Grande Volume, iluminação comportamentalmente relevantes para Optogenetics em primatas não-humanos

Resumo

Um protocolo para construir um iluminador penetrante de tecido para entregar a luz sobre grandes volumes com diâmetro mínimo é apresentado.

Resumo

Este protocolo descreve um iluminador de grande volume, que foi desenvolvido para manipulações de optogenetic do cérebro de primatas não humanos. O iluminador é uma fibra óptica de plástico modificada com ponta gravada, tal que a área de superfície de emissores de luz é > 100 x de uma fibra convencional. Além de descrever a construção do iluminador de grande volume, este protocolo detalha a calibração de controle de qualidade usada para assegurar a distribuição de luz mesmo. Além disso, este protocolo descreve técnicas para inserir e retirar o iluminador de grande volume. Estruturas superficiais e profundas podem ser iluminadas. Este iluminador de grande volume não precisa ser fisicamente acoplado a um eletrodo, e porque o iluminador é feito de plástico, vidro, não, ele simplesmente se curvará em circunstâncias quando destruía tradicionais fibras ópticas. Porque este iluminador oferece luz sobre volumes de tecido comportamentalmente relevantes (≈ 10 mm³) sem dano de penetração maior do que uma fibra óptica convencional, ele facilita estudos comportamentais usando optogenetics em primatas não-humanos.

Introdução

Ferramentas de Optogenetic, que permitem controle neuronal milissegundo de precisão, luz-driven são amplamente utilizadas para estudar a fisiologia funcional e comportamento em roedores e invertebrados. No entanto, os desafios técnicos limitaram-se a utilização de optogenetics no cérebro de primatas não humanos, que tem um volume de ~ 100 x maior do que o cérebro de roedor ¹.

Para facilitar estudos de optogenetics em primatas não-humanos, um iluminador foi projetado para atender a dois objetivos concorrentes: iluminação de grande volume e dano mínimo de penetração. Tentativas anteriores de endereço dentre estas preocupações vir no cara do outro. Feixes de fibras iluminar volumes maiores, mas com diâmetro maior e, assim, danos^2,3. Fibras de vidro cônico reduzem danos de penetração, mas por pouco o foco de luz emitindo áreas de superfície < 100 µm^{2 4,5}. Iluminação externa do cérebro através de uma janela na dura-máter contorna o desafio dos danos de penetração e pode permitir a iluminação de grande volume, mas ele só pode ser usado para algumas áreas de cérebro superficial⁶.

Para criar um iluminador de grande volume, pequeno diâmetro (Figura 1a), a ponta de um plástico óptico de fibra é calor afilado e o núcleo e o revestimento são gravadas (Figura 1bc). Ao contrário de outras fibras afiladas que focam a luz para um ponto estreito, a gravura permite que a luz uniformemente escapar para fora dos lados da ponta, assim, distribuir luz amplamente sobre uma grande área (Figura 1 de). Porque o dano de penetração é proporcional ao diâmetro de penetração, este iluminador não tem nenhum dano de penetração mais do que uma fibra convencional, ainda tem > 100 x a luz emitindo luz superfície de área e oferece mais amplamente com 1/100 o poder da luz densidade em um cérebro fantasma (1,75% do agarose) (Figura 1e). Um modelo de Monte Carlo (Figura 1f) ilustra a diferença na propagação de luz entre uma fibra convencional e o iluminador de grande volume, quando eles têm densidades de energia de luz igual como sua superfícies de emissores de luz. Cada iluminador é calibrado individualmente usando uma esfera de Ulbricht (Figura 2a, b) para assegurar a distribuição de luz até ao longo da ponta (Figura 2C).

Este iluminador de grande volume foi validado com manipulação de optogenetic de comportamento e de disparo neuronal em primatas não-humanos. O comprimento da ponta de fibra pode ser personalizado para qualquer área do cérebro e mapa de campo receptivo individual de cada animal. O iluminador pode ser emparelhado com um eletrodo penetrante para gravações neuronais que abrangem o período de iluminação. Além disso, porque a fibra pode carregar qualquer cor de luz visível, pode ser emparelhado com qualquer das moléculas optogenetic disponível disponíveis.

Protocolo

Nota: todos os procedimentos de animais estavam em conformidade com as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Instituto Massachusetts de tecnologia Comissão no cuidado Animal.

1. fabricação de iluminador

1. usar um par de tesouras afiadas para cortar uma parte de 250 µm de diâmetro plástico fibra óptica que é maior que o comprimento desejado iluminador total pelo menos 10 cm.
2. Remover de revestimento de polietileno de 15-20 cm de uma extremidade da fibra óptica plástica usando um descascador de fios de 22 calibre.
3. Segura o distal mais 3-5 cm da extremidade despojada da fibra em uma pinça de torno tabela.
4. Estique encamisada final da fibra em uma mão com uma tração constante constante. A fibra deve estar paralela ao chão, perpendicular aos narcóticos. Manter esta tensão constante sobre a fibra ao longo de aquecimento e arrefecimento (etapas 1.5 e 1.6 abaixo) para que a fibra permanece reta e tenso como ele dilui.
5. Usando a configuração mais baixa de um soprador térmico de temperatura duplo (1.000/570 ° F), aqueça a seção despojada da fibra até que é diluída com um diâmetro de 60-100 μm, ou sobre o diâmetro de um cabelo humano.
6. Manter a tensão constante sobre a fibra, permitindo que a fibra esfriar. Para manter a tensão pode causar a fibra encaracolar.
7. Confirmar o diâmetro da ponta diluído sob um microscópio de dissecação. Como alternativa, pode utilizar pinças em vez disso.
   1. Se a fibra não é fina o suficiente, repita as etapas de 1.4 com 1.6 conforme necessário para atingir o diâmetro desejado dica.
   2. Opcional se re-puxar, colocar a uma pequena marca na parte mais estreita da fibra se ele será aquecido novamente para que o centro da arma calor destina-se a parte mais estreita da fibra.
   3. Se a fibra é muito fina, começar de novo.
8. Uma vez que a fibra completo esfriou e o diâmetro desejado foi alcançado, belisque a fibra 3 cm do ponto mais estreito em ambos os lados. Com uma rápida, afiada puxe ao longo do eixo da fibra, separar os lados para criar uma ponta afunilada.
9. Examinar a ponta cónica sob uma baixa potência (por exemplo, 4 X) em microscópio de dissecação. Se a ponta é bifurcada ou enrolada ( Figura 1f), descartar a fibra.
10. Preparar-se para o etch a ponta cónica, colocando um pedaço de fita de laboratório perto do fim da ponta, deixando o último 5 mm exposto. A fita protege a fibra da gravura acima o comprimento desejado da emissão de luz. Este comprimento da ponta foi selecionado com base na espessura do córtex do primata na região de destino. Um comprimento mais longo ou mais curto pode ser exposto dependendo o comprimento desejado da iluminação. Se for desejado um etch diferentes comprimento de ponta, a borda da fita laboratório pode ser movida mais perto para ou longe a ponta cónica.
11. Dobre um quadrado pequeno (~ 1 polegadas x 2 polegadas) de 5 μm folha de polimento de carboneto de silício entre o polegar e o indicador. Colocar a ponta da fibra entre os dois lados da folha de polimento e etch suavemente a fibra com pequenos movimentos circulares, como se um BB de rolamento entre o polegar e o indicador. Frequentemente rode a fibra para todos os lados estão gravados uniformemente. A ponta de fibra aparecerá “ áspera ” a olho nu em áreas que têm sido gravadas, enquanto áreas un-gravadas normalmente aparecem suaves.
12. Repita o passo 1.11 com um óxido de alumínio de 3 μm lapidação folha.
13. Apor um conector na extremidade do iluminador oposta à ponta entalhada. Isso permite que o iluminador para se conectar a um cabo ótico ou a laser.
    Nota: Esse método difere do método preferencial para fixação de vidro / fibra óptica de sílica em virolas. Porque a virola de metal é mais difícil do que a fibra óptica plástica, polimento da fibra e a virola como uma unidade após colagem pode danificar a fibra óptica plástica como minúsculos fragmentos de metal produzido durante o processo de polimento pode incorporar-se em fibra apartamento fendida.
    1. Remover cerca de 5 mm do revestimento de polietileno da extremidade oposta do iluminador usando um descascador de fios de 22 calibre.
    2. Corte a extremidade oposta plana, com uma faca quente para suavizar a superfície.
    3. Polonês a extremidade oposta apartamento com lapidação sucessivamente mais finas folhas: 5 µm, 3 μm, 1 μm e 0,3 µm.
    4. Inserir o apartamento em frente ao final em uma virola de aço inoxidável de diâmetro interno de 260 µm até que ela esteja alinhada com o fim do ferrolho.
    5. Confirmar visualmente que a extremidade oposta é suave e uniformemente polida com um microscópio de fibra.
    6. Remover a fibra do ferrolho e a virola verticalmente sobre a borda de uma mesa de fita com a fibra apontando para baixo.
    7. Encher uma seringa de 1 mL com epóxi de plástico e coloque uma agulha de 18 calibre contundente a seringa.
    8. Use a agulha para aplicar epóxi para baixo para a virola. Encha o ferrolho completamente com epóxi.
    9. Inserir a fibra a virola.
    10. Limpe qualquer excesso da cola epoxy da superfície polida da fibra com uma limpeza toalhetes molhada antes da secagem, se necessário. Caso contrário, o epóxi em excesso pode ser removido após 12-24 h.
    11. Armazenar a fibra suavemente até a calibração e coloque uma capa de pó sobre o ferrolho.

2. Iluminador de calibração e controle de qualidade

Nota: esses métodos para calibração avaliar para luz de saída não-linearidade a diferentes distâncias da ponta da fibra. Distribuição desigual de luz normalmente resulta de uma “ acidentada ” ou “ ondulado ” do atarraxamento.

Diafragma

1. criar uma blindagem leve para a parte superior da integração esfera usando luz absorvente da folha ( Figura 2).
   Nota: Use luvas sempre que a manipulação de luz absorvendo a folha para evitar pele óleos criando manchas refletindo luz.
   1. Dobra por 2 ” por 4 ” pedaço de luz absorvendo da folha sobre si mesmo para formar um 2 ” x 2 ” praça. um método alternativo é cortar um 2 ” x 2 ” praça com uma absorção de lado e um luz refletindo o lado (ou seja, um lado da folha de alumínio padrão); no entanto, o método dobrável é mais seguro porque fornece uma incômoda ponta para manipulação do diafragma na próxima etapa.
   2. Dobre a fita de laboratório ou fita isolante ao longo das bordas do quadrado para vincular as arestas não-dobrado. Isto tanto une os lados e protege contra cortes de arestas.
   3. Perfurar um buraco no centro da Praça, usando uma agulha de 26 calibre.
   4. Remover o parafuso grande na tampa da esfera integradora e cobrir a abertura com o diafragma. Coloque o orifício sobre o centro. Se o diafragma foi criado com uma luz absorvente e uma luz refletindo o lado, coloque o lado de absorção acima e a luz refletindo o lado para baixo, voltados para dentro da esfera de integração.
      Nota: Para impedir a poeira e detritos entre a esfera de Ulbricht e para manter o furo centralizado, seguro o diafragma para fora da esfera integradora com fita de lab.
2. Medida luz de saída ao longo da ponta em 500 µm incrementos usando um micromanipulador ou braço estereotáxica e uma esfera de Ulbricht.
   Nota: Óculos de segurança, de comprimento de onda apropriado devem ser usados sempre que o laser está na.
   1. Conectar a extremidade oposta da fibra a um laser ou a luz da fonte, mas não acionam luz saída ainda.
   2. Segura o iluminador para um titular estereotáxica (preferably com fita de laboratório) com a ponta de 7-10 mm abaixo da parte inferior do suporte.
   3. Parafuso o titular estereotáxica para o braço estereotáxica
   4. Alinhe a ponta do iluminador com o buraco no centro do diafragma. Zero o micromanipulador quando a ponta é a exata mesmo nível como o diafragma.
   5. Ligar desligar as luzes da sala e zero a esfera de Ulbricht.
   6. Disparar o laser (ou outra fonte de luz) e medir a potência de luz total de saída usando a esfera de Ulbricht.
      Nota: Usar a saída de luz mais baixa possível para calibração teste.
   7. Baixar a fibra 500 µm até integrando esfera e repita etapa 2.2.6.
   8. Continuar reduzindo a fibra na esfera integradora e medir a saída de luz total em incrementos de 500 µm até a folga de níveis de potência luminosa total
      Atenção: Potência total de luz deve estabilizar uma vez que a ponta inteira está na esfera. Não continue a diminuir a fibra mais de 1-2 mm além do gravado ponta de comprimento. Se a ponta em contato com a parte inferior da esfera de integração, pode derreter e/ou estragar a esfera de Ulbricht.
3. Confirmar uma fibra uniformemente gravada por plotagem total poder luz de saída como uma função da distância da fibra foi reduzida para a esfera de integração para confirmar a linearidade.

3. iluminação na Vivo

Nota: aqui, esses métodos são mostrados usando um modelo de plástico ao invés de um primata não humano.

1. Implante uma câmara de gravação de 25 mm de diâmetro foi implantada sobre a área do cérebro de interesse antes da experimentação.
2. Executar anatômica ressonância magnética (MRI) antes da experimentação. Coloque uma grade de gravação personalizada na câmara e preenchê-lo com um lubrificante cirúrgico estéril para permitir a visualização de grade e determinação do nível das estruturas cerebrais dura-máter e alvo.
3. Preparar uma torre microunidade antes de cada sessão de teste.
   1. Apor um 25 calibre tubo de guia com ponta chanfrada para o meio e inferior grampos na unidade. Dois grampos são usados para garantir que o tubo de guia permanece reta. Ambos estes grampos podem ser movidos manualmente, se desejado.
      Nota: O tubo de guia pode ser epoxied ou soldado para as pinças.
   2. Segura o iluminador de grande volume na braçadeira superior na mesma unidade. Essa pinça é anexada para o motor.
   3. o iluminador de grande volume através do tubo de guia da linha totalmente e confirmar que a ponta do iluminador ultrapassa a ponta do tubo guia.
      Nota: O comprimento do iluminador que estende passado a ponta do tubo guia é igual a distância entre a dura-máter para a margem inferior da região alvo do cérebro, como determinado através de MRI.
   4. Mergulhe o tubo guia e iluminador em solução anti-séptica (por exemplo, chlorohexidine) para esterilizar.
4. Colocar uma grade Personalizada esterilizada dentro da câmara limpa e fixá-lo em uma orientação predeterminada com um parafuso na parte lateral da câmara. A grade mostrada aqui tem espaçamento de 1 mm; no entanto, o espaçamento pode ser personalizado conforme necessário.
   Nota: Isto deve ser idêntico para a grade e a orientação usada no MRI anatómico.
5. Segura o titular microunidade estereotáxico na câmara de gravação em uma orientação pré-determinada.
6. Retrair o iluminador esterilizado do tubo guia puxando o iluminador usando pinça estéril, sem corte. A ponta do iluminador deve ser de 5-10 mm acima da ponta do tubo guia.
   Nota: O iluminador se curvará para fora entre o tubo de guia e a pinça. Isto não danificará o iluminador flexível.
7. Apor a microunidade para o titular e colocar o tubo de guia no orifício de grade alvo.
8. Baixar o estágio micro-drive até o tubo de guia é apenas através do nível da dura-máter.
   Nota: Se desejado, uma segunda unidade de micro com um eletrodo pode ser colocada no palco e abaixada no buraco grade diferente. O campo local potencial sobre este eletrodo mostrará um artefato luz dependente da distância, que pode ser usado para confirmar a colocação do iluminador.
9. Tentativa menor o iluminador manualmente com Pinças esterilizadas.
   1. Se houver alguma resistência, retrair o iluminador 5 - 10 milímetros, esperar 10 minutos para permitir que o tecido se estabelecer e tente novamente.
   2. Se ainda houver resistência na segunda tentativa, recolher a dica do iluminador dentro do tubo guia, baixo o guia tubo de 0,25 mm e tente novamente.
   3. Repetir até os slides iluminador através do tubo de guia sem qualquer resistência.
   4. Baixar o iluminador até é tenso.
      Atenção: Não empurre o iluminador com força contra uma resistência. Nestes casos o tubo guia normalmente não penetrou a dura-máter totalmente. A fibra a empurrar com força fará com que a dobrar-se sobre si mesmo, impedindo que a fibra de entrar no cérebro e possivelmente destruindo a ponta ( Figura 1G).
10. Se conectem a virola no extremo oposto o iluminador a maior óptica configurar ou laser.
11. , Certifique-se de que nenhuma luz é visível para os primatas não humanos.
    1. Use blindagem opacas ou folha para abranger totalmente as gravação torres de absorção de luz.
    2. Coloque todas as conexões ópticas em envelopes blindados feitos de luz, absorvendo folha.
    3. Proteger todos os cabos de remendo com qualquer luz absorvendo a folha ou fita isolante preta.
    4. Como uma precaução extra, coloque um banco do diodo emissor de luz (LED) de isca da mesma cor luz usado no experimento para trás os primatas não humanos e os LEDs pisquem continuamente a 2,5 Hz. Isto impede que os olhos totalmente ajustando à escuridão. Se houvesse Vazamento de luz inadvertido, esta luz piscando ajudaria a evitar o vazamento de servir como um gatilho comportamental.

Resultados

A iluminação dos volumes de cérebro grande em primatas não-humanos permite manipulação optogenetic comportamentalmente relevantes. Et al . Acker (2016) usado este iluminador de grande volume com o Halorhodopsin avermelhado, Jaws ⁷ para estudar a contribuição temporal do campo de olho frontal (FEF) para memória guiadas sacadas em dois macacos rhesus. Especificamente, FEF neurônios foram injetados com um vetor viral contendo garras e depois iluminados com luz vermelha-usando o iluminador de...

Discussão

Enquanto optogenetic ferramentas são amplamente utilizadas para estudar a doença e fisiologia em roedores, o desafio técnico de volumes de cérebro grande iluminante limitou o uso de optogenetics em primatas não-humanos. Pioneira estudos em macacos usadas densidades de grande poder de luz (~ 100 mW/mm² a 20 W/mm²) para iluminar a volumes pequenos, talvez < 1 mm³e relatados efeitos comportamentais modestos com opsins excitatórios no córtex^4,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fibra óptica plástica	Fibra óptica industrial	SK-10	250 mícrons de diâmetro, linha Super Eska
Decapador de fios	Klein Tools	11047	22 gauge
Vise Clamp	Wilton	11104	Braçadeira de torno de montagem de mesa genérica
Pistola de calor de temperatura dupla	Milwaukee	8975-6	570 / 1.000 ° F
Marcador de laboratório	VWR	52877
Microscópio de dissecação	VistaVision	82027-156	Microscópio estéreo com luz incandescente dupla, ampliação de 2X/4X, disponível na VWR
Fita de laboratório	VWR	89097-972	Pacote de 4 de cor violeta; no entanto, a cor da fita não importa
Folha de lapidação de carboneto de silício	ThorLabs	LF5P	grão de 5 mícrons, pacote com 10
Folha de lapidação de óxido de alumínio	ThorLabs	LF3P	Grão de 3 mícrons, pacote de 10
Folha de lapidação de óxido de alumínio	ThorLabs	LF1P	Grão de 1 mícron, pacote de 10
Folha de lapidação de alumina calcinada	ThorLabs	LF03P	Grão de 0,3 mícron, pacote de 10
Faca quente	Fibra óptica industrial	IF370012	60 Watt, escopo
	de inspeção de fibra pesadaThorLabs	FS201	opcional
Virola de aço inoxidável	Fibra óptica de precisão	MM-FER2003SS-265	265 mícrons de diâmetro interno
mL seringa	BD	14-823-30	A ponta Luer-lok é preferível para reduzir o risco de vazamento, mas não é estritamente necessária
Fibra óptica	industrial epóxi plástica	40 0005
agulha romba de calibre 18	BD	305180	Comprimento de 1,5 polegada
Limpeza sem fiapos (KimWipe)	ThorLabs	KW32	disponível de muitos fornecedores
Folha absorvente de luz	ThorLabs	BKF12
Fita isolante	3M	Temflex 1700	Opcional, pode substituir outras marcas / modelos
Agulha afiada de 26 gauge	BD	305111	Micromanipulador de 0,5 polegada de comprimento
	Siskiyou	70750000E	pode substituir outras marcas/modelos
Braço Steretactic	Kopf	1460	pode substituir outras marcas/modelos
Óculos de segurança a laser	KenTeK	KCM-6012	devem ser selecionados com base na cor do laser usado, exemplo dado aqui
Laser ou outra fonte de luz	vortran	Stradus 473-50	exemplo de laser azul
Esfera de integração	ThorLabs	S142C	Medidor de potência acoplado, também disponível na ThorLabs, item #PM100D
Câmara de gravação Ultem	Empresa de instrumentos Crist	6-ICO-J0	Personalizado com entalhe de alinhamento
Microdrive em torre com braçadeiras	NAN	DRTBL-CMS
Tubo guia	Personalizado	N/A	Feito de agulha espinhal de calibre 25 (BD) ou tubo rombudo
Sistema de driver NAN	NAN	NANDrive
Design de grade personalizado		personalizados	disponíveis mediante solicitação
Pinça sem corte	FischerScientific	08-875-8A	pinça sem corte de aço inoxidável genérico
Pinças digitais	Neiko	01407A	Disponível em amazon.com. Pode selecionar um paquímetro de resolução mais fina para medições mais precisas.
Cabo de conexão	ThorLabs	FG200LCC-personalizado	Este é um exemplo de muitos cabos de conexão possíveis. Contanto que o diâmetro da fibra seja menor ou igual ao diâmetro da fibra do iluminador de grande volume e desde que os conectores façam interface, qualquer patch cable (vidro ou plástico, comprado pelo fornecedor ou fabricado no laboratório) é adequado para esta aplicação.
Tampas de poeira de plástico transparente	ThorLabs	CAPF	Pacote de 25
mangas de acoplamento divididas em cerâmica	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S