Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Summary

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Abstract

O ensaio de metástase pulmonar (PuMA) é um ex vivo explante de pulmão e o sistema de cultura de célula fechada que permite aos pesquisadores estudar a biologia da colonização de pulmão no osteossarcoma (OS) por microscopia de fluorescência. Este artigo fornece uma descrição detalhada do protocolo e discute exemplos de obtenção de dados de imagem em crescimento metastático usando widefield ou plataformas de microscopia de fluorescência confocal. A flexibilidade do modelo PuMA permite que os pesquisadores a estudar não só o crescimento de células do sistema operacional no microambiente do pulmão, mas também para avaliar os efeitos da terapêutica antimetastático ao longo do tempo. Microscopia confocal permite sem precedentes, de alta resolução de imagem de interações de celular so com o parênquima pulmonar. Além disso, quando o modelo de PuMA é combinado com corantes fluorescentes ou repórteres genética de proteína fluorescente, pesquisadores podem estudar o microambiente pulmonar, estruturas celulares e subcelulares, função do gene e atividade de promotor em células metastáticas do sistema operacional. O modelo da PuMA oferece uma nova ferramenta para investigadores de osteossarcoma descobrir a nova biologia metástase e avaliar a atividade da novela terapias anti metastáticas, direcionadas.

Introduction

Melhorado os resultados para pacientes pediátricos com metástase osteossarcoma (OS) continua a ser uma necessidade crítica de clínicas atendidas ¹. Isto ressalta a importância do desenvolvimento de novas terapias de alvo molecular. Chemotherapeutics convencional que a proliferação de células de tumor alvo não provaram para ser eficazes no tratamento da doença metastática e, assim, novas estratégias deve direcionar o próprio processo metastático ². O atual artigo aborda os aspectos práticos de um tipo relativamente novo de ex vivo modelo metástase do pulmão, o ensaio de metástase pulmonar (PuMA) desenvolvido por ....

Protocol

Todos os protocolos de animais, dos quais foram obtidos dados de imagem foram realizados com a aprovação do cuidado Animal e Comissão de uso do Instituto Nacional do câncer, os institutos nacionais de saúde. Todos os animais protocolos discutidos e retratado no artigo vídeo foram aprovados pelo Comitê de cuidados animais Universidade da Colúmbia Britânica.

1. preparação de células tumorais para injeção e materiais para o modelo PuMA

Nota: A quantidade de células e soluções será suficiente para 1 rato. Aumenta conforme necessário se mais ratos são usados no estudo. Para receitas de mídia, consulte a tabela 1....

Results

Microscopia de fluorescência widefield Low-ampliação

Para microscopia de fluorescência widefield de fatias de pulmão PuMA, imagens representativas e quantificação de dados é mostradas na Figura 2e Figura 4A e B. As propensões metastáticos para linhas de alta e baixa metastático célula são visualmente aparentes sobre pontos de t.......

Discussion

O seguinte artigo técnico descreve alguns aspectos práticos do modelo PuMA em estudar a colonização de pulmão no sistema operacional. Alguns passos críticos no protocolo onde pesquisadores devem tomar cuidado extra incluem o seguinte:

a) canulação da traqueia. A traqueia pode ser facilmente danificada enquanto dissecando o circundante do músculo e do tecido conjuntivo. Além disso, a agulha do cateter pode facilmente ser empurrada através da traqueia. Preste atenção a como o bisel da agulha pen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabela 2
Reagentes de cultura de células para A-media, B-media e meio completo
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	linha celular OS altamente metastática
HOS	ATCC	CRL-1543	linha celular OS pouco metastática
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)	celular OS altamente metastática N	/ A
MG63	ATCC	CRL-1427	linha celular OS mal metastática
10X M199 mídia	Thermofisher	11825015	Mídia de base para mídia A e mídia B
Água destilada (esterilizada)	Thermofisher	15230-147	Componente de mídia A e B-media
7,5% solução de bicarbonato de sódio	Thermofisher	25080094	Componente de A-media & B-media
Hydrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Componente de A-media & B-media
Acetato-água de retinol solúvel	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Componente de A-media & B-media
Penicilina/Estreptomicina 10X solução concentrada (10000 U/ml)	Thermofisher	15140122	Componente de A-media & B-mídia, mídia completa.
Solução de insulina bovina (10mg / ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Componente de A-media & Meio B
DMEM, alto teor de glicose	Thermofisher	11965092	Meio de base do meio completo
L-glutamina (200 mM)	Thermofisher	25030081	Componente do meio completo
Soro fetal bovino	Thermofisher	16000044	Componente do meio completo
Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline	Thermofisher	14190144	Usado em cultura de células.
Hank' s Solução de sais tamponados, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol	Thermofisher	14175095	Usado para ressuspender o pellet celular antes da injeção
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Thermofisher	25200114	Usado em cultura de células.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Usado para marcar o parênquima pulmonar.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tabela 3
Materiais para PuMA
Zeiss 710 Confocal	LSM Zeiss	N/A	Vertical LSM Confocal microscópio
Zeiss 780 LSM Confocal	Zeiss	N/A	Microscópio confocal LSM invertido
Camundongos SCID	Charles River	N/A	NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, mulher, idade 6-8 semanas
Aparelho GelFoam	Harvard	59-9863	Usado como suporte para seções de tecido pulmonar.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Usado durante a insuflação do pulmão.
Seringa de 1 ml com agulha de calibre 27	Fisherscientific	14-826-87	Usada para injeção na veia da cauda.
Seringa de 10 ml	BD	309604	Usada para insuflação do pulmão.
Cateter de calibre 20	Terumo	SR-OX2032CA	Usado durante a insuflação do pulmão.
Conjunto de extensão Abbott IV (30", Estéril)	Medisca	8342	Usado durante a insuflação do pulmão.
Cotonetes com álcool	BD	326895	Para limpar a veia da cauda antes da injeção
Luvas cirúrgicas estéreis	Fisherscientific	Varia com o tamanho	Manuseio ascético de pulmões de camundongo
Régua de 30 cm	Grampos		Usado para insuflação do pulmão.
Suporte para régua	Pipette.com	HS29022A	Usado para insuflação do pulmão.
Placa de cultura com fundo de vidro de 35 mm	Ibidi	81158	Utilizada durante a obtenção de imagens de fatias pulmonares
Almofadas absorventes com barreira de humidade à prova de água	VWR	56617-014	Utilizada para revestir a área de trabalho estéril na capa biológica.
Sutura Absorvível Catgut Plain	Braun	N/A	Usado para amarrar a traqueia canulada.
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Tabela 4
Instrumentos cirúrgicos para PuMA
Micro Tesoura de Dissecação 3.5" Reta Afiada	Afiada Roboz	RS-5910	Para cortar seções pulmonares
de 4" (10 cm) Ponta Extra Delicada Longa Serrilhada Reta 0.5mm Roboz		RS-5132	Para manipular/segurar seções pulmonares.
4" (10 cm) Curva ligeira serrilhada longa 0.8mm Ponta	Roboz	RS5135	Para manipular/guardar seções pulmonares.
Pinça de Curativo de Polegar; Serrilhada; Delicado; 4,5" de comprimento; Largura da ponta de 1,3 mm	Roboz	RS-8120	Para dissecção geral.
Pinça de Curativo de Polegar 4.5" Serrilhada 2.2 mm Largura da Ponta	Roboz	RS-8100	Para dissecção geral.
Tesoura de Dissecação Micro Extra Fina 3.5" Reta Afiada/Afiada, lâmina de 20mm	Roboz	RS-5880	Para dissecação geral.
Tesoura Knapp; Reto; Afiado-contundente; Comprimento da lâmina de 27mm; 4" Comprimento Total	Roboz	RS-5960	Para dissecção geral.