O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

Resumo

Organoides intestinal culturas são estabelecidas de criptas toda e não permitem a análise de auto-renovação e diferenciação em uma célula específica de moda. Este protocolo descreve a reconstituição da haste classificada (Lgr5⁺) e células (Paneth), que dão origem a organoids permitindo sua prévia modificação genética e bioquímica e análise funcional de nicho.

Resumo

O epitélio intestinal é caracterizado por uma taxa extremamente rápida de volume de negócios. Nos mamíferos, o forro epithelial todo se renova dentro de 4-5 dias. Células-tronco adultas intestinais residem no fundo das criptas de Lieberkühn, são afectadas pela expressão do gene Lgr5 e preservar a homeostase através de sua característica alta taxa proliferativa¹. Ao longo do intestino delgado, Lgr5⁺ células-tronco são entremeadas com células secretoras especializadas, chamadas células de Paneth. Células de Paneth secretam compostos antibacterianos (i.e., lisozima e cryptdins/defensinas) e exercem um papel de controlo sobre a flora intestinal. Mais recentemente, foi descoberta uma nova função para as células de Paneth, ou seja, sua capacidade para fornecer suporte de nicho de células-tronco Lgr5⁺ através de vários ligantes chaves como Wnt3, EGF e Dll1².

Quando isolada ex vivo e cultivados na presença de fatores de crescimento específicos e componentes da matriz extracelular, criptas intestinais todo dão origem a long-lived e auto renovar estruturas 3D chamado organoids que muito se assemelham a cripta-vilosidades arquitetura epitelial do intestino delgado adulto³. Organoides culturas, quando estabelecida de toda criptas, permitem o estudo de auto-renovação e diferenciação de nicho de células-tronco intestinal, embora sem abordar a contribuição dos seus componentes individuais, ou seja a Lgr5⁺ e Células de Paneth.

Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o ensaio de organoides que aproveita a capacidade de Paneth e células de Lgr5⁺ para associar e formar organoids quando cultivadas co. Esta abordagem, aqui referida como "ensaio de reconstituição de organoides" (ORA), permite a modificação genética e bioquímica de Paneth ou Lgr5⁺ células-tronco, seguidas por reconstituição em organoids. Como tal, permite a análise funcional dos dois principais componentes do nicho de células-tronco intestinal.

Introdução

O epitélio intestinal é o tecido mais rapidamente auto renovadora no corpo dos mamíferos e, como tal, tem sido objeto de uma infinidade de estudos vista a identificação e caracterização funcional das células-tronco adultas que residem no fundo da cripta de Lieberkühn, afectada pela expressão do gene Lgr5 e dependente de sinais de Wnt canônico¹. Nomeadamente, Lgr5⁺ células-tronco são flanqueadas e suportadas por células especializadas de nicho, ou seja, células de Paneth, que também dependem de sinalização de Wnt para sua maturação². Juntos, esses tipos de duas células subjacentes a auto-renovação do revestimento epitelial intestinal e preservar o equilíbrio homeostático diário: Lgr5⁺ células-tronco rapidamente dividir e dar origem a progenitora e mais especializada intestinal epitelial células; Células de Paneth fornecem factores essenciais de nicho (por exemplo, Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5⁺ tronco células². A capacidade das criptas intestinais quando chapeado ex vivo para formar estruturas organizadas e auto renovadora chamado organoids, ou "minicoragem", tem sido explorada como uma ferramenta experimental para fornecer informações sobre processos de auto-renovação e diferenciação em condições normais e patológicas, incluindo câncer⁴. Organoides culturas se estabeleceram de vários tecidos, incluindo o intestino, pâncreas, fígado e rim, de rato e humanos amostras⁴. O método de extração e os fatores de crescimento, empregados para desenvolver essas culturas organoides são tecido-específica e projetadas para dirigir a diferenciação da linhagem multi e imitar tão perto quanto possível do original nicho de células-tronco in vivo. Organoids pode ter aplicações potenciais, incluindo o tratamento de doenças genéticas, a avaliação da eficácia terapêutica em câncer, a análise de toxicidade da droga ou o estudo da organogênese em vitro⁵.

Em geral, a principal limitação das culturas organoides quando estabelecido a partir de amostras de tecido é uma falta de especificidade celular. Por exemplo, organoids intestinais estabelecidas de criptas toda intestinais não permitem a análise de componentes celulares individuais englobadas dentro da fonte de tecido (por exemplo, toda criptas contêm Lgr5⁺, Paneth, e células progenitoras).

Aqui, descrevemos um método novo, referido como ORA, que combina as vantagens das culturas de organoides intestinal com a análise funcional dos seus componentes mais fundamentais, ou seja, tronco (Lgr5⁺) e células de nicho (Paneth). Isto é conseguido através da capacidade única de Paneth e células de Lgr5⁺ para associar fisicamente uns com os outros quando co incubados e dar origem a organoids^2,6,10. Nós aproveitou-se desse recurso e pre-tratados os tipos de duas células individualmente antes de permitir-lhes reconstituir o organoids. Ao fazer isso, cada componente da célula pode ser exposto a determinada droga, fator de crescimento, inibidor de bioquímica, modificação genética ou tratamento químico antes da reconstituição e formação de organoides. Portanto, usando o ensaio ORA permitirá a determinação de se um tratamento medicamentoso específico ou modificação genética tem um efeito específico sobre as células-tronco ou sua contraparte de nicho.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e leis de bem-estar animal local.

1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos

1. Conjunto de autoclave 1 de intestinal tesoura, tesoura normal e fórceps em recipiente estéril.
2. Coloque um prato de 96 poços (fundo plano) em uma incubadora a 37 ° C.
3. Prepare-se 10 mL de meio de cultura completo com os reagentes listados na tabela de materiais.
4. Incube o meio completo a 37 ° C em banho-maria.
5. Degelo reconstituído a membrana basal, colocando-o em um balde de gelo. A membrana basal reconstituída se tornará líquida a 4 ° C.
6. Encha 4 placas de Petri com frio tampão fosfato-salino ou abreviado PBS (4 ° C).

2. isolamento de pequenas criptas intestinais

1. Sacrifica-se por inalação de CO₂ - eGFP-IRES-CreER^t2 Lgr5mouse sobre um fundo C57BL6/J. Disse o peritônio longitudinalmente com uma tesoura.
2. Segure o estômago com a pinça e cortar transversalmente no meio.
3. Usando a tesoura intestinal de agora em diante, puxe para fora o intestino e colocá-lo em uma placa de Petri contendo PBS.
   Nota: Tesoura Intestinal tem uma acentuada e uma ponta romba. Destina-se a ponta romba dessas tesouras para não danificar a arquitetura da cripta-vilosidades durante a abertura do intestino.
4. Comece colocando a ponta romba para o estômago e empurre suavemente através do piloro. Continue cortando com a tesoura e puxar com a pinça.
5. Uma vez que o intestino delgado inteiro é aberto longitudinalmente, lavá-lo em PBS frio, segurando-o com a pinça e enxaguá-lo suavemente na solução de PBS com movimentos em forma de U.
6. Uma vez que todos os restos de fezes são limpas, proceda a achatar o intestino em uma placa de corte, luminal para cima. O lado luminal é facilmente reconhecível pela ausência de vasos sanguíneos e por sua aparência pálida em comparação com a parte externa.
7. Com uma lâmina de vidro, retire com cuidado as vilosidades raspando o intestino achatado. Execute esta etapa duas vezes ao longo de todo o comprimento do tecido.
8. Corte o intestino com uma lâmina cirúrgica estéril em pedaços de 2 a 5 mm.
9. Coloque os pequenos fragmentos intestinais em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de PBS frio gelo.
10. Limpe os fragmentos de tecido, removendo as impurezas restantes pipetando-los acima e para baixo na PBS. Descartar o sobrenadante e repita este passo até o PBS é completamente claro.
11. Adicione 15 mL PBS frio, para trazer o volume total final de PBS para 25 mL. Adicionar 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 45 min em um rolo em 4 ° C.
12. Descarte o PBS/EDTA.
13. Adicionar 10 mL de PBS e separe as criptas pipetando duramente os fragmentos de tecido acima e para baixo (pelo menos três vezes). Recolha o sobrenadante.
14. Repita a etapa 2.13 quatro vezes. Adicione o meio de cultura para alcançar um volume final de 50 mL.
15. Granule as células por centrifugação (300 x g por 5 min).
16. Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura e as criptas de pelotas por centrifugação (80 x g durante 3 minutos).

3. única célula preparação

1. Descartar o sobrenadante de criptas peletizadas e Resuspenda-los em 1ml tripsina como-enzimas juntamente com 50 µ l DNAse (50 µ g/mL).
2. Incube as células em um banho de água a 32 ° C por 2 min.
3. Adicione 10 mL de meio de cultura. Dissocia as criptas em única células pipetando severamente acima e para baixo pelo menos 5 vezes.
4. Filtrar a solução através de um filtro de 40 µm (para eliminar grumos e outras impurezas) e as células única a 300 x g por 5 min de Pelotas.

4. chapeamento e citometria de fluxo

1. Prepare-se 50 mL de solução salina tamponada de 1 x Hank ou HBSS/2% solução de soro (FCS) de vaca fetal e resuspenda o pellet em 1 mL para cada 10⁶ células
2. Adicione à suspensão de células Lin BV421^– (CD31, CD45, TER119) na concentração de 1: 100 e CD24-APC e CD117-PE os dois em uma concentração de 1: 250 anticorpos durante 30 min.
3. Tipo Lgr5⁺ células-tronco e células de Paneth em baixa separada ligam os tubos. Para obter detalhes sobre a classificação de protocolos para Lgr5⁺ e células de Paneth, consulte Roth et al . ⁷ e. Schewe et al ⁶
   1. Centrifugar as células classificadas a 300 x g durante 5 min. Ressuspender as células em meio de 100 µ l com os componentes descritos como em 1.3 (consulte a Tabela de materiais).
4. (Por exemplo, por modificação genética ou química) tratar as células de Paneth (n = 2000) ou as células-tronco Lgr5⁺ (n = 2000).
   1. Para tratar as células, usar 5 µ l de reagente de transfeccao lipossoma-mediada em um volume total de 100 µ l meio de cultura e RNA de interferência pequeno (siRNA) na concentração de 100 nM. Incube durante 30 min a 37 ° C para siRNA ou durante o tempo necessário para a modificação escolhida.
5. Lave as células duas vezes em meio de cultura 500 µ l.
6. Centrifugar a 300 x g por 5 min e ressuspender as células em meio de cultura 10 µ l.
7. Os dois componentes celulares da piscina (Paneth ou Lgr5⁺ células) em um 20 µ l volume total e centrifugar 300 x g por 5 min à RT
8. Co Incubar o Paneth e células de Lgr5⁺ por 10 min a RT
9. Remover 10 µ l do sobrenadante e deixar um menisco do líquido para ter certeza de não aspirar o centrifugado.
10. Adicionar 30 µ l de leite reconstituído da membrana basal das células para um volume total de 40 µ l, Ressuspender as células e a placa em uma placa bem 96 previamente aquecido. Depois de 10 min, adicionar 200 µ l de meio completo (veja a Tabela de materiais). Médio de mudança cada 48 h.
11. Multiplicidade de organoides contagem no dia 5.

Resultados

O ensaio de reconstituição de organoides permite a análise funcional separada dos componentes essenciais da ameia e células-tronco do epitélio intestinal, aqui demonstrado pelo RNA de interferência pequeno (siRNA) do gene Apc .

Para atingir este objectivo, primeiro utilizamos o fluorescente ativado celular classificação (FACS) para separar puras camundongos C57BL6/J 8000 Lgr5⁺ de células e 6000 célul...

Discussão

O ORA permite a análise funcional refinada dos dois componentes essenciais de nicho de células-tronco intestinal, ou seja, Lgr5⁺ e células de Paneth. Esta abordagem tem sido empregada anteriormente por nós e outros, com pequenas modificações,^6,10,11. Aqui, apresentamos o procedimento ORA como um protocolo do laboratório reproduzíveis e padronizada. Além disso, relatamos sobre os efeitos da Apc downre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Concentração final: 10 mM
Penicilina/estreptomicina *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Concentração final: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Concentração final: 10 mM
EGF murino recombinante *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Concentração final: 50 ng/ml
Noggin murino recombinante *	Peprotech	250-38	Concentração final: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Concentração final: 10 µ M
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Concentração final: 1 µ M
R-espondina murina recombinante *	R& D systems	3474-RS-050	Concentração final: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Concentração final: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Tubos de baixa ligação	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* A combinação desses reagentes constitui o meio

102424 de cultura completo