Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Resumo

Esta publicação descreve a fabricação de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para a quantificação directa dos transendothelial de resistência elétrica (TEER). Para validação, a barreira hemato - encefálica foi imitada dentro deste dispositivo microfluidic e sua função de barreira foi monitorizada. Os métodos apresentados para integração de eletrodo e quantificação de TEER direta são geralmente aplicáveis.

Resumo

Órgãos em chips, em vitro modelos envolvendo a cultura de tecidos (humanos), dentro de dispositivos microfluídicos, rapidamente são emergentes e promessa de fornecer úteis pesquisa ferramentas para estudar a doença e a saúde humana. Para caracterizar a função de barreira de camadas de células cultivadas dentro dispositivos de órgão-em-microplaqueta, resistência, muitas vezes transendothelial ou transepitelial elétrica (TEER) é medida. Para este fim, eletrodos são geralmente integrados o chip por micromaquinação métodos para fornecer medições mais estáveis do que é alcançado com inserção manual de eletrodos para as entradas do chip. No entanto, esses eletrodos frequentemente dificultam a inspeção visual da camada de célula estudado ou exigem cleanroom caros processos de fabricação. Para superar essas limitações, o dispositivo descrito aqui contém quatro facilmente integrados eletrodos que são colocados e fixo fora da área de cultura, possibilitando a inspeção visual. Usando esses quatro eletrodos que a resistência de seis caminhos de medição pode ser quantificada, da qual a TEER pode ser diretamente isolada, independente da resistência de microcanais cheio de meio de cultura. A barreira hemato - encefálica foi replicada neste dispositivo e seu TEER foi monitorado para mostrar a aplicabilidade do dispositivo. Esse chip, os eléctrodos integrados e o método de determinação de TEER são geralmente aplicáveis em órgãos em chips, para imitar a outros órgãos ou a ser incorporados em sistemas existentes de órgão-em-microplaqueta.

Introdução

Órgãos em chips são rapidamente emergindo como um novo e promissor classe in vitro , modelos de tecido. ¹ nesses modelos, as células são cultivadas dentro de dispositivos microfluídicos que são projetados de tal forma que eles imitam o microambiente fisiológica dessas células. ^{1 , 2} isto resulta em comportamento fisiológico ou patológico mais realista dessas células do que pode ser esperado de modelos convencionais em vitro de design simples e função básica. ^{3 , 5 , 6} além disso, órgãos em chips fornecem um melhor ambiente controlável do que os modelos na vivo e podem incorporar tecidos saudáveis e doentes, de origem humana para replicar fielmente tanto humana fisiologia e patologia. Os avanços recentemente resumidos no desenvolvimento do sangue – cérebro barreiras em chips (BBBs em chips) mostram que o campo é rapidamente se movendo para a frente. ⁷

Outra vantagem de órgãos em chips é que eles permitem monitoramento em tempo real e contínua do tecido cultivado dentro do dispositivo por microscopia, análises bioquímicas on-line e sensores integrados. ^{1 , 2} por exemplo, medir a resistência elétrica transendothelial ou transepitelial (TEER) é um método poderoso para monitorização não invasiva, o desenvolvimento e o rompimento da barreira-formando tecidos. ^{8 , 9 , 10} TEER é a resistência elétrica através de uma barreira celular e, portanto, é indicativo da integridade da barreira e permeabilidade. ¹⁰ em órgãos em chips, barreiras celulares são geralmente cultivadas em uma membrana que separa dois canais fluídico, representando o apical e basolateral compartimentos de tecido essa barreira. Em tais fichas, medições de TEER podem ser convenientemente conduzidas com eletrodos inseridos as entradas e saídas dos dois canais. ^{3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} entretanto, inserção manual e reinserção dos eléctrodos podem facilmente resultar em erros de posicionamento e, portanto, variações na resistência medida como por exemplo, as diferenças na resistência dos caminhos mais longos ou mais curtos através de microcanais são significativas em comparação com a resistência de barreira de célula. ¹⁶ para eliminar erros de reinserção, dispositivos com eléctrodos integrados têm sido propostos. No entanto, a maioria destes eléctrodos integrados bloquear a vista quando inspecionando a cultura de tecido^{17,18,19,20,21} e/ou exigir especializados processos de salas limpas para a fabricação. ^{17 , 22}

O dispositivo de órgão-em-microplaqueta descrito nesta publicação, foi aplicada pela primeira em uma publicação anterior,¹⁶ combina a estabilidade dos eléctrodos integrados com visibilidade sobre a camada de célula medido e fácil fabricação. O projeto e fabricação deste chip é retratada na Figura 1. Em suma, este dispositivo consiste de duas partes de polidimetilsiloxano (PDMS) com marcas de canal que são ligadas em conjunto escapamento livre com uma membrana de policarbonato com 0.4 µm poros no meio. Quatro eletrodos de fio de platina são inseridos e fixa no lugar com um photocurable adesivo bem fora da área de cultura. Todas estas etapas de fabricação podem ser conduzidas com equipamento geral de laboratório, sem a necessidade de um ambiente de sala limpa. Além disso, seis medições de impedância podem ser feitas usando esses quatro eletrodos, permitindo assim que o isolamento direto de TEER o medido, independente da resistência dos microcanais que antecederam a seção transversal e minimizando a influência de não-biológicos variações no sistema tais como (re) erros de inserção. ¹⁶

Para mostrar a aplicabilidade deste dispositivo e as medições de TEER diretas, que a barreira hemato - encefálica (BBB) foi replicada neste chip. Esta barreira biológica é composta de células endoteliais especializadas e regula o transporte entre o sangue e o cérebro para fornecer a homeostase do cérebro. ^{23 , 24} para imitar o BBB, o canal superior do dispositivo microfluidic foi forrado com células endoteliais microvasculares cerebrais humanas da linha celular hCMEC/D3 (gentilmente cedido pelo Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, França). ²⁵ o método apresentado é, no entanto, mais geralmente aplicável para qualquer dispositivo de órgão-em-microplaqueta com dois compartimentos, permitindo a determinação de TEER direta usando facilmente integrado a eletrodos.

Neste manuscrito, primeiro é descrito o processo de fabricação do dispositivo órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados. Próximo, o procedimento de semeadura e cultura de células endoteliais do cérebro dentro do dispositivo é explicado, bem como as medições de TEER no chip. Na seção de resultados, estão indicadas as medidas de TEER representativas e processamento de dados é esclarecido. Por último, a função de barreira do BBB-em-chip, monitorado durante 3 dias, é apresentada, mostrando a aplicabilidade do dispositivo apresentado e métodos para monitorar TEER.

Protocolo

1. fabricação do órgão-em-microplaqueta dispositivo

1. fazer uma réplica PDMS de um molde com os desenhos do canal, fabricado usando técnicas padrão de fotolitos e obter as peças PDMS do chip microfluidic. G
   1. pesa aproximadamente 27 PDMS base agente e agente de cura de 2,7 g; a proporção em massa deve ser de 10:1. Isto é bom para uma laje PDMS espessura de 3 mm em um molde com diâmetro de 130 mm (5 polegadas). Esses componentes homogeneiza.
   2. Desgaseificar a mistura em um dessecador por aproximadamente 45 min para remover as bolhas de ar.
   3. Enquanto isso, preparar o molde para a mistura líquida de PDMS por colagem fita desobstruída ao redor do molde ou coloque o molde em um suporte adequado da bolacha.
   4. Despeje a mistura PDMS desgaseificada sobre o molde. Se qualquer ar bolhas manteve-se na mistura de PDMS ou na superfície do molde, desgaseificar isso novamente por aproximadamente 30 min.
   5. Curar a mistura PDMS em estufa a 60 ° C por 4 h. permitir arrefecer.
   6. Em uma capa de fluxo cruzado, puxe o PDMS curado do molde; o molde pode ser reutilizado imediatamente para tornar mais réplicas PDMS.
   7. Corte a réplica PDMS em parte superior separada e partes de microplaqueta inferior usando linhas de corte no PDMS.
   8. Quatro buracos na parte superior usando um soco biópsia afiada com diâmetro de 1 mm para formulário de entradas e saídas. Soco de dentro para fora para evitar que restos PDMS coletando no chip. Cobrir as partes da microplaqueta com fita transparente para protegê-los contra poeira.
   9. Corte membranas de policarbonato de Transwell inserções em quadrados de aproximadamente 3 × 3 mm ².
2. Montar uma membrana porosa escapamento livre entre as duas partes PDMS para montar um dispositivo de duas camadas interfaceada com uma membrana porosa.
   Nota: Este protocolo é uma adaptação de Griep et al. ¹⁹ e Chueh et al. ²⁶
   1. Prepare uma argamassa PDMS/tolueno usando 0,7 g de agente de base de PDMS, 0,07 g de agente de cura e 540 µ l de tolueno, resultando em uma relação de peso de 5:3. Vórtice da argamassa completamente.
   2. Spin-casaco 200 µ l de argamassa para uma lamela de vidro a 1500 rpm por 60 s (Ramp a 1000 rpm/s) para adquirir uma camada fina e uniforme de argamassa.
   3. Transferir uma fina camada de argamassa de lamela na parte inferior e uma parte superior do chip com um rolo de tinta. Colocar a parte de baixo em um prato de forno.
   4. Com um conjunto de pinças, mergulhe as bordas de uma membrana para a argamassa de rotação-revestido e colocá-lo cuidadosamente no meio da parte inferior
   5. Coloque cuidadosamente a parte superior na parte inferior prestando atenção ao alinhamento.
      Nota: Não faça pressão sobre o chip e não deslize a parte superior sobre a parte inferior para evitar que a argamassa de entrar os canais de entupimento da membrana.
   6. Cobrir as entradas de fichas com fita transparente para impedir que a poeira de entrar o chip e coza-os a 60 ° C por 3 h.
3. Integrar os canais do lado eletrodos.
   Nota: Este protocolo é uma adaptação de Griep et al. ¹⁹ e Douville et al. ¹⁸
   1. cortar o fio de platina em pedaços de aproximadamente 2 cm. Clean submergindo-los em acetona por 30 min. Enxágue com água e etanol e deixar para secar.
   2. Em uma capa de fluxo cruzado, colocar um chip num prato de plástico. Inserir os canais de eletrodo de um chip usando um par de pinças de quatro fios de platina e dobre-as para baixo sobre o prato plástico para permitir a fixação ao prato em uma etapa posterior. Insira os fios 0,7-1 mm dentro do canal de cultura, além da junção do canal em forma de T.
   3. Aplicar uma gota de cola UV-curable na entrada do canal do elétrodo e permitir que a cola encher o canal em torno do eletrodo por forças capilares.
   4. Ligar UV e cura a cola quando atingir o final do canal eletrodo.
      Atenção: Não olhe para a fonte de luz UV, como isso pode prejudicar seus olhos.
   5. Se fixam os quatro eléctrodos integrados para o prato de plástico com um adesivo epóxi de dois componentes. Isto permite uma manipulação mais fácil dos eletrodos durante as medições sem o risco de puxar os eléctrodos do chip.
   6. Cobrir os chips com fita transparente e cozê-los em 60 ° C durante 2 h. deixe esfriar e armazenar a livre de poeira até o uso. Desta forma eles podem ser armazenados com segurança para um mês.

2. Cultura de células endoteliais derivado do cérebro no chip

1. revestir os chips para promover a fixação da célula.
   1. Preencher ambos os canais com fosfato tampão salino (PBS) para molhá-las antes de introduzir os reagentes. Verifique sob um microscópio se existem quaisquer bolhas de ar nos canais. Em caso afirmativo, remova-os por lavagem com PBS extra.
   2. Preencher ambos os canais com 30 µ l de 20 µ g/mL de fibronectina humana em PBS. Incube a 37 ° C por 3 horas. Verificar se há bolhas de ar e, se necessário, lave os canais com PBS e refil com solução de fibronectina.
   3. Lave as batatas com o meio de crescimento endotelial e incube-os a 37 ° C e 5% de CO ₂ na incubadora por 2 h.
   4. Medir a TEER as fichas em branco, conforme descrito na etapa 3 para garantir que todos os eléctrodos estão em contacto directo com fluido nos canais. Em fichas de vazias, os valores típicos de TEER são 0-1 Ω cm ².
2. Células de sementes para o canal superior.
   1. Remover o meio de cultura de um frasco de cultura (área de cultura de ² de 75 cm) com uma monocamada confluente de humanas células endoteliais microvasculares cerebrais (hCMEC/D3).
   2. Lavar as células com PBS. Adicionar 2 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ para 2-5 minutos até que as células têm retirado o frasco de cultura.
   3. Desativar a tripsina com meio de cultura suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS). Contar as células e calcular o número total de células em suspensão.
   4. Entretanto, Centrifugar as células hCMEC/D3 a 390 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
   5. Resuspenda o pellet celular no volume apropriado de meio de crescimento endotelial (EGM-2) para chegar a uma concentração de 5 x 10 ⁶ células/mL. Isso resulta em uma densidade de semeadura de 2 x 10 ⁵ células/cm ² no chip.
   6. Lentamente Pipetar 30 µ l de suspensão de células bem misturado para o canal superior e remova a pipeta a partir da entrada em um movimento fluente, enquanto ainda exercer pressão.
   7. Verificar a densidade de semeadura sob um microscópio. Uma distribuição uniforme das células em todo o canal superior deve ser alcançada.
   8. Incubar os chips em 37 ° C e 5% CO ₂ pelo menos 1 h. expulsar quaisquer células não-inscritos com meio de cultura endotelial.
3. Manter a cultura endotelial em-microplaqueta.
   1. Duas vezes por dia, insira pontas de pipeta cheia de meio de cultura como reservatórios das enseadas e substituir o médio dentro do chip pelo fluxo movido a gravidade.
      Nota: Para evitar bolhas de ar de entrar os microcanais de destruir a camada de células, certifique-se de fazer contato de fluido-fluido entre a ponta da pipeta e o líquido em cima do chip antes de inserir a ponta uma enseada. Isto pode ser facilitado pela adição de uma pequena gota no em / tomada antes da introdução da pipeta.
   2. Também adicionar pipeta ponta reservatórios nos estabelecimentos para impedir a secagem dos canais.
   3. Incubar os chips em 37 ° C e 5% de CO ₂.

3. Medições de TEER no chip

1. Configurar the aparelhos de medição de TEER, consistindo de um bloqueio no amplificador e um circuito de cabo de sonda, como foi especificado na Van der Helm et al. ¹⁶ como alternativa, potentiostats ou impedância analisadores também são adequados para as medições de TEER baseados na impedância.
2. Tirar o chip de incubadora e permitem atingir a temperatura ambiente pelo menos 10 min. remover qualquer líquido do prato plástico ao redor dos eléctrodos para evitar eletrodo ponte fora do chip.
3. Levar o espectro de impedância de 200 Hz a 1 MHz para cada combinação de dois eletrodos, resultando em 6 espectros de impedância por chip em apenas 5-10 min. verificar se os espectros de impedância tem as magnitudes esperadas e formas para validar a medição de TEER, como é descrito na seção resultados.
4. Colocar o chip de volta na incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ depois de terminar a medição.
5. Processar os espectros de impedância obtidas para chegar a um valor normalizado de TEER. Resistência
   1. get a medida entre eletrodos e , conforme indicado na Figura 2B e D, do planalto resistivo de 10 kHz em espectros de impedância correspondente.
   2. Calcular a TEER usando as resistências medidas seis correspondente a único chip simultaneamente aponta usando a equação da Figura 2 ¹⁶:
      
      nesta equação, é a área da cultura, através do qual a resistência foi medida, < img alt = " Equação 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ > é a resistência da barreira celular e a membrana, , , e são a resistência os valores medidos através da barreira celular e e são os valores de resistência medidos na canais em linha reta. ¹⁶ a equação é derivada de circuito equivalente, ilustrado na Figura 2.
6. Subtrair a TEER em branco da TEER em todos os pontos de tempo para obter o desenvolvimento da TEER no tempo.

Resultados

Os resultados esquemáticos da espectroscopia de impedância elétrica através de um chip sem células (linha contínua) e uma barreira celular (linha tracejada) são mostrados na Figura 2A. Podem ser identificadas quatro principais regiões, cada uma dominada por um componente elétrico específico. Abaixo de aproximadamente 1 kHz, domina a capacitância da dupla camada na interface eletrodo-cultura média, caracterizada por uma inclinação negativa para a magnitude de impedância e uma mudança de fase de aproximação-90 °. A frequência em que domina a capacitância da dupla camada, depende da área de eletrodo exposta ao meio de cultura. Planalto resistivo acima de 1 kHz (sem pilhas) ou 100 kHz (com pilhas) com uma mudança de fase, perto de 0 °, corresponde à resistência do meio de cultura dentro dos canais microfluídicos, dependendo do comprimento do canal e área da seção transversal e dentro do membrana, dependendo da porosidade e da espessura. Quando se mede através de uma barreira celular, um planalto extra resistivo entre 1 e 10 kHz é visto assim como um máximo local no diagrama de fase. Esta região é de importância crítica para a determinação da TEER como um claro aumento resultados de impedância quando as células estão presentes no caminho de medição e, portanto, são denominadas "região de interesse". A inclinação extra entre 10 e 100 kHz corresponde a capacitância de barreira de célula, que surge a partir das membranas de bicamada lipídica electricamente isolante e depende da área total da camada de células. ²⁷ os limites das regiões, bem como as magnitudes de impedância dependem do sistema sendo estudado e mudam com, entre outras coisas, dimensões do canal, condutividade do meio de cultura, posição do eletrodo e tipo de célula. Para ler mais sobre a teoria e a prática da espectroscopia de impedância elétrica na barreira-formando tecidos, recomenda-se o artigo de revisão de Benson et al . ²⁸

Dados representativos das medições TEER são mostrados para um chip em branco e um chip com uma camada de células endoteliais do cérebro hCMEC/D3 na Figura 2E e 2F, respectivamente. Em suma, a espectroscopia de impedância foi realizada usando seis medições com quatro eletrodos: duas medições através de canais de cheias de meio de cultura celular (linhas sólidas) e quatro medições através dos canais, bem como a membrana e - se presente - o barreira celular (linhas tracejadas). Esses caminhos de seis medição podem ser identificados no circuito resistivo equivalente da Figura 2B, que é derivado do corte transversal esquemático (Figura 2) e vista superior (Figura 2D). As medições do chip em branco (Figura 2E) mostram a forma típica de espectros de impedância sem células, conforme ilustrado na Figura 2A. As medições através da barreira celular (linhas tracejadas na Figura 2F) assemelham-se os espectros de impedância típica com células na Figura 2A. Nota que tanto a magnitude de impedância e fase de mudança de aumento para 1 MHz. Esta é a resposta típica da instalação de medição em altas frequências e não é de origem experimental.

Para determinar a TEER usando esses espectros de impedância experimental, primeiro a resistência medida microplaqueta é determinada, que é a resistência total da camada de células, canais e membrana. Para este efeito, uma frequência de leitura adequado na região de interesse foi escolhida, que é no máximo local na trama de fase com células e perto de mudança de fase de 0 ° sem células: 10 kHz. Com as seis resistências medidas de 10 kHz, medida entre os quatro eletrodos, o TEER é diretamente calculada usando a equação na Figura 2F.

Para mostrar que o dispositivo apresentado é adequado para a determinação de TEER nos órgãos em chips, o BBB foi replicado dentro do chip e seu TEER foi monitorada durante 3 dias de cultura. Na Figura 3A que média TEER ± erro padrão da média (SEM) é mostrado por quatro BBBs em chips, resultando em um platô de 22 ± Ω 1.3 cm², que é comparável a TEER desta linha de celular, como relatado na literatura. ²⁹ além disso, após o término do experimento e fluorescência de coloração dos núcleos, pode ser visto que o endotélio cerebral formada uma monocamada contínua dentro do dispositivo (Figura 3B). Mancha da imunofluorescência de proteína junção apertada Zonula Occludens-1 (ZO-1) mostrou que as células endoteliais do cérebro mantiveram seu fenótipo específico BBB e formaram complexos juncionais apertados.

Figura 1: Concepção e montagem do dispositivo órgão-em-microplaqueta com eléctrodos integrados.
(A) vista explodida do chip microfluídicos, consistindo de uma parte superior de PDMS com o canal superior (TC), uma membrana (M) e uma parte inferior parte PDMS com o canal inferior (BC). Quatro eletrodos de fio de platina (E1-4) estão inseridos e nos canais de lado. No canal superior e na parte superior da membrana, as células endoteliais do cérebro hCMEC/D3 foram cultivadas para replicar o BBB. (B) montado chip, de fixo para um prato de plástico. Reimpresso e adaptado com a permissão da Elsevier. ¹⁶ por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dados de impedância representativa e determinação de TEER.
(A) impedância esquemático espectro apresentando magnitude de impedância (Ω) e mudança de fase (°) versus frequência (Hz), típica para espectroscopia de impedância elétrica em chips sem células (linha contínua) e com células (linha tracejada). Existem quatro principais regiões, cada uma dominada por: a capacitância da dupla camada em eletrodos, o meio de cultura resistência, a célula barreira e a capacitância de membrana celular. A "região de interesse" indica onde a contribuição da camada de células pode ser quantificada (seta vermelha). (B) circuito resistivo equivalente do chip, mostrando o canal superior resistores R₁ e R₃, o fundo canal resistores R₂ e R₄ e a membrana e CE barreira resistor R_m. (C) esquemática seção transversal mostrando as células endoteliais (CE), cultivadas no canal superior. (D) vista superior esquemática do BBB chip mostrando a configuração dos eletrodos e da área de cultura de 0,25 mm² , através do qual a impedância é medida. (E) espectros de impedância representativo de um chip em branco preenchido com meio de cultura celular. Espectros de impedância representativa (F) de um chip no qual hCMEC/D3 células endoteliais do cérebro foram cultura por 3 dias. (G) a fórmula para calcular TEER partir as resistências medidas entre todas as seis combinações de quatro eletrodos. Reimpresso e adaptado com a permissão da Elsevier. ¹⁶ , por favor clique aqui para ver um maior versíon desta figura.

Figura 3: Desenvolvimento de TEER representativa de BBB-em-microplaqueta.
(A) TEER média ± erro padrão da média (SEM) de quatro BBBs em chips durante um período de cultura de três dias, atingindo um platô em 22 ± 1.3 Ω cm² (média ± SEM). Para comparação, dados de fichas em branco estão incluídos, mostrando a variação marginal e desvio de 0 Ω cm² no mesmo período em comparação com a variação e o valor TEER de chips com células. (B) microscopia de fluorescência de núcleos corados revelou uma monocamada contínua do endotélio, tanto no PDMS e a membrana no local indicado no baixo-relevo. (C) imunofluorescência revelou a presença de proteína de junção apertada Zonula Occludens-1, indicando que junções apertadas de BBB específicas entre as células dão origem a TEER o medido. Reimpresso e adaptado com a permissão da Elsevier. ¹⁶ por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste manuscrito, a engenharia de um dispositivo de órgão-em-microplaqueta e a determinação direta da resistência transendothelial eléctrica (TEER) de uma barreira celular cultivada no dispositivo foram apresentados. O método apresentado de integrar eletrodos sem equipamento de salas limpas e a determinação de TEER direta usando quatro eletrodos é aplicável a qualquer dispositivo de órgão-em-microplaqueta com dois compartimentos microfluidic. O layout de microplaqueta e geometria podem ser adaptados para atender os requisitos dos experimentos envisioned, contanto que os quatro eléctrodos são separados em dois compartimentos. Os quatro eletrodos podem mesmo ser convenientemente inseridos nas enseadas de fichas existentes, desde que eles são fixados no lugar para a duração das seis medições. O método de ligação livre de vazamento pode ser otimizado para diferentes membranas e geometrias de canal, alterando a relação PDMS/tolueno. Um teor mais elevado de tolueno resulta em uma camada mais fina spin-revestido de argamassa²⁶ e pode ser mais apropriado para canais mais rasas e mais estreitos na parte PDMS. Um resultados de tolueno menor conteúdo em um almofariz mais espesso camada²⁶ e podem ser mais apropriado para delimitar mais espessas membranas entre as partes PDMS.

Como pode ser visto nos espectros de impedância esquemática na Figura 2A e os espectros experimentais na Figura 2E e 2F, as medições de impedância são influenciadas pela capacitância da dupla camada na interface eletrodo-médio. Devido ao pequeno tamanho dos eletrodos dentro os microcanais, a capacitância da dupla camada pode dominar sobre o planalto resistivo da barreira celular nos espectros de impedância, complicando a quantificação de TEER o. Para superar isso, os eletrodos podem ser inseridos mais nos canais de cultura antes de fixação. Isto irá aumentar a área da superfície do eletrodo exposto com meio de cultura e com isso a capacitância da dupla camada aumentará também. Isso resulta em uma mudança da inclinação capacitiva para frequências mais baixas, para que o planalto resistivo da barreira celular pode ser mais facilmente reconhecido e quantificado. Embora a resistência do caminho medido entre dois eletrodos se tornará menor, isso não influenciará a quantificação de TEER o método apresentado a seguir.

Durante a medição através da barreira celular, é possível que o planalto extra resistivo não pode ser reconhecido. Isto pode ser o resultado de uma conexão fluídico entre os dois canais, por exemplo, se a membrana mal delimitada pelo morteiro, levando a um caminho medido próximo a barreira celular. Além disso, pode haver uma ponte elétrica fora o chip se os eléctrodos estão ligados por uma gota de meio de cultura. Isto é geralmente combinado com uma baixa impedância medida e pode ser resolvido removendo esta ponte do meio de cultura. Por último, se não há nenhum planalto resistivo e a impedância medida é ordens de magnitude maior do que o esperado, pode haver uma conexão frouxa na fiação elétrica ou na fonte de energia.

No futuro, a relevância fisiológica do atual BBB-em-chip pode ser aumentada, expondo as células endoteliais para distorcer o stress em níveis fisiológicos, que é relatado para promover tensão de barreira de diferenciação e aumento BBB e é difícil de alcançar em modelos convencionais em vitro . ²⁹ além disso, o canal inferior do dispositivo apresentado fornece um compartimento apropriado para células derivado do cérebro para ser cultivadas co com o endotélio. Isso também é esperado para aumentar a função de barreira e também permite o estudo das interações complexas entre tipos de células relevantes sob condições patológicas. ²⁹

Em conclusão, o órgão-em-microplaqueta dispositivo descrito nesta publicação pode ser fabricado utilizando equipamentos laboratoriais padrão e é mostrado para fornecer medições directas de TEER usando quatro eléctrodos integrados que não impedem a inspeção visual da célula estudada camada. A aplicabilidade deste dispositivo no campo de órgãos em chips foi demonstrada por imitando o BBB neste chip e monitoramento a TEER durante o período de cultura. Uma série de outros órgãos (barreira) pode ser imitada, incluindo outros tipos de células relevantes para este chip. Além disso, o método de medição TEER pode ser facilmente aplicado em outros dois dispositivos baseados no compartimento órgão-em-microplaqueta para chegar a valores TEER reprodutíveis e significativos que podem ser comparados através de dispositivos e sistemas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais
Polidimetilsiloxano (PDMS) agente base e agente de cura: Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone	Dow Corning	1673921
Fita Scotch Magic	Punção de biópsia 3M
, diâmetro de 1,0 mm	Integra Miltex	33-31AA-P/25
Membrana de policarbonato, 0,4 µ tamanho de poro m	Corning	3401	Corte de inserções de cultura Transwell
Toluene	Sigma-Aldrich	244511
fio de platina, 200 µ m de diâmetro	Alfa Aesar	10287
Adesivo curável por UV: Adesivo óptico Norland 81	Norland Products	NOA 81
Adesivo epóxi: Loctite M-31 CL Hysol	Henkel	30673
Células			Linha de células endoteliais microvasculares cerebrais humanas, gentilmente cedidas pelo Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, França
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma	P4417
Fibronectina plasmática humana, 20 µ g/ml	Gibco	33016015
Meio de crescimento endotelial-2 (EGM-2)	Lonza	CC-3162	Meio basal endotelial-2 (EBM-2) suplementado com EGM-2 SingleQuots
Tripsina-EDTA, 0,05%	Gibco	15400-054
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco	26140-079
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipment
Oven	Binder	9010-0190
Revestidor de rotação: Spin 150	Polos	SPIN150-NPP
Fonte de luz UV, 365 nm por 5 s a 350 mW/cm2	Fabricado internamente
Centrífuga: Centrífuga Allegra X-12R Beckman	Coulter
Incubator	Binder	CB E2 150
Boxense	LocSense		Amplificador lock-in com circuito de cabo de sonda, especializado para medições TEER no chip