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Artigo de método

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

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DOI:

10.3791/56325

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12 de outubro de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui um ensaio livre celular bioquímico fluorométrica para determinação da peroxidação lipídica-HDL. Este ensaio rápido e reprodutível pode ser usado para determinar a função do HDL em estudos de grande escala e pode contribuir para nossa compreensão da função do HDL em doenças humanas.

Resumo

Os níveis de colesterol (HDL-C) baixa lipoproteína de alta densidade são um dos mais poderosos preditores independentes de negativos de doença cardiovascular aterosclerótica (CVD). A estrutura e a função do HDL, ao invés de HDL-C podem prever com mais precisão a aterosclerose. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Função do HDL é geralmente determinada por célula com base em ensaios como ensaio de efluxo de colesterol mas estes ensaios tem numerosos de inconvenientes de falta de padronização. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. Oxidação de HDL prejudica a função do HDL. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Interações lipid-sonda devem ser consideradas quando a interpretação dos resultados de fluorescência não enzimáticos ensaios para medir o estado oxidativo de lipídios. Isto motivou-na desenvolver um método enzimático bioquímico celular livre para avaliar HDL peróxido teor lipídico (HDLox) que contribui para a disfunção de HDL. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C. Eis um protocolo describedfor determinação da peroxidação lipídica HDL usando o reagente de fluorocromo. Variabilidade do ensaio pode ser reduzida pela padronização rigorosa das condições experimentais. Valores mais altos de HDLox estão associados com a função de antioxidante HDL reduzida. A leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e fenótipos associados risco cardiovascular e metabólico. Esta abordagem técnica é um método robusto para avaliar a função do HDL em doenças humanas, onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel fundamental (tais como a aterosclerose).

Introdução

Doença cardiovascular aterosclerótica (DCV) é a principal causa de morte em todo o mundo1,2. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que baixos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) colesterol geralmente estão inversamente associados com o risco para o desenvolvimento da aterosclerose1,2. Embora diversos estudos apoiam um papel atheroprotective para HDL1,2, o mecanismo pelo qual o HDL atenua o início e progressão da aterosclerose é complexo 3,4. Assim, tem sido sugerido que a complexa estrutura e função do HDL, ao invés de nível absoluto podem prever com mais precisão aterosclerose 5,6,7,8. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Estes i) reduzir seu potencial de efluxo de colesterol 9, ii) diminuir anti-inflamatório e aumento de HDL-associado a proteínas pró-inflamatórias 6,7, iii) diminuição fator os níveis de antioxidantes e atividade e HDLs capacidade de inibir a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDLox)10 e iv) aumentar lipídico hidroperóxido conteúdo e redox atividade (HDLox)9,11. Robustos ensaios que avaliam as funções de pleotropic de HDL (tais como o efluxo de colesterol, função antioxidante) podem complementar a determinação de HDL-HDL-C, na clínica.

Função do HDL é geralmente avaliada por métodos baseados em células, tais como o colesterol efluxo ensaio8,12,13,14. Esses métodos têm limitações principais incluindo heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura relatado, a falta de padronização e confundimento efeitos de triglicerídeos 7,15. Estas desvantagens apresentam dificuldades para grandes estudos clínicos16. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. O efluxo de colesterol é uma das mais importantes funções de HDL, mas isso só pode ser determinado por ensaios cell-based. Outras abordagens para determinar a função do HDL como proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 e ensaios de quimiotaxia de monócitos baseada em célula de HDL função 17,22,25 não tem sido padronizados e não pode ser usados em estudos humanos em grande escala.

HDL tem antioxidante significativa atheroprotective efeito5,6,7,8. Determinou-se a função antioxidante de HDL na presença de LDL anterior célula livre ensaios fluorométrica 26. Estes métodos bioquímicos fluorométrica de função antioxidante de HDL foram originalmente desenvolvidos por Mohamad Navab e Alan Fogelman e seus colegas26. Embora muitos estudos humanos usaram estes métodos para determinar o HDL função 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipídios (HDL)-lipídeos (LDL) e interações lipid-fluorocromo podem limitar a reprodutibilidade destes celular grátis não enzimáticos bioquímicos ensaios de HDL função27,28.

Recente interesse centrou-se sobre as consequências funcionais da oxidação de HDL que é o resultado da oxidação de lipídios e proteínas dentro de HDL 27,29,30. Estudos prévios mostraram que oxidação de HDL prejudica HDL função 27,29,30. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Assim, teor de peróxido lipídico HDL pode ser usado para determinar o HDL função 9,17,20,31 e dada as limitações conhecidas dos ensaios prévios de HDL função7, de27,de 15,32, desenvolvemos um método alternativo de fluorométrica que quantifica o HDL lipid índice de peróxido (HDLox) 32. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C 32. O princípio bioquímico do ensaio é mostrado na Figura 1. Mostramos que essa abordagem baseada em fluorescência não tem as limitações de prévia HDL função ensaios27,28. Este ensaio tem sido ainda mais refinado e padronizado em nosso laboratório para que confiável pode ser usada em estudos humanos em grande escala, mesmo com criopreservado plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. a leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e risco cardiovascular e metabólico associado fenótipos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. aqui, descrevemos este método simples, porém robusto para medir o teor de peróxido do lipídico HDL (HDLox). Este ensaio pode ser usado como uma ferramenta para responder perguntas de pesquisas importantes sobre o papel da função de HDL em doenças humanas onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel-chave (tais como aterosclerose)32.

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Protocolo

todos os experimentos utilizando amostras biológicas humanas foram realizados com aprovação de ética da Universidade da Califórnia em Los Angeles, Los Angeles e o Comité de ética humana do Alfred Hospital, Melbourne.

Nota: há muitas variações da função fluorocromo HDL ensaio (ver discussão) 32. Abaixo descrevemos o protocolo que dá os resultados mais consistentes e reprodutíveis. Uma visão geral do ensaio é mostrada na Figura 2.

1. processamento de amostras

  1. uso soro fresco, não hemolizado (podem ser coletadas em tubos de separador de soro) ou plasma citrato obtidos após 12-14 horas de jejum. Se usando amostras criopreservadas, incluem controle apropriado conforme descrito neste protocolo.

2. Dia 0-preparação para o ensaio

  1. preparar layout de trabalho de experiência com os controles apropriados, amostras e Replica. Execute cada amostra pelo menos em triplica. Um layout bem representante 96 é mostrado na Figura 3.
  2. Calcular todos os volumes dos reagentes que serão utilizados para o ensaio com base no número de amostras e repetições.
    Nota: Incluir um volume adicional de 10% em cada estoque de trabalho para garantir que haja volume suficiente para cada reagente para o experimento específico.
  3. Etiqueta tubos necessários para todas as diferentes etapas do ensaio, por exemplo, para a separação de HDL, medição de HDL-C (opcional) e o fluorochromeassay.

3. Dia 1-preparação de controles

  1. preparação de estudo específico em pool controle
    1. criar uma amostra de soro ou plasma em pool de estudo todas as amostras. Se executando 20 amostras em cada placa em triplicado, combine 10 µ l de cada amostra em um controle de 200 µ l em pool. Dê uma alíquota separada deste controle em pool para o laboratório clínico para determinar o valor de HDL-C deste controle.
      Nota: Usar esse controle em pool para padronizar o ensaio e contabilizar tudo possível conhecido (por exemplo, tipo de soro de matriz versus plasma, ciclos de gelo-degelo, criopreservação) e confundidores desconhecidas que podem afetar a variabilidade experimental 27 , 28.
  2. Preparação específicas do laboratório de controle de qualidade (QCs)
    1. preparar um grande estoque de HDL em cada laboratório (por exemplo HDL isolada de 5 mL de plasma de 10 doadores saudáveis) e cryopreserve várias alíquotas do presente ações para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento.
    2. Uso de pelo menos 10 diferentes Replica deste estoque para determinar o valor médio de HDLox. Uma faixa aceitável de medição HDLox valores para cada amostra QC incluída em cada ensaio é dentro < 15% do coeficiente de variação deste valor médio.
    3. Dar uma alíquota separada deste controle em pool para o laboratório clínico para determinar o valor de HDL-C de controle (por exemplo, 40 mg/dL).
      Nota: Uma abordagem detalhada como usar sangue de bancos de sangue para criar esses controles anteriormente foi descrito 27 , 28 , 32. Use QCs adicionais conforme necessário (por exemplo, uma de um doador saudável, conhecido por ter a função de HDL normal e uma de um doador conhecido por ter a função de HDL em grande parte anormal.
  3. Otimização de sinal de fundo e valores em branco (opcionais)
    1. para minimizar o plano de fundo, adicionar a quantidade apropriada de catalase (1-4 U/mL) no meio de incubação para remover rapidamente o formado de H 2 O 2 devido à oxidação do ar espontânea dos buffers.
      Nota: Desde que os valores dos poços em branco (não HDL) estão sendo subtraídos os valores das amostras de HDL e os resultados estão sendo relatados em relação a um controle em pool (que está incluído no mesmo prato bem 96), encontramos que este passo é que praticamente não afecte t os resultados. Assim, a otimização do sinal de fundo com catalase pode ser omitida, se necessário.

4. Dia 1-separação de HDL-colesterol utilizando a precipitação de HDL

Nota: Use um reagente precipitante comercialmente disponível de padronizada HDL colesterol para isolar apoB empobrecido soro de acordo com o fabricante ' s instruções. Estes reagentes são amplamente utilizados em ensaios colorimétricos para determinar os níveis de colesterol HDL.

  1. Usar fresco (ou descongelar) amostra de soro ou plasma.
  2. Misturar volumes iguais (por exemplo, 80 µ l) de plasma e reagente precipitante do HDL colesterol (20% w/v polietilenoglicol em tampão glicina pH 10,0 (25 ° C)).
  3. Mix bem pipetando para cima e para baixo.
  4. Centrifugar a 1000 a 2000 x g por 10 min.
  5. Aspire o sobrenadante (fração de HDL).
  6. Idealmente usar imediatamente o HDL isolado para o fluorochromeassay de peroxidação lipídica de HDL. No entanto, se várias amostras são executadas no mesmo dia e outros passos, tais como a medição da concentração de HDL-colesterol também são feitas, então armazenar o HDL isolado a 4 ° C e usá-lo no dia seguinte para a função de fluorochromeHDL ensaio.

5. Dia 1-determinação de HDL-C, HDL isolado

Nota: isto é opcional, se o valor de HDL-C de laboratório clínico é usado para normalizar HDLox pela quantidade de HDL-C.

  1. Quantify o HDL-colesterol do plasma, utilizando padrão colorimétrico ensaios 27. Adicionar 50 µ l de reagente de colesterol em cada poço e determinar a concentração de colesterol, usando um leitor colorimétrico e um colesterol padrão fornecido em cada kit.

6. Dia 2-preparação dos reagentes

  1. soluções preparar HRP e colesterol de HRP 5 U/mL de solução (intervalo de 1-10 U/mL).
  2. Preparar 20mm fluorocromo (por exemplo, Amplex vermelho) soluções: descongelar um frasco de reagente fluorocromo e DMSO à temperatura ambiente. Antes da utilização, dissolva o reagente fluorocromo (1 mg) em 200 µ l de DMSO. Armazenar a solução estoque congelada no ≤-20 ° C, protegido da luz.
  3. Preparar controles positivos e negativos: uso 1 X ' amortecedor da reação ' sem colesterol e 20 mM H 2 O 2 solução de trabalho como um controle negativo e positivo, respectivamente.

7. Dia 2-fluorocromo ensaio

  1. Adicionar 50 µ l de tampão de reação como branco (controle negativo) 1x.
  2. Opcional: Adicionar solução de trabalho de 20 mM de H 2 O 2 como controle positivo em cada placa.
  3. Para minimizar a variabilidade experimental e certifique-se que a adição de reagentes e amostras é feitas de forma consistente e em tempo hábil, realizar todas as adições de amostras em uma placa separada de bem fundo redondo, claro, poliestireno ou polipropileno 96 (chapa 1). Em seguida, usar uma pipeta multicanal para transferir volumes específicos em 3 placas de 96 poços (placas de 2-4: polipropileno, plana botTom, preto) (que tem o layout idêntico) ( Figura 2, Figura 3).
    1. Por exemplo, primeiro adicione 160 µ l de HDL isolado em cada poço/amostra de placa 1 e depois com o uso da pipeta multicanal transferir 50 µ l de HDL-colesterol de cada poço/amostra para as placas de 96 poços pretas. Mudar dicas entre cada linha/coluna e usar dicas não filtrada para todas as transferências.
  4. Deixar amostras dos poços. Não jogue fora. Não há nenhum etapas de lavagem entre adição dos reagentes.
  5. Adicionar 50 µ l de solução de HRP 5 U/mL (0,25 U) em cada Pocito.
    Nota: Uso HRP antes da adição do reagente fluorocromo.
  6. Incube durante 30 min a 37 ° C. Não descartar amostras após incubação (sem etapas de lavagem entre adições de reagentes).
  7. Adicionar 50 µ l de fluorochromereagent para uma concentração final de 300 µM. Neste ponto, a reação total volume é 150 µ l. Misture bem e proteger da luz.
  8. Avaliar a leitura fluorescente (no escuro) cada minuto mais de 120 min a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/590 nm).
    Nota: Utilize um intervalo de 60 minutos mais curto com amostras frescas. Encontramos esse ensaio de 120 minutos dá mais dados podem ser reproduzidos com a utilização de amostras criopreservadas.
  9. Gravar dados usando o software apropriado.

8. Análise de dados 3 dia

  1. gravar unidades de fluorescência (unidades arbitrárias) 120 minutos após a adição do fluorocromo reagente para todas as amostras, incluindo poços em branco e todos os controles.
  2. Calcular o valor médio das unidades de fluorescência (com base em, pelo menos, triplica) (HDL ox_sample). Não tome valores atípicos (> 2 SDs de valor médio) em consideração.
  3. Subtrair a fluorescência de fundo usando a seguinte equação:
    figure-protocol-1
  4. normalização para a quantidade de colesterol HDL (HDL-C): normalizar o valor de peroxidação lipídica HDLox para cada amostra (incluindo o controle em pool) pela HDL-C) (mg/dl). Em toda a seção de resultados, HDL boi é apresentado como n HDLox (HDL-C) medida para refletir o ajustamento para HDL-C. Use a seguinte equação:
    figure-protocol-2
  5. padronizar a expressão do HDLox valor de peroxidação lipídica de cada amostra contra o valor de um controle em pool. Normalize o n (HDL-C) HDLox valor de peroxidação lipídica para cada amostra (ajustada para HDL-C) pelo n (HDL-C) HDLox valor de peroxidação lipídica do controle em pool. Em toda a seção de resultados, HDL boi é apresentado como medida de boi nHDL para refletir a adaptação à variabilidade experimental e HDL-C. Use a seguinte equação:
    figure-protocol-3
    Nota: esta abordagem é semelhante a outras abordagens experimentais estabelecidas para reduzir variabilidade experimental das medições, tais como internacional normalizado ratio (INR) 44 , 45. Esta abordagem foi validada em estudos clínicos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.
  6. Executar controle de qualidade dos resultados experimentais usando amostras de controlo de qualidade padrão. Cada laboratório deve estabelecer seus próprios controles de qualidade (QCs). Idealmente, há um QC para nHDLox de uma amostra com conhecidos HDL disfuncional e um QC para nHDLox de uma amostra de doadores saudáveis [por exemplo, uso amostras de jovens adultos que são estabelecidos banco de sangue de doadores e não tem conhecida comorbidade e fatores de risco para doença cardiovascular incluindo fumar]. Controle o último padroniza resultados entre diferentes laboratórios. Os valores médios destes QCs são com base em pelo menos 5 é replicada estabelecidas (normalmente usamos 10 repetições para este passo importante).
    1. Seleção se QCs medidos em cada ensaio têm valores dentro do intervalo esperado de valores. Assumindo uma variabilidade experimental máxima aceitável de 15%, todos os valores medidos experimentais devem cair dentro de 15% dos valores médios conhecidos do QC estabelecido. Use as seguintes equações:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      Nota: se também do controle da qualidade incluído amostras ( normal versus disfuncional HDL) dá HDLox valores fora do intervalo esperado (estabelecido em cada laboratório), em seguida, repetir a experiência.
  7. Executar controle de qualidade dos resultados experimentais, usando o coeficiente de variação (CV) para quantificar a variabilidade experimental: repetir todas as amostras com CV % > 15%. Use a seguinte equação:
    figure-protocol-6
    Nota: é um típico intraensaio (dentro da mesma placa) e variabilidade experimental inter-ensaio (entre diferentes placas) < 15%. 2) um típico intraensaio CV é entre 1-7% e um típico interassay CV é entre 3-10%.

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Resultados

50 µ l de cada amostra de HDL são adicionados em cada poço como no passo 7.3. 50 µ l de solução HRP 5 U/mL (0,25 U) são adicionados para cada poço como na etapa 7.5. As amostras são incubadas por 30 min a 37 ° C, como na etapa 7,6. 50 µ l de reagente fluorocromo são então somados para cada poço como na etapa 7,7 (concentração final de 300 µM). A leitura fluorescente (no escuro) é então avaliada cada minuto mais de 120 minutos a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/5...

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Discussão

O protocolo descrito aqui oferece uma ferramenta robusta para responder perguntas importantes pesquisas sobre o papel da função de HDL em aterosclerose e doenças humanas. O ensaio quantifica o teor de peróxido lipídico HDL por mg de HDL-C usando amplificação enzimática (HRP). Essa abordagem evita as limitações conhecidas dos ensaios de função prévias HDL (por exemplo, o ensaio de efluxo de colesterol) incluindo a heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura que relatou, falta de...

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Divulgações

Este protocolo e ensaio são relevantes para a patente PCT/US2015/018147.

Agradecimentos

Os autores, com gratidão, reconhecer o trabalho do Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy para seu papel-chave no desenvolvimento de iterações anteriores deste modelo. T.A.A. é suportado por um RMIT University Vice-Chanceler do Postdoctoral Fellowship. AJ e AH são suportados por NHMRC projeto grant 1108792. TK é suportado pelo NIH concede NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes experimentais
HDL PEG (Polietilenoglicol) Reagente PrecipitantePointe ScientificH7511
Reagente vermelho AmplexLife Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red.
• ≤ – 20° C &touro; Dessecado
• Proteja da luz
DMSO.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red.
• ≤ – 20° C &touro; Dessecado
• Proteger da leve
Peroxidase de Rabanete de Cavalo (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYAmplex Red A12216.
• ≤ – 20° C &touro; Dessecado
• Proteger da Esterase de Colesterol
Light.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red.
• ≤ – 20° C &touro; Dessecado
• Proteger da luz
Colesterol Referência padrãoLife Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red.
• ≤ – 20° C &touro; Dessecado
• Proteger da luz
Resorufin fluorescense Referência padrãoLife Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red.
• ≤ – 20° C &touro; Dessecado
• Proteja da luz
5x Buffer de Reação.Life Technologies, Grand Island, NYA12216Kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red.
• ≤ – 20° C &touro; Dessecado
• Proteger da luz
HDL Colesterol Reagente AutomatizadoThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, EUA.TR39601
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Plasticware
96 poços (polipropileno, fundo plano, transparente).Placas Sigma AldrichM0687
de 96 poços (polipropileno, fundo plano, preto).Tubos Eppendorf Sigma AldrichM9936
1,5 mLEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, estérilThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, EUA.14-488-058
Pipetas Multicanal Thermo Scientific, 8 canais, 125 ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, EUA.  14-387--955
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Software
Gen5 2.01 softwareBiotek, Vermont, EUANA
strong>Nome EmpresaNúmero de catálogoComentários<
strong>Equipamento
Gen5 Leitor de placasBiotek, Vermont, EUANA
. Kit de Ensaio de Colesterol placas de <

Referências

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367(2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87(2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716(2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23(2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342(1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

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