Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Resumo

Nós descrevemos um método fácil, rápido e relativamente barato para a geração de gene-interrompeu Streptococcus mutans cepas; Esta técnica pode ser adaptada para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.

Resumo

Métodos típicos para a elucidação da função de um gene específico envolvem análises comparativas de fenotípicas de uma estirpe em que o gene de interesse foi interrompido e a estirpe selvagem-tipo. Uma construção de DNA do gene-interrupção contendo um gene marcador de resistência a antibióticos adequados é útil para a geração de linhagens gene-interrompido em bactérias. No entanto, métodos de construção convencional, que exigem etapas clonagem de gene, envolvem protocolos complexos e demorados. Aqui, um método relativamente fácil, rápido e econômico para ruptura do gene alvo de Streptococcus mutans é descrito. O método utiliza uma fusão 2-passo da cadeia polimerase (PCR) para gerar a construção de perturbação e eletroporação para transformação genética. Este método não requer uma reação enzimática, além do PCR e além disso, oferece maior flexibilidade em termos do projeto de construção de interrupção. Emprego de eletroporação facilita a preparação de células competentes e melhora a eficiência de transformação. O método atual pode ser adaptado para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.

Introdução

Análise de função do gene normalmente envolve uma comparação fenotípica entre uma estirpe selvagem-tipo e uma tensão em que um determinado gene de interesse foi interrompido. Esta técnica de gene-interrupção tem sido utilizada para análises de função do gene em uma ampla gama de táxons, de bactérias a mamíferos. Uma construção de gene-interrupção é necessária para a geração da estirpe gene-interrompido; Essa construção de Ácido desoxirribonucleico (DNA) consiste no gene marcador de resistência aos antibióticos fundido para o upstream e downstream flanqueiam regiões do gene alvo e é incorporada no genoma da através de recombinação homóloga. A estirpe de gene-interrompido pode ser isolada usando meios selectivos, que contém o antibiótico. O método convencional, usado para a construção da estirpe gene-interrompeu requer etapas complexas, tais como a amplificação do gene do alvo por reação em cadeia da polimerase (PCR), ligadura do gene em um plasmídeo adequado, digestão com restrição enzimas e religation para inserir o gene marcador de resistência a antibióticos. Este processo é demorado, levando vários dias a várias semanas, dependendo do sucesso de cada etapa. Além disso, o design das construções de interrupção é dependente os enzima de restrição de sites do gene do alvo. Para resolver esses problemas, têm sido relatados baseados em PCR DNA emenda métodos^1,2 para a concepção de gene-interrompeu mutantes de Dictyostelium discoideum³ e Synechocystis SP. PCC6803⁴ . No presente estudo, foi desenvolvido um método para gerar uma cepa estreptocócica gene-interrompido de forma relativamente rápida, fácil e barata, utilizando um método modificado baseados em PCR (designado 2-etapa fusão PCR) para a construção de interrupção construção e eletroporação para transformação genética.

A fusão de 2-step que PCR requer DNA genômico, o gene marcador de resistência aos antibióticos como um modelo PCR e quatro pares de adequadamente projetado primeiras demão do oligonucleotide. Na primeira etapa (1^st PCR), uma região flanqueando upstream de 1 kb do gene alvo, uma região flanqueando a jusante de 1 kb do alvo gene e do gene marcador de resistência a antibióticos são amplificados por PCR. As regiões 5' do primer o reverso e o primer para a frente, para a amplificação da montante e a jusante flanqueiam regiões, respectivamente, incluem 15 bases complementares às extremidades do gene marcador. As regiões 5' da frente e verso de primers para amplificação do gene marcador similarmente incluem 15 bases complementares para a extremidade inferior da região flanqueando montante do gene do alvo e a extremidade superior da região flanqueando a jusante do gene alvo, respectivamente. Portanto, os três fragmentos amplificados contêm regiões sobrepostas de 30 pares de base no local de fusão. Na segunda etapa (2^nd PCR), PCR é realizado com iniciadores de PCR aninhados usando os três fragmentos amplificados pelo 1^st PCR como modelos. As regiões complementares dos modelos são adicionalmente ligadas uns aos outros através de 2^nd do PCR. Finalmente, a construção por recombinação homóloga é introduzida para a estirpe selvagem-tipo por eletroporação. Interrupção de gene bem sucedido pode ser verificada por PCR utilizando primers específicos. Embora a construção de interrupção é amplificada usando DNA polimerase de alta-fidelidade, reações enzimáticas adicionais, tais como a ligadura de DNA ou digestão de DNA, não são necessárias para gerar a construção. Além disso, uma região excluída ou preservada no genoma pode ser flexivelmente escolhida de acordo com o projeto da primeira demão.

No presente trabalho, realizou-se a exclusão de toda a região de codificação do gene esferoplastos , que codifica o glucosyltransferase de Streptococcus mutans, para demonstrar o método de interrupção rápida, fácil de gene em uma espécie de estreptococos. Além disso, um Ionization-tensão interrompida foi gerado da mesma maneira. Os glucosyltransferases codificados por esferoplastos e Ionization contribuir para^65,desenvolvimento do biofilme dental cariogênica. As habilidades de formação de biofilme do selvagem-tipo tensão (S. mutans WT), esferoplastos-interrompeu a estirpe (S. mutans Δesferoplastos) e o Ionization-tensão interrompida (S. mutans ΔIonization) foram avaliados para análises comparativas fenotípicas. Este protocolo amplia a aplicação de um método de duas etapas para interrupções no gene de uma espécie de adicional e pode ser modificado para estudos da função do gene em uma escala mais larga dos táxons.

Protocolo

1. primer Design

1. preparar cartilhas para fusão 2-passo do PCR e verificação de ruptura de gene.
   Nota: A tabela 1 mostra as sequências de primer utilizadas no presente protocolo. a Figura 1 mostra uma ilustração esquemática do método PCR 2-etapa fusão usado para gerar o S. mutans Δ esferoplastos.
   1. Primers de design para a substituição da região-alvo no genoma com a resistência a espectinomicina gene (spc ^r) ⁷. Este protocolo substitui toda a região de codificação do gene esferoplastos com spc ^r.
   2. Incluem 15 bases complementares às extremidades superiores e inferiores do spc ^r no 5 ' regiões da reverso-acima e para baixo para a frente as primeiras demão, respectivamente. Da mesma forma, incluir 15 bases complementares para a extremidade inferior do montante flanqueiam regiões de esferoplastos e extremidade superior das regiões flanqueando a jusante de esferoplastos no 5 ' regiões de spc ^r-para a frente e spc ^r -reverter primeiras demão, respectivamente ( figura 1A).
      Nota: Sequências de cima-reverso, para baixo-forward, spc ^r - para a frente e spc ^r - reverter primeiras demão são determinadas automaticamente dependendo do local da incorporação da construção de rompimento.
   3. Desenha os primers acima-para a frente e para baixo-ré deve incluir > 1-kb a montante e a jusante flanqueiam regiões do gene esferoplastos, respectivamente. Definir a temperatura de fusão (T _m) de cima-para a frente e para baixo-reverso primeiras demão em conformidade com a temperatura de fusão de primers acima-reverso e para a frente para baixo, respectivamente ( figura 1A).
      Nota: Consulte a seguinte fórmula para determinar o T _m: T _m (° C) = 2 (* at + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, onde * N representa o número de nucleotídeos da primeira demão com a identidade especificada (A, T, C ou G).
   4. Projetar primers aninhados (N_up-para diante e reverso-N_up) para o 2 ^nd PCR ( figura 1B).
      Nota: Embora o par de primer ultraperiféricas (up-para a frente e para baixo-reverso) pode ser utilizado como primeiras demão para o 2 ^nd PCR, aninhadas Cartilhas (N_up-para diante e reverso-N_up) foram criadas no presente protocolo. Primeiras demão aninhadas são frequentemente necessárias para 2 ^nd PCR, como detalhado nos Resultados representante.
   5. Primeiras demão de design específicas para spc ^r. Os primers são utilizados para PCR de colônia a tela para interrupção de esferoplastos.
   Interrupção
   6. primers de design para a verificação de esferoplastos.
      Nota: Os produtos PCR amplificados usando estas primeiras demão straddle fronteira entre esferoplastos ou spc ^r e a montante ou a jusante flanqueiam regiões da superfície. Os conjuntos de cartilha ' esferoplastos acima-para diante e esferoplastos acima-reverso ' e ' esferoplastos para baixo-para diante e esferoplastos para baixo-reverso ' são específicos para a superfície, e ' esferoplastos acima-para diante e spc ^r 2 -reverso ' e ' spc ^r 2-para a frente e esferoplastos para baixo-reverso ' são específicos para spc ^r.

2. Extração de DNA genômico de S. mutans

s

1. estoque raia mutan S. UA159 em uma placa de ágar cérebro coração (BHI) de infusão. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C, em condições anaeróbias.
2. Pegar uma única colônia usando um palito esterilizado e inoculá-lo em 5 mL de caldo BHI. Incubar a cultura de s S. mutan durante a noite a 37 ° C, em condições anaeróbias.
3. Centrifugar a cultura de célula bacteriana durante 15 minutos a 2.000 g. × Ressuspender as células em 5 mL de tampão fosfato salino (PBS).
4. Centrífuga durante 15 minutos a 2.000 g. × resuspenda o pellet de células em 200 µ l de PBS.
5. Extrair DNA genômico de suspensão usando um grânulo-batendo-base genomic DNA extração kit de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
   1. a suspensão de transferência para uma amostra de 2,0 mL tubo contendo esferas de vidro (incluídas no kit). Adicionar 750 µ l de solução de lise (incluída no kit) para a suspensão celular.
   2. Tampa firmemente e coloque os tubos simetricamente no suporte do tubo do aparato de interrupção do grânulo-surra. Processo na velocidade máxima por 5 min. Amostras de centrífuga o grânulo-vencido por 1 min em 10.000 g. × Transfira o sobrenadante para o filtro de rotação (incluído no kit) em um tubo de coleta de 2,0 mL e centrifugar por 1 min em 7.000 g × .
   Buffer de
   3. Adicionar 1.200 µ l de ligação de DNA (incluído no kit) para o filtrado. Transferir 800 µ l da mistura para a coluna de rotação (incluída no kit) para um tubo de coleta de 2,0 mL e centrifugar por 1 min em 10.000 g. ×
   4. Descarte o escoamento, adicionar 200 µ l de tampão de pre-lavagem (incluído no kit) para a coluna de rotação para lavar a matriz coluna e centrifugar por 1 min em 10.000 × g.. descarte o escoamento, adicionar 500 µ l de tampão de lavagem (incluído no kit) para a rotação coluna de lavar a matriz coluna e centrifugue durante 1 min a 10.000 g. ×
   5. Coloque a coluna de rotação para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL e adicionar 100 µ l de tampão de eluição (incluído no kit) para a matriz coluna.
   6. Centrífuga por 30 s a 10.000 × g para Eluir o DNA genômico. Estimar a concentração de DNA e pureza, medindo-se a absorvância a 260 nm e 280 nmusing um espectrofotômetro e confirmar que a uma ₂₆₀ /A ₂₈₀ ratio é maior que 1,8.

3. Amplificação por PCR

1. executar o 1 ^st PCR usando o genoma de s WT S. mutan e o gene sintético spc ^r como modelos PCR (ver tabela 1). Amplificar a região flanqueando montante do gene esferoplastos, região flanqueando a jusante do gene da superfície e o gene de spc ^r usando os três conjuntos de primers descritos acima ( figura 1A), como por Tabela 2 e tabela 3.
   Nota: PCR primers, reagentes e ciclos de amplificação estão sumarizados na tabela 1, tabela 2 e tabela 3, respectivamente.
2. Fractionate cada produto do PCR em um gel de agarose 1% e as bandas correspondentes usando um cortador de banda de gel de impostos especiais de consumo.
3. Purificar cada produto de DNA amplificado dos géis usando um kit rotação coluna - e sílica gel à base da membrana extração.
   1. Transferência as fatias do gel para microcentrifuga limpa do tubo e misturam com 500 µ l de binding buffer (incluído no kit). Incubar a mistura a 55 ° C por 15 min até as fatias do gel são completamente dissolvidas.
   2. Coloque a coluna giro (incluída no kit) num tubo de colheita (incluído no kit), carregar a amostra para a coluna de rotação e centrifugar durante 30 s a 11.000 × g. Descartar o escoamento, adicionar a 600 µ l de tampão de lavagem (incluído no kit) para a coluna de Spin para lavar a membrana de silicone e centrifugar durante 30 s a 11.000 × g.
   3. Descartar o escoamento e centrifugar por 2 min em 11.000 × g para secar a membrana de silicone.
   4. Colocar a coluna de volta em um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuga, adicionar 50 µ l tampão de eluição (incluído no kit) e incubar a temperatura ambiente por 2 min.
   5. Centrífuga por 2 min em 11.000 × g para Eluir o DNA amplificado. Estimar a concentração de DNA e pureza, medindo-se a absorvância a 260 nm e 280 nmusing um espectrofotômetro e confirmar que a uma ₂₆₀ /A ₂₈₀ ratio é maior que 1,8.
4. Executar o 2 ^nd PCR de fusão 2-passo do PCR usando os três fragmentos de aproximadamente equimolar como modelos PCR, como por tabela 2 < /strong > e tabela 3.
   Nota: Estes fragmentos foram ampliados e emendados utilizando os primers aninhados ' N_up-para diante e reverso-N_down ' ou os primers ultraperiféricas ' up-para a frente e para baixo-reverso ' ( figura 1B). Iniciadores de PCR, reagentes e ciclos de amplificação estão sumarizados na tabela 1, tabela 2 e tabela 3, respectivamente.
5. Um-décimo da mistura de reação de PCR (5 µ l) em um gel de agarose 0,8% de carga e comparar o tamanho de banda amplificada com o tamanho esperado da banda para confirmar a geração do amplicon apropriado ( Figura 1).
6. Concentrar o restante produto final do PCR por precipitação do álcool etílico sem purificação.
   1. Adicionar 55 µ l de ultra pura água a restante mistura PCR para ajustar o volume total de 100 µL.Add um volume de um décimo de 3 M de acetato de sódio (10 µ l), pH 5.2, seguido por 2,5 volumes de etanol 100% (250 µ l). Misture e congelar por 30 min a -80 ° C.
   2. Centrífuga por 20 min a 15.000 × g a 4 ° C, verifique o sedimento no fundo do tubo e descartar o sobrenadante. Lavar o sedimento com 1 mL de etanol a 70%, centrifugar durante 5 min à 15.000 × g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Secar ao ar livre a pelota para cerca de 30 min e dissolver com 10 µ l de água ultra-pura.

4. Competente célula preparação e transformação de célula

s

1. estoque raia mutan S. UA159 em uma placa de ágar BHI. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C, em condições anaeróbias.
2. Pegar uma única colônia usando um palito esterilizado e inoculá-lo em 5 mL de caldo BHI. Incubar a cultura de s S. mutan durante a noite a 37 ° C, em condições anaeróbias.
3. Transferência de 2 mL de cultura de s s. mutan a 50 mL de caldo BHI e incubar durante 6-8 h a 37 ° C, com uma densidade óptica em 600 nm (OD ₆₀₀) de 0,2 a 0,4 em condições anaeróbias.
4. Centrifugar as células durante 15 minutos a 2.000 × g a 4 ° C, desprezar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com 40 mL de água gelada, seguida de 40 mL de glicerol a 10%.
   Nota: Substâncias residuais afetam electroporation subsequente.
5. , Aspire o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta Pasteur como a aderência do centrifugado em 10% de glicerol é reduzida. Ressuspender as células em 1 mL de glicerol a 10% fresco, diluir 50 µ l da suspensão em cada tubo de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C até utilização.
6. Misturar a alíquota de 50 μL de células competentes geladas com 5 µ l de construção de interrupção acima descrita na seção 3. Adicione a mistura de cubetas de eletroporação (com uma distância de 0,2 cm entre eletrodos). Empregar o modo de Staphylococcus aureus (1,8 kV, 1 pulso Ω 600, 10 µF) do aparato de eletroporação para electroporate.
7. Suspender as células em 500 µ l de caldo BHI imediatamente após electroporation e adicionar 50 µ l da suspensão à espectinomicina, contendo placas de ágar BHI.
   Nota: Incubação Extra tempo depois electroporation não é necessário. No entanto, incubação de 1-2h após electroporation pode melhorar a eficiência de transformação.
8. Incubar a placa 2-6 dias a 37 ° C em condições anaeróbias.
   Nota: Δ de S. mutans Ionization é construído conforme descrito acima. Toda a região de codificação do gene do Ionization é substituída com de gene de resistência a eritromicina ⁸ na Δ de S. mutans Ionization. Cada microrganismo S. mutans é cultivado em caldo BHI a 37 ° C em condições anaeróbias.

5. Verificação de disrupção do Gene e armazenamento

1. Escolha aleatórias colônias e inocular-os na mistura de PCR para executar colônia PCR conforme a tabela 2 e tabela 3. Iniciadores de PCR, reagentes e ciclos de amplificação estão sumarizados na tabela 1, tabela 2 e tabela 3, respectivamente.
2. Carregar a mistura de reação de PCR em um gel de agarose a 1% para confirmar o spc ^r-banda de DNA específica.
3. Escolher a colônia positiva usando um palito esterilizado e células de subcultura em 10 mL de espectinomicina contendo BHI caldo durante 2 dias a 37 ° C em condições anaeróbias.
4. Verificar a geração de Δ de S. mutans esferoplastos.
   1. Dividir a suspensão de eritrócitos. Extrair DNA genômico de células descritas acima (etapas 2.3. a 2.5.5.). Realizar PCR com DNA genômico como o modelo PCR, utilizando primers para a verificação de ruptura de esferoplastos (tabela 1) conforme a tabela 2 e tabela 3.
      Nota: As primeiras demão do PCR, reagentes e ciclos de amplificação estão sumarizados na tabela 1, tabela 2 e tabela 3, respectivamente.
   2. Carga da mistura PCR em um gel de agarose 2% e comparar o tamanho de banda amplificada com o tamanho esperado da banda para confirmar a geração do amplicon apropriado .
   3. Centrifugar a suspensão de células restantes por 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Ressuspender as células em 5 mL de PBS.
   4. Centrifugar por 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Ressuspender a célula de pelotas em 1,5 mL de caldo BHI contendo 25% de glicerol e armazenar em-80 ° CR -20 ° C.

6. Análise fenotípica

1. raia cada estirpe de s S. mutan em uma placa de ágar BHI. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C, em condições anaeróbias.
2. Pegar uma única colônia usando um palito esterilizado e inoculá-lo em 2 mL de caldo BHI com ou sem um antibiótico apropriado. Incubar durante uma noite a 37 ° C em condições anaeróbias.
3. Inocular 20 µ l de suspensão de cultura durante a noite em 2 mL de caldo BHI com 1% ou 5% de sacarose sem antibióticos em um tubo de ensaio de vidro; cultura de células com o tubo de ensaio em uma posição inclinada durante a noite a 37 ° C, em condições anaeróbias.
4. Vortex no vidro de tubos de ensaio para 10 s e suspensões de cultura de decantar. Lave os tubos de ensaio, três vezes com água destilada. Adicione 1 mL de 0.25% Coomassie brilliant blue (CBB) para manchar os biofilmes na parede do tubo e então incubar durante 1 min.
5. Decantar a solução de coloração, lavar os tubos de ensaio, três vezes com água destilada e seque os tubos de teste.
6. Avaliar tanto a densidade de cor e a extensão do CBB manchado-biofilme visualmente para determinar a capacidade de formação de biofilme em uma análise fenotípica.

Resultados

A Figura 2 mostra que o tamanho de cada produto desde a 1^st PCR, como observado sobre o gel de agarose a 1%, foi bom de acordo com o tamanho previsto de aproximadamente 1 kb. A Figura 3 mostra a análise de eletroforese de gel dos produtos da 2^nd do PCR. A Figura 4 mostra colônias de S. mutans transformadas com a construção de perturbação e uma análise de eletroforese de...

Discussão

No presente protocolo, as primeiras demão para o 1^st PCR devem ser concebidas para amplificar aproximadamente 1 kb a montante e a jusante flanqueiam regiões da região-alvo no genoma. Tais sequências flanqueando tempo são necessárias para melhorar a eficiência de recombinação homóloga.

As sequências dos primers (reverso de cima, para baixo-forward, spc^r-para a frente e spc^r-reverso) neste protocolo automaticamente foram determinados com base no...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Streptococus mutans	Cepa de estoque no laboratório.		Estirpe de tipo selvagem (Estirpe UA159)
Kit de extracção de ADN genómico	Zymo Research	D6005
Aparelho de ruptura de batimento de grânulos	Taitec	GM-01
Genes sintéticos	Eurofins Genomics	Gene de resistência à	espectinomicina e eritromicina
Termociclador	Primers de PCR Astec	PC-708
	Eurofins Genomics	Personalizado	35 bases de comprimento
DNA polimerase	Takara	R045A	gel de DNA polimerase de alta fidelidade
	Nippon Genetics	FG-91202	Extração de DNA de gel de agarose Cortador de
banda de gel	Nippon Genetics	FG-830
Espectrofotômetro	Beckman Coulter	DU 800
Electroporator	Bio-rad	1652100
Cubeta de electroporação	Bio-rad	1652086	lacuna de 0,2 cm
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Sistema de cultura anaeróbica
Caldo de infusão de cérebro e coração	Becton, Dickinson	237500	Meios de cultura bacterianos
Spectinomicina	Wako	195-11531	Antibióticos
Eritromicina	Wako	057-07151	Antibióticos
Sacarose	Wako	196-00015	Para desenvolvimento de biofilme
CBB R-250	Wako	031-17922	Para coloração de biofilme