In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Summary

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

Abstract

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são leucócitos maduros que servem a um papel fisiológico crítico como fagócitos profissionais capazes de limpar uma variedade de partículas. Normalmente, BMDMs são restritas do sistema nervoso central (SNC), mas após uma lesão, podem facilmente se infiltrar. Uma vez dentro o tecido lesado do CNS, BMDMs são o tipo de célula primária responsável para a liberação de restos celulares derivados de lesões, incluindo grandes quantidades de detritos de mielina rica de lipídios. As ramificações neuropatológicas da fagocitose de detritos infiltração e mielina BMDM dentro o CNS são complexas e não é bem compreendido. Os protocolos descritos aqui, permitem direto em vitro estudo da BMDMs no contexto de lesão de CNS. Nós cobrimos murino BMDM isolamento e cultura, preparação de restos de mielina e ensaios para avaliar a fagocitose de restos de mielina BMDM. Estas técnicas produzem resultados quantificáveis robustos, sem a necessidade de equipamento especializado significativo ou materiais, no entanto, podem ser facilmente personalizadas para atender às necessidades dos pesquisadores.

Introduction

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são um elo importante entre os sistemas imune inatos e adaptativos. Como células apresentadoras de (APCs), eles podem se comunicar com os linfócitos através de ambos apresentação de antigénios e liberação de citocinas^1,2,3. No entanto, como fagócitos profissionais, sua principal função é limpar patógenos, células envelhecidas e restos celulares^1,4. Na sequência de uma lesão na medula espinal (SCI), quantidades substanciais de restos de mielina é gerada a partir de oligodend....

Protocol

Os métodos descritos aqui e na seção 2 foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Florida estado Universidade institucional Cuidado Animal e segue as directrizes estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório, 8^ª edição . Todos os animais utilizados no presente no presente protocolo são casa em um centro de animais de laboratório dedicado até o uso. Nenhuma experimentação na vivo foi realizado antes do sacrifício. Número de animais foram baseado na necessidade experimental usando a célula média e coleções de mielina, como um guia a fim de minimizar o uso.

Nota: Este proto....

Results

Tratamento de BMDMs com CFSE rotulado os restos de mielina deve produzir interiorização clara (Figura 2). Enquanto um tempo de 3 horas de interação é suficiente para BMDMs fagocitar suficiente restos de mielina adicionado para a deteção de jusante robusto, acúmulo intracelular pode ser observado com tão pouco quanto 1 hora da interação. No entanto, alguns restos de mielina ainda podem estar presentes na superfície das células após a lavagem. Isto pode ser devido à lavagem insuficiente, ou nã.......

Discussion

Os procedimentos descritos aqui utilizam ambos recém isolados restos de mielina CNS bruto e macrófagos derivados da medula óssea primários. Para reduzir despesas do animais, é recomendável que os cérebros e células da medula óssea de cada rato ser colhidas no momento do sacrifício. Dois pesquisadores trabalhando juntos podem preparar ambos os materiais simultaneamente. Alternativamente, os cérebros podem ser armazenados a-80 ° C em PBS suplementadas com antibióticos antes de isolamento de restos de mielina. Tem sido noss.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01	Alta glicose com L-glutamina, pirovato de sódio
Solução de Penicilina-Estreptomicina	Corning	30-002-CI	100X Solução
Soro de Bezerro Recém-nascido (NCS)	Rocky Mountain Biologics	NBS-BBT-5XM	Origem dos Estados Unidos
NCTC clone 929 [célula L, L-929, derivado da Cepa L]	ATCC	CCL-1	L929 Linha Celular de Preparação de Meios
Condicionados Placas de Cultura de Células de 24 poços	VWR	10062-896
Prato de Cultura de Células	Greiner Bio-One	639960	Polistyrin, 145/20mm
CFSE Kit de Proliferação Celular	Thermo Fisher	C34570	DMSO para Reconstrução Fornecido
Fluoro-gel com Tris Buffer	Microscopia Eletrônica Ciências	17985-11
Óleo Vermelho O	Sigma Aldrich	O0625
Equipamento
Materiais<	forte>Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de Ultracentrífuga	Beckman Coulter	326823	Thinwall, Polipropileno, 38,5 mL, 25 x 89 mm
SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor	Beckman Coulter	369650	SW 32 Ti, Balde Oscilante,
Homogeneizador Rotativo Manual	Fisher Science	08-451-71