In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são um elo importante entre os sistemas imune inatos e adaptativos. Como células apresentadoras de (APCs), eles podem se comunicar com os linfócitos através de ambos apresentação de antigénios e liberação de citocinas^1,2,3. No entanto, como fagócitos profissionais, sua principal função é limpar patógenos, células envelhecidas e restos celulares^1,4. Na sequência de uma lesão na medula espinal (SCI), quantidades substanciais de restos de mielina é gerada a partir de oligodendrócitos moribundos, o tipo de célula responsável pela CNS axônio mielinização⁵. Nós e os outros têm mostrado que o afastamento dos restos de mielina é sobretudo da responsabilidade de infiltração BMDMs^5,6,7. No entanto, dentro da lesão da medula espinhal com a duração de sites de restos de mielina tem sido sugerida para deslocar estas células normalmente anti-inflamatórios no sentido de um estado pro-inflamatórios^5,8,9. Como principais mediadores neuro-inflamação na medula espinhal lesada, BMDMs são alvos clínicos importantes.

Para ajudar a investigar a influência da BMDMs na medula espinhal lesada, desenvolvemos um modelo in vitro para estudar diretamente como BMDMs responder aos restos de mielina. Para melhorar a relevância biológica, tanto BMDMs murino primários e os restos de mielina recentemente isoladas são usados nestas investigações. Como tal, os métodos apresentados aqui também detalham o isolamento e a cultura de BMDMs murino primários e derivado de uma técnica de gradiente de sacarose modificada usada para isolar o CNS murino mielina detritos^10,11,12. Os restos de mielina podem prontamente ser rotulados com um corante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), para acompanhar que sua internalização por BMDMs. CFSE é bem adequada para esta aplicação, porque é não citotóxicas e suas licenças de espectro estreito fluorescente multiplexação com outras fluorescentes sondas^13,14. Após a fagocitose, lipídios de restos de mielina são transportados através de lisossomos e empacotados como lipídios neutros em gotículas de lipídios intracelular⁵. Para quantificar este acúmulo intracelular de lipídios, apresentamos um óleo vermelho O ORO () método otimizado para análise quantitativa de imagem de coloração. Este método de coloração simples produz resultados reprodutíveis robustos e quantificação de¹⁵. Esses métodos facilitam o estudo da mielina detritos fagocitose e lipídios de retenção com equipamento especializado limitada.

Os métodos descritos aqui e na seção 2 foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Florida estado Universidade institucional Cuidado Animal e segue as directrizes estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório, 8^ª edição . Todos os animais utilizados no presente no presente protocolo são casa em um centro de animais de laboratório dedicado até o uso. Nenhuma experimentação na vivo foi realizado antes do sacrifício. Número de animais foram baseado na necessidade experimental usando a célula média e coleções de mielina, como um guia a fim de minimizar o uso.

Nota: Este protocolo descreve a geração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) (secção 1), a preparação dos restos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro (seção 2), o procedimento geral para a análise de fagocitose de restos de mielina (seção 3), e o procedimento geral para análise de acumulação de lipídios de detritos de mielina (secção 4). Preparação do reagente, celular colheita e manipulação, coleção de mielina e rotulagem e ensaio de desempenho devem ser concluídas em uma fluxo de ar laminar de biossegurança do armário.

1. geração de macrófagos derivados da medula óssea primárias

1. Preparação do meio de cultura completo macrófago (CMCM)
   Nota: geração de macrófagos da medula óssea requer o uso de fator colônia-estimulando do macrófago (M-CSF). Esta preparação utiliza mídia de fibroblasto murino condicionado L929 como fonte de M-CSF.
   1. Gere mídia de fibroblasto murino condicionado L929 por cultivo de células em pratos de 145 mm com 50 mL de glicose elevada (4500 mg/L, L-glicose) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 5% de soro de bezerro nascido novo (NCS) e penicilina/estreptomicina por 7 dias.
   2. Recolher meios de culturas em tubos de centrifuga conico de 50 mL e centrifugar durante 30 minutos a 3500 x g, 4 ° C.
   3. Filtrar sobrenadantes através de um filtro de seringa 0,2 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL. Condicionado de mídia pode ser armazenadas a-80 ° C por até 6 meses.
   4. A glicose alta DMEM, adicionar 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 murino fibroblasto condicionado DMEM e 1% penicilina/estreptomicina. Meios de comunicação podem ser armazenados a 4 ° C durante 2-3 meses. Aquecido a 37 ° C antes do uso.
2. Coleção de células primárias da medula óssea e indução de macrófagos
   Nota: Usando este um mouse protocolo irá gerar aproximadamente 20 milhões derivadas da medula óssea macrófagos (BMDMs).
   1. Eutanásia o número desejado de semana de 8-10 ratos velhos usando padrão CO₂ diretrizes de asfixia seguidos por deslocamento cervical.
   2. Higienizar o animal usando 70% (vol/vol) etanol: H₂O, saturando o pelo.
   3. Cortar uma pequena abertura no abdômen e puxe cuidadosamente a pele para revelar o tecido subjacente. Tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal.
   4. Remova ambas as pernas traseiras, começando no quadril e terminando na altura da tornozelo. Lugar do tecido coletado em um prato de Petri de 100mm contendo fosfato estéril de 5-10 mL tampão salino (PBS) suplementado com 1% penicilina/estreptomicina.
      Nota: Quando processar vários animais certifique-se de manter os pratos no gelo para limitar a degradação do tecido.
   5. Retire o músculo e tecido conjuntivo do osso usando um bisturi. Apenas o fêmur e a tíbia são utilizados para coleta de célula, a fíbula pode ser descartada.
   6. Expor a cavidade da medula dos ossos recolhidos por aparar uma pequena secção de cada extremidade com um bisturi.
   7. Usando uma agulha 25g, irrigue as cavidades da medula com CMCM em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Os ossos aparecerá brancos, uma vez que eles têm sido suficientemente liberados.
   8. Concluída a coleta, agite aspirados com uma agulha de 18g por 30-90 s gerado uma suspensão de célula única.
      Nota: Um passo de Lise opcional – glóbulos vermelhos (RBC) pode ser realizado neste momento. Recentemente tem sido sugerido que o teor de ferro intracelular pode influenciar os efeitos dos restos de mielina em macrófago polarização¹⁶. Para obter informações sobre a inclusão de uma etapa de Lise RBC referir-Trouplin et al. ¹⁷.
   9. Filtre a suspensão através de um filtro de célula estéril 70 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL.
   10. Sementes coletadas células uniformemente em pratos de cultura celular de 145 mm com 15-20 mL CMCM. Use aproximadamente três pratos de cultura por rato sacrificado. Incube as culturas a 37 ° C, 5% de CO₂.
   11. Após 72 horas lavar pratos uma vez com PBS estéril para remover as células não-aderentes, em seguida, adicione 15-20mL CMCM fresco. Incube as culturas por mais 4 dias a 37 ° C, 5% de CO₂. Após 7 dias de cultura total, as células hematopoiéticas da medula óssea inicialmente isoladas será maduros BMDMs (Figura 1).

2. geração de detritos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro

Nota: Todos os reagentes podem ser armazenados a 4 ° C por até 1 mês.

1. Preparação dos reagentes de coleção de restos de mielina
   1. Preparar Tris· Solução-tampão de CL.
      1. A 800mL água destilada deionizada H₂O (ddiH₂O) adicionar 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentração final de 20 mM) e 20 mL de 100mm Na₂EDTA (concentração final de 2 mM).
      2. Ajuste o pH a 7,45. Ajuste o volume para 1000 mL com ddiH₂solução de filtro de O. através de uma unidade de filtração 0,2 µm.
   2. Prepare a solução de sacarose 1M.
      1. A 100 mL de Tris· CL solução de tampão, adicionar 68,46 g de sacarose. Ajustar o volume de 200 mL com Tris· Solução-tampão de CL. Filtre a solução através de uma unidade de filtração de 0,2 µm.
   3. Preparar 200 mL de solução de sacarose de 0,32 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).
   4. Preparar 150 mL de solução de sacarose de 0,83 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).
2. Coleção de restos de mielina bruto derivado do cérebro
   Nota: O método de coleta descrito aqui é para o isolamento dos restos de mielina bruto.
   1. Eutanásia em ratos de 10-12 8-10 semanas de idade usando padrão CO₂ diretrizes de asfixia seguidas por deslocamento cervical.
   2. Dissecar o cérebro e os coloque em um prato de 100 mm, contendo 10 mL de solução de sacarose de 0,32 M.

3. a mielina ensaio de fagocitose de detritos

Nota: O seguinte é o método básico para observar a fagocitose de restos de mielina fluorescente etiquetadas. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.

1. Preparação de placas de tratamento
   1. Para cada placa de 145 mm, colete BMDMs maduros em um tubo de centrifuga conico de 15 mL com 5-6 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 10mm (EDTA) em fosfato salino de Dulbecco (dPBS) (pH 7,4).
      Nota: Não utilize tripsina pois ele pode alterar o estado de ativação de células¹⁸.
   2. Adicione um volume igual de CMCM pré-aquecido a cada tubo de células coletadas.
   3. Centrifugar a 180 x g por 8 min a 20 ° C. Desprezar o sobrenadante.
   4. Ressuspender as células em CMCM e contagem.
   5. A cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços, adicione 1 x 10⁵ células em 1 mL de CMCM.
   6. Incube a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 h.
2. Análise e tratamento de resíduos de mielina
   1. Adicione 10 µ l de 100 mg/mL CFSE rotulado os restos de mielina de cada bem (concentração final de 1 mg/mL).
   2. Incube durante 1-3 horas a 37 ° C, 5% de CO₂.
   3. Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não engolido.
   4. Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.
   5. Lave a placa 2 vezes com PBS estéril.
   6. Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.
   7. Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.
   8. Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço para reduzir fotobranqueamento.
   9. Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido.
      Nota: Os excitação e emissão de comprimentos de onda de CFSE são 494 nm e 521 nm, respectivamente.
   10. Divida o número de células positivas CFSE pelo número de núcleos para determinar a absorção de restos de mielina relativo.
   11. Antes da imagem latente, manter as placas por até 7 dias a 4 ° C, protegido da luz.

4. quantificação dos lipídios intracelulares através de coloração de vermelho-O óleo

Nota: O seguinte é o método básico para a observação de lipídios intracelulares de mielina-detritos derivados.O uso de CFSE rotulado os restos de mielina não é recomendado para quantificação fluorescente de ORO de coloração devido à sobreposição espectral. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.

1. Preparação de soluções de coloração
   1. Prepare a solução de coloração vermelho-O óleo (ORO) 0,5%.
      1. Lentamente, adicionar 100 mL de propilenoglicol 100% (1,2-propanodiol) a 0,5 g de ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol), agitando.
      2. Aqueça a 95 ° C por 15 min ou até que todas as partículas grandes são dissolvidas.
         Nota: Não aqueça acima de 100 ° C.
      3. Filtrar a solução através de um pedaço de papel de filtro, enquanto ainda quente em um novo recipiente.
      4. Permitir que a solução legal durante a noite no RT. solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT
   2. Prepare a solução de glicol de propileno de 85%.
      1. Adicione 85 mL de propilenoglicol 100% para 15 mL de ddiH₂O. mexa até misturado. Solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT
2. Preparação de placas de tratamento
   1. Prepare uma placa de 24 seguindo o método descrito na seção 3.
   2. Incube a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 h.
3. Tratamento de detritos de mielina
   1. Adicione 10 µ l de restos de mielina de 100 mg/mL a cada poço (concentração final de 1 mg/mL).
   2. Incube durante 1-3 h a 37 ° C, 5% de CO₂.
   3. Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não digerido.
      Nota: Neste ponto, placas podem também sofrer fixação imediata ou CMCM fresca pode ser adicionada, e células retornou a incubação por pontos de tempo adicional.
   4. Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.
   5. Lave a placa 2 vezes com PBS estéril então, procced à mancha.
4. Coloração de ORO e análise
   1. Lave a placa fixa 3 vezes com ddiH₂O.
   2. Adicione 400 µ l de propileno glicol de 100% a cada poço e incubar durante 5 min à RT
      Nota: isto irá reduzir o reporte de ddiH₂O.
   3. Aspirar o propilenoglicol e adicione 400 µ l de solução ORO a cada poço.
   4. Incubar durante 8 min a 60 ° C.
   5. Aspire a solução ORO. Em seguida, adicione 400 µ l de 85% propilenoglicol a cada poço e incubar durante 5 minumintes no RT
   6. Lavar a placa 3 vezes com ddiH₂O.
   7. Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.
   8. Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.
   9. Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço.
   10. Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. ORO pode ser fotografada usando um conjunto padrão de filtro vermelho Texas ou DsRed.
   11. Quantificar de retenção relativo lipídios determinando a área positiva de ORO em cada campo de imagem e dividindo-o pelo número de núcleos.
   12. Manter as placas durante 7 dias a 4 ° C protegido da luz.

Tratamento de BMDMs com CFSE rotulado os restos de mielina deve produzir interiorização clara (Figura 2). Enquanto um tempo de 3 horas de interação é suficiente para BMDMs fagocitar suficiente restos de mielina adicionado para a deteção de jusante robusto, acúmulo intracelular pode ser observado com tão pouco quanto 1 hora da interação. No entanto, alguns restos de mielina ainda podem estar presentes na superfície das células após a lavagem. Isto pode ser devido à lavagem insuficiente, ou não sendo totalmente internalizadas durante os estágios iniciais de fagocitose de partículas.

Enquanto BMDMs rapidamente pode internalizar os restos de mielina, processamento dos lisossomos é necessário antes a forma de gotículas lipídicas stainable ORO. Para demonstrar, BMDMs foram incubadas com os restos de mielina durante 90 minutos, lavados e cultivadas por quantidades adicionais de tempo antes da fixação e coloração (Figura 3). A Figura 4 mostra que há um atraso entre o início do tratamento e aparência de lipídios neutros. Também deve ser notado que a retenção de lipídios não é estável durante a cultura. BMDMs vai começar a metabolizar lipídios acumulados logo após a formação da gota. Como tal, recomendamos esperar não mais de 24 horas entre os restos de mielina não-tragado ausente de lavagem e fixação.

Quantificação de ORO manchado área demonstra a taxa de metabolismo de lipídios mielina em BMDMs (Figura 5). Após um período de 90 minutos de interação, as células foram devolvidas para incubação em CMCM fresco. Durante o período inicial de perseguição em meio fresco, os BMDMs metabolizam o componente de lipid de detritos fagocitados mielina em lípidos stainable neutros de ORO. Um aumento constante na área positiva de ORO é típico nas horas após a interação. Depois de 24 horas, os BMDMs terão effluxed ou metabolizada uma parcela significativa dos lipídeos intracelulares.

Figura 1 : Representante BMDM culturas. Poucas células aderentes serão observadas inicialmente. No dia 3, as células não-aderentes são removidas. Por 7 dia, observam-se macrófagos maduros derivadas da medula óssea. Escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Ensaio de imagens de representante da fagocitose de restos de mielina BMDM. As células foram tratadas com 1mg/mL CFSE rotulado os restos de mielina por 1 hora antes da lavagem e fixação com 4% PFA. Os restos de mielina interiorizada podem ser visualizado usando conjuntos de filtro padrão GFP em um microscópio capaz de epi-fluorescente. Escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Diagrama de óleo O vermelho (ORO) Experimental Design. BMDM são tratados com os restos de mielina de 1mg/mL (diluição 1: 100) por 90 minutos, seguido de lavagem e cultura em meio fresco antes da fixação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : ORO coloração de BMDM após a fagocitose de restos de mielina. Seguir fixação com 4% PFA nos pontos de tempo indicados, BMDMs foram corados com ORO e Hoechst 33258. São mostradas imagens representativas para cada ponto de tempo. Escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Análise quantitativa de imagem de ORO coloração. Para a quantificação de ORO de coloração, 3 poços foram fotografados em 20 X com 5 imagens por bem. Todas as configurações de aquisição de imagem eram idênticas. Barras de erro = SEM. (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores têm sem divulgações.