Este protocolo substitui toda a região de codificação do gene esferoplastos com spc ^r....

Resultados

A Figura 2 mostra que o tamanho de cada produto desde a 1^st PCR, como observado sobre o gel de agarose a 1%, foi bom de acordo com o tamanho previsto de aproximadamente 1 kb. A Figura 3 mostra a análise de eletroforese de gel dos produtos da 2^nd do PCR. A Figura 4 mostra colônias de S. mutans transformadas com a construção de perturbação e uma análise de eletroforese de.......

Discussão

No presente protocolo, as primeiras demão para o 1^st PCR devem ser concebidas para amplificar aproximadamente 1 kb a montante e a jusante flanqueiam regiões da região-alvo no genoma. Tais sequências flanqueando tempo são necessárias para melhorar a eficiência de recombinação homóloga.

As sequências dos primers (reverso de cima, para baixo-forward, spc^r-para a frente e spc^r-reverso) neste protocolo automaticamente foram determinados com base no.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Streptococus mutans	Cepa de estoque no laboratório.		Estirpe de tipo selvagem (Estirpe UA159)
Kit de extracção de ADN genómico	Zymo Research	D6005
Aparelho de ruptura de batimento de grânulos	Taitec	GM-01
Genes sintéticos	Eurofins Genomics	Gene de resistência à	espectinomicina e eritromicina
Termociclador	Primers de PCR Astec	PC-708
	Eurofins Genomics	Personalizado	35 bases de comprimento
DNA polimerase	Takara	R045A	gel de DNA polimerase de alta fidelidade
	Nippon Genetics	FG-91202	Extração de DNA de gel de agarose Cortador de
banda de gel	Nippon Genetics	FG-830
Espectrofotômetro	Beckman Coulter	DU 800
Electroporator	Bio-rad	1652100
Cubeta de electroporação	Bio-rad	1652086	lacuna de 0,2 cm
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Sistema de cultura anaeróbica
Caldo de infusão de cérebro e coração	Becton, Dickinson	237500	Meios de cultura bacterianos
Spectinomicina	Wako	195-11531	Antibióticos
Eritromicina	Wako	057-07151	Antibióticos
Sacarose	Wako	196-00015	Para desenvolvimento de biofilme
CBB R-250	Wako	031-17922	Para coloração de biofilme

encomendado à medida Kit de extração de