Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

Resumo

Este protocolo serve como um esquema para a criação de um sistema funcional de Tet-ON em linhas de células de câncer e sua utilização posterior, em especial para estudar o papel das proteínas derivado de células de tumor no recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do tumor.

Resumo

siRNA e mediada por shRNA derrubar métodos (KD), de regular a expressão gênica são ferramentas inestimáveis para compreender a função do gene e proteína. No entanto, no caso que o KD da proteína de interesse tem um efeito letal sobre as células ou o efeito esperado o KD é dependente do tempo, incondicionais métodos KD não são adequados. Sistemas condicionais são mais adequados nestes casos e têm sido alvo de muito interesse. Estes incluem sistemas de superexpressão isoinokosterone-inducible, de sistema de indução do citocromo P-450¹, e a tetraciclina regulada sistemas de expressão do gene.

O sistema de expressão de gene de tetraciclina regulada permite controle reversível sobre a expressão da proteína por indução da expressão de shRNA na presença de tetraciclina. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental usando o sistema funcional de Tet-ON em linhas de células cancerosas humanas para condicional regulação da expressão génica. Então, vamos mostrar o uso deste sistema no estudo da interação célula-monócito de tumor.

Introdução

Tumor associado os macrófagos (TAMs) contribuam para o desenvolvimento de tumor, promovendo o crescimento do tumor, metástase e regulação da resposta imune². As células cancerosas recruta monócitos inflamatória, que se infiltrar o tumor e se diferenciar em pro-oncogenicidade TAMs³. Infiltração do tumor com TAMs correlaciona-se com resultado clínico ruim e tem sido associada à função imunossupressora de macrófagos^4,5. No entanto, os mecanismos de recrutamento de macrófagos para o tumor não são bem explorados e uma melhor compreensão das vias envolvidas é crucial p....

Protocolo

A seção de protocolo que usa monócitos humanos obtidos de voluntários sadios segue as diretrizes do Hospital Los Angeles humano pesquisa Comitê das crianças de ética e foi aprovada pelo Conselho de revisão institucional sob o Material humano Número do protocolo: ICC 08-00208.

1. preparação de linhas de células de câncer com tetraciclina-regulado shRNA expressão

1. Clonagem de shRNA PAI-1 em vetor Tet-pLKO-puro ^{8 , 9}
   1. Projeto oligómeros de shRNA que contêm a idadeque eu e o EcoRI clivagem site na extremidade 5', a sequência de sentido,....

Resultados

Três sequências de shRNA foram testadas para KD mais eficiente de PAI-1. Por isso, sequências de shRNA contra PAI-1 e ovos mexidos (tabela 1) foram clonadas em vetor de expressão Tet-pLKO-puro seguindo o protocolo descrito acima. A linha de celular HT-1080 Fibrossarcoma foi estàvel transfected com construções geradas e as células foram tratadas com doxiciclina por 3 dias. A expressão de PAI-1 foi verificada pela mancha de (Figura 2A

Discussão

Composto por uma variedade de tipos de células, o TME é crucial para o desenvolvimento de câncer. Para verificar as condições ideais de crescimento, as células cancerosas atraem monócitos através da secreção de Fatores Quimiotáticos. Aqui nós apresentamos um protocolo para o estudo do mecanismo de recrutamento de monócitos por tumor células em vitro. Para este efeito, uma combinação do sistema de expressão de gene inducible, purificação de monócitos humanos primários e como um exemplo de um ensaio de migração, o.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vetor lentiviral Tet-pLKO-puro	Addgene	21915
FBS (sem tetraciclina)	Omega Scientific	FB-15
Histopaque	Sigma	10771-500ML
EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanos	StemCell	19059
EasySep Magnet	StemCell	18002
EcoRI HF	NEB	R3101S
AgeI HF	NEB	R3552S
Cut Smart buffer	NEB	B7200S
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
PROMEGA Wizard SV Gel e PCR	de Limpeza PROMEGA	A9281
psPAX vetor	Addgene	12260
pMD2.G vetor	Addgene	12259
One Shot Stbl3 Quimicamente Competente E. coli	Thermo Fisher Scientific	C737303
Conjunto de coloração Hema 3 para coloração Wright-Giemsa Protocolo		123-869
Células HEK293	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
XhoI enzima de restrição	NEB	R0146S
Ligase	NEB	M0202S
Tampão ligase	NEB	M0202S
EDTA 0,5 M solução	Thermo Fisher Scientific	R1021
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668019
The Big Easy" EasySep Magnet	Stem Cell	18001
0,1% Solução de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920
Acetato de Sódio	Sigma-Aldrich	S7670
Butirato de Sódio	Sigma-Aldrich	B5887
0.45 μ Filtros de seringa M	VWR International	28145-479
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881-500g
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	Invitrogen	15504-020
Cloreto de sódio(NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653-5 kg
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-100g
ditioeritritol (DTE)	Sigma-Aldrich	B8255-5g
etanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	792780
triptona	Amresco	J859-500g
extrato de levedura	Fluka	70161-500g
Ágar Bacto	BD	214010
ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393-5g
Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM)	Corning	10-013-CV
solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Corning	21-031-CV
- (2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
puromicina	Sigma-Aldrich	P9620
Hidroclina de doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0	R1021		Fisher Scientific
para Placa de 24 Poços com 8.0μ m Membrana PET Transparente	Becton Dickinson	353097
Albumina de Soro Bovino	Sigma-Aldrich	A7906
Aplicador de Ponta de Algodão	Medline	MDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack	Fisher Scientific Company	123-869
, Alta Viscosidade	Richard Allan Scientific	M4004
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140122

Sistema 4 Suporte Permeável Falcon da Óleo de Imersão Resolve da