Artigo de método

Protocolo de uma etapa para a avaliação do modo de morte celular induzida por radiação de Clonogenic por microscopia de fluorescência

DOI:

10.3791/56338

⸱

23 de outubro de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Gunma University Graduate School of Medicine, 2Advanced Scientific Research Leaders Development Unit, Gunma University Graduate School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Pesquisa sobre radiação ionizante (IR)-morte de celular induzida clonogenic é importante para entender os efeitos do IR sobre tumores malignos e tecidos normais. Aqui, descrevemos um ensaio de uma etapa para avaliar os principais modos de morte celular induzida por IR clonogenic, com base na morfologia de 4', dicloridrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-manchado núcleos visualizados por microscopia de fluorescência.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pesquisa sobre radiação ionizante (IR)-morte de celular induzida clonogenic é importante para compreender o efeito de IR em tumores malignos e tecidos normais. Aqui, descrevemos um ensaio de uma etapa rápida e econômica para avaliar simultaneamente os principais modos de clonogenic morte de celular induzida por IR, ou seja, apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular. Neste método, células cultivadas em uma lamela são irradiadas com raios-x e manchadas com 4', dicloridrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Usando microscopia de fluorescência, apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular são identificados com base nas morfologias características dos núcleos DAPI-manchado. Apoptose é determinada pela presença de corpos apoptotic (ou seja, núcleos de condensação e fragmentados). Catástrofe mitótica é determinada pela presença de núcleos que apresentam dois ou mais lóbulos distintos e micronúcleos. Senescência celular é determinada pela presença de senescência-associado heterocromático focos (isto é, DNA nuclear que contém 30-50 brilhantes, densos focos). Essa abordagem permite que o experimentador facilmente de tela para clonogenic modos de morte celular usando várias linhas celulares, ambientes de tratamento, e/ou pontos de tempo, com o objetivo de elucidar os mecanismos de morte celular nas células-alvo e condições de interesse.

Introdução

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Radiação ionizante (IR) induz vários modos de morte celular de clonogenic. Investigação sobre morte de celular induzida por IR clonogenic é importante para a compreensão da toxicidade do IR para tecidos normais, bem como para o desenvolvimento de métodos para aumentar a eficácia do tratamento de radioterapia do câncer. Apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular são os principais modos de clonogenic morte de celular induzida por IR1. Apoptose é uma modalidade regulamentada de morte celular que é iniciada pelo DNA danos1. Catástrofe mitótica é a morte celular que ocorre devido a mitose aberrante resultantes não reparados DNA rupturas da dobro-Costa1. Senescência celular é definida como um estado de célula irreversível crescimento prisão2; Observe que a senescência celular não é a morte celular em si, mas é um modo de morte celular de clonogenic porque ele abole a sobrevivência de clonogenic da célula senescente.

Vários ensaios cell-based foram desenvolvidos para avaliar individualmente a apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular. Apoptose pode ser avaliada pelo terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-final rotulagem (TUNEL) de coloração, anexina V coloração, ensaios de fragmentação de DNA e determinação de fase sub-G1-ciclo celular por citometria de fluxo1. Catástrofe mitótica pode ser avaliada por imunofluorescência mancha para marcadores mitóticas, incluindo MPM2, TUNEL de coloração e microscopia eletrônica1. Senescência celular pode ser avaliada pela mancha de senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal), ensaios de crescimento de prisões e microscopia eletrônica1. Importante, o modo predominante de morte celular de clonogenic difere entre linhas celulares e tratamento configurações3,4. Portanto, para elucidar o perfil global de clonogenic morte celular para um dado ajuste experimental, vários ensaios abrangendo todos esses modos de morte devem ser realizados juntos, que é o trabalho de parto - e onerosos.

Neste artigo, descrevemos um ensaio de uma etapa rápida e econômica para avaliar simultaneamente a apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular induzida por IR3,4. Neste método, células cultivadas em uma lamela são irradiadas com raios-x e manchadas com 4', dicloridrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Usando microscopia de fluorescência, apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular são cada um identificado baseia as respectivas morfologias características dos núcleos DAPI-manchado. Esta abordagem será útil para aplicações que incluem triagem para perfis de morte de célula clonogenic em várias linhas celulares, ambientes de tratamento e pontos de tempo, com o objetivo de investigar os mecanismos de morte celular nas células-alvo e condições de interesse.

Protocolo

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1. preparação de materiais

  1. Autoclave lamínulas.
    1. Lugar de lamínulas num copo de vidro.
    2. Cobrir o copo de vidro com folha.
    3. Autoclave a 121 ° C a 15 psi para 20 min.
    4. Seco em 50 ° C. armazenar em temperatura ambiente em um capuz de cultura.
  2. Preparar a solução de fixação: 3% paraformaldeído + 2% de sacarose em tampão fosfato salino (PBS).
    1. Para um frasco de vidro de 1.000 mL, adicionar 700 mL de PBS e paraformaldeído 30 g.
      Atenção: Paraformaldehyde é corrosiva, usar luvas adequadas.
    2. Paraformaldeído dissolver completamente por aquecimento a 80 ° C, usando o microondas.
      Cuidado: Paraformaldehyde fumos são tóxicos, usar uma máscara.
    3. Deixar à temperatura ambiente durante a noite.
    4. Adicionar sacarose 20 g.
    5. Adicionar PBS tornar-se o volume total de 1 L.
    6. Tubos de alíquota de 50 mL. Solução de fixação pode ser armazenada por 3 anos a-20 ° C, ou por 3 meses a 4 ° C.

2. Preparação de cultura celular

Nota: estes procedimentos devem ser executados em um capuz cultura.

Células de osteossarcoma humana U2OS
  1. cultura e passagem para manter o crescimento logarítmico 5.
    Nota: Outros tipos de células podem ser usados após a determinação da dose de irradiação ideal.
  2. Limpe um bisturi com toalhas de papel umedecidas com álcool 70%. Com o bisturi, coloque uma lamínula sobre numa placa de cultura de células de 35mm (doravante simplesmente referido como " o prato ").
    Nota: O número de lamínulas em um prato pode ser aumentado de acordo com o experimental design (veja discussão).
    3. Meios de cultura adicionar 1 mL de
  3. : DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino.
    Nota: Outros meios de comunicação podem ser usados de acordo com o tipo de célula escolhida.
    4. Fórceps
  4. limpe com papel toalha umedecido com etanol a 70%. Usando a pinça, pressione cuidadosamente o centro da lamínula. Os meios de cultura do prato, Aspire completamente, mantendo uma preensão sobre a lamínula.
    ​ Nota: esta etapa promove a imobilização da lamínula para o prato.
  5. Desanexar aderentes pilhas cultivadas usando tripsina 5.
    1. Aspire meios de cultura do prato.
    2. Adicione 1 mL de PBS e agite o prato.
    3. Aspire PBS do prato.
    4. Adicionar 1 mL do trypsin [0.25w/v% tripsina-1mmol/L EDTA] ao prato.
    5. Incubar por 5 min a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO 2.
    6. Adicionar 9 mL meio de cultura para o prato.
    7. Usando uma micropipeta de 1000 μL, prepare uma suspensão de célula única.
  6. Contar as células 5.
    1. Em um tubo de 1,5 mL, adicionar a suspensão de células de 0,9 mL e 0,1 mL 0,4% solução de azul de Trypan.
    2. Aplicar 10 μL de um hemocytometer.
    3. Examinar o número de inocente (ou seja, ao vivo) de células sob um microscópio de fase invertida.
  7. Em um tubo de 15 mL, prepare-se 3 mL suspensão de células em meios de cultura, com uma densidade de 0,5 x 10 5 células/mL.
    Nota: Célula densidade pode ser modificada de acordo com experimental precisa (ver discussão).
  8. Suavemente, adicionar 2 mL de suspensão de célula ao prato.
  9. Incubar durante a noite a 37 ° C, em atmosfera contendo 5% de CO 2.

3. Irradiação

atenção: lidar com o irradiador de raios-x com cuidado de acordo com o fabricante ' instruções de s.

  1. Examinar as células sob um microscópio de fase invertida. Confirmar que as células são anexadas a lamínula e vivo.
  2. Irradiar o prato com 6 Gy radiografias (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
  3. Incubar por 72 h a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO 2.
    Nota: O tempo de incubação pode ser modificado de acordo com o experimental design (veja discussão).

4. Fixação

  1. Aspire meios de cultura do prato.
  2. Usando uma tesoura, corte a ponta de uma micropipeta de 1.000 μL ponta 5 mm da extremidade.
    Nota: A ponta de corte ajuda a aplicar suavemente a solução de fixação.
  3. Usando a ponta de corte, adicionar 1 mL de solução de fixação (preparada na etapa 1.2) ao prato da parede lateral do prato.
    Nota: Este passo é sensível ao tempo e, portanto, deve ser realizado sem alterar dicas micropipeta ao manusear amostras múltiplas. Aplicação da solução de fixação diretamente para o fundo do prato pode danificar as células.
  4. Coloque o prato em um prato de cultura quadrados. Agitar o prato quadrado cultura suavemente para distribuir a solução de fixação sobre a lamínula uniformemente.
  5. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  6. Aspirar a solução de fixação do prato.
  7. Adicionar 2 mL de PBS ao prato da parede lateral do prato.
    Nota: A aplicação de PBS diretamente para o fundo do prato pode danificar as células.
  8. Aspire PBS do prato.
    9. Repita os passos 4.7 e 4.8 duas vezes de
  9. .
    Nota: O prato pode ser armazenado durante 1 semana a 4 ° C com as lamínulas banhadas em 2 mL de PBS.

5. Coloração de DAPI

  1. para um vidro de slide, aplicar 5 μL coloração DAPI 1 μg/mL reagente.
    Nota: O DAPI coloração reagente é estável por 6 meses quando armazenado protegido da luz em ou abaixo de -20 ° C.
  2. Usando um bisturi, remove o deslizamento da tampa do prato.
  3. Desenhar fora a excesso PBS sobre a lamínula, tocando a borda da lamínula com uma toalha de papel.
  4. Montar o deslizamento da tampa de ponta-cabeça sobre a gota de DAPI coloração reagente no vidro do slide para que as células são expostas a DAPI coloração reagente.
    Nota: Este passo é sensível ao tempo. Secagem do DAPI coloração reagente pode levar a coloração suboptimal.
  5. As amostras podem ser armazenadas por 1 ano em -20 ° C.

6. Aquisição de imagem

  1. examinar a amostra em um microscópio de fluorescência. Núcleos são visualizados usando o filtro DAPI.
    Nota: Qualquer um 20 X ou uma lente de óleo 60 X pode ser usado, de acordo com o pesquisador ' juros s. Ao usar uma lente de óleo X 60, adicione uma gota de óleo sobre a lamínula. Cuidado que as amostras não toque na lente; caso contrário, a lente pode ser danificada.
  2. Adquirir imagens de núcleos usando uma câmera CCD e software de aquisição de imagem digital com as seguintes configurações e parâmetros: filtro DAPI, imagens monocamada, ganhar de 1 X e a exposição automática.
    3. Aquisição de imagem
  3. acabamento: Limpe a 20 X lente com toalhas de papel umedecidas com lente limpador. Limpe o 60 X lente de óleo com papel toalha umedecida com clorofórmio.

7. Avaliação do modo de morte da célula Clonogenic

  1. em imagens selecionadas aleatoriamente, contar o número de núcleos que atendem aos critérios para apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular até que o número total de núcleos contados atinge 300. Realizar esta etapa em triplicado para cada configuração experimental.
    1. Critérios para apoptose: presença de apoptotic corpos (ou seja, núcleos de condensação e fragmentados) 6 , 7.
    2. Critérios para catástrofe mitótica: presença de núcleos mostrando dois ou mais lóbulos distintos ou micronuclEi 8 , 9 , 10.
    3. Critérios para senescência celular: presença de focos heterocromático associada a senescência (SAHF) (ou seja, DNA nuclear que contém 30-50 brilhantes, densos focos) 2 , 11.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como exemplo, U2OS humana osteossarcoma células foram tratadas com 6 Gy radiografias, incubadas durante 72 h e submetidas para o DAPI ensaio de acordo com o protocolo de coloração. A Figura 1 mostra imagens ampliadas para as morfologias nucleares típicas associadas com a apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular obtida usando uma lente de óleo 60 ×. Consulte a 7.1.1-7.1.3 passos para as morfologias características para cada modo de morte celular de clonogenic. Figura 2 mostra imagens de visão geral de núcleos obtidos usando uma lente X 20. Irradiação com 6 Gy radiografias induzido catástrofe mitótica frequentemente, apoptose menos frequentemente e senescência celular raramente. Desta forma, exame em um campo de baixa ampliação permite apreender num relance a imagem global do perfil de morte celular do clonogenic em uma determinada configuração experimental. A Figura 3 mostra uma representação gráfica dos dados quantificados.

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Figura 1: zoom imagens dos núcleos manchadas de DAPI mostrando morfologias típicas de apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular. U2OS células foram irradiadas com 6 Gy radiografias. Depois de 72 h, as células foram fixadas e coradas com DAPI. Nucleares imagens foram adquiridas utilizando um 60 X lente de petróleo. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: imagens de visão geral de DAPI-manchado de núcleos de células tratadocom com raios-x. U2OS células foram irradiadas com 6 Gy radiografias ou simulação irradiados. Depois de 72 h, as células foram fixadas e coradas com DAPI. Imagens de núcleos foram adquiridas usando uma lente X 20. Círculos, apoptose; setas, catástrofe mitótica. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: dados quantificados por apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular induzida em células tratadas com raios-x. U2OS células foram irradiadas com 6 Gy radiografias ou simulação irradiados. Depois de 72 h, as células foram fixadas e coradas com DAPI. Imagens de núcleos foram adquiridas usando uma lente X 20. De campos aleatórios, um total de 300 núcleos foram avaliados por apoptose (Ap), catástrofe mitótica (MC) e senescência celular (Sns). As avaliações foram realizadas em triplicata. Valores médios são mostrados, e barras de erro indicam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os passos críticos dentro do protocolo são os seguintes. Em primeiro lugar, células devem ser cultivadas no prato de cultura como uma monocamada porque conduzir uma avaliação morfológica dos núcleos de DAPI-manchado é difícil para as células em várias camadas. Para este fim, na etapa 2.9, recomenda-se cuidado transferência do prato cultura para uma incubadora; agitação do prato cultura gera um turbilhão de células suspensas que leva à concentração de células no centro do prato a cultura. Além disso, deve ser evitada a overconfluence levando a células em várias camadas. Para este fim, na etapa 2.7, o número de células semeado sobre o prato de cultura pode ser modificado com base na população dobrar o tempo e o intervalo entre a irradiação e a fixação. Recomenda-se uma confluência de aproximadamente 80 no momento da fixação. Em segundo lugar, a velocidade é importante na fixação e coloração de DAPI (ou seja, as etapas 4 e 5). Inconsistência entre amostra no que se refere o tempo tomado para estas etapas pode levar a heterogeneidade na intensidade de sinal DAPI nos núcleos, que iria obscurecer a avaliação morfológica.

Etapa 2.2, o número de lamínulas em um prato de cultura única pode ser aumentado; um máximo de quatro lamínulas pode ser colocado em um prato de 35 mm, e o número pode ser ainda mais aumentado usando pratos maiores. Colocação de lamínulas múltiplos em cada prato de cultura permite que a operação eficiente de avaliação de curso do tempo para um determinado tratamento (ou seja, a cobertura desliza pode ser coletadas de um prato de cultura um por um em vários pontos de tempo de interesse).

No passo 3.2, a dose de irradiação pode ser modificada de acordo com o interesse dos pesquisadores. A aplicação de uma dose consistente de várias linhas de célula permite a comparação da sensibilidade de cada modo de clonogenic morte celular entre as linhas de célula. Por outro lado, a utilização de doses de sobrevivência de iso-clonogenic para cada linha de celular permite a comparação de perfis de morte celular clonogenic entre as linhas de célula. A dose de sobrevivência de iso-clonogenic pode ser determinada pela sobrevivência do ensaio clonogenic12. O valor de10 D, a dose que fornece 10% clonogenic sobrevivência, é um ponto de extremidade comum para a dose de sobrevivência de iso-clonogenic.

Etapa 3.3, o tempo de irradiação a fixação pode ser modificado de acordo com o interesse dos pesquisadores; Isto é importante porque o tempo de pico por apoptose induzida por IR, catástrofe mitótica e senescência celular varia de acordo com o tratamento e a linha celular. Neste artigo, usamos 72 h após a irradiação, como ponto de tempo que seria mais útil para o rastreio inicial dos perfis de morte da célula clonogenic, baseado em vários estudos de nosso grupo e outros descrita da seguinte forma1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray induzida apoptose nas células estabelecidas principalmente de tumores sólidos ocorre poucos dias após a irradiação. (ii) X-ray induzida pela catástrofe mitótica em células cancerosas ocorre mais proeminente no segundo ou terceiro mitose após a libertação da prisão temporária-ciclo celular induzida por irradiação. O lançamento ocorre geralmente aproximadamente 24 h após a irradiação, seguida por mitoses repetidas em intervalos de aproximadamente 24 h. (iii) X-ray – induzido senescência celular torna-se evidente após um intervalo de acordo com a linha de celular em questão: 2 dias após irradiação para alguns casos de início e 7 dias após a irradiação para a maioria das linhas de celular. Depois de obter uma imagem global da célula clonogenic perfis de morte desde a triagem inicial, tempo de experiências do curso proporcionará uma elucidação mais detalhada do tempo máximo para cada modo de clonogenic morte celular em linhagem celular específica e/ou a condição de interesse4.

Deve notar-se que a DAPI coloração de ensaio e ensaio de sobrevivência de clonogenic, um método padrão-ouro para avaliação da sensibilidade de radiação, não são intercambiáveis. Apoptose e catástrofe mitótica só duram horas. Assim, o DAPI coloração ensaio para um ponto determinado momento detecta apoptose e catástrofe mitótica que ocorre no ponto da avaliação do tempo. Por outro lado, os resultados da sobrevivência clonogenic do ensaio em um determinado momento ponto incluem a quantidade total de apoptose e catástrofe mitótica que ocorreu durante o período de incubação normalmente 10-14 dias após a irradiação. Diferente da apoptose e catástrofe mitótica, as células senescentes permanecem sobre o prato de cultura; acumulam-se gradualmente ao longo do tempo após a irradiação. Portanto, os resultados de ambos o DAPI manchando o ensaio e o ensaio de sobrevivência clonogenic refletem a quantidade total de senescência que ocorreram durante o período de incubação. Importante, a proporção de apoptose, catástrofe mitótica e senescência induzida por irradiação varia amplamente de acordo com a célula dose de linha e irradiação. Tomados em conjunto, teoricamente, os resultados de um ensaio não podem ser traduzidos diretamente para aqueles do outro ensaio.

O DAPI coloração ensaio tem algumas limitações. Em primeiro lugar, permanece controverso se a catástrofe mitótica é um modo distinto de morte celular. No campo da biologia da radiação, catástrofe mitótica é considerado um grande modo de morte celular induzida por IR que é distinta de outros mecanismos de morte celular clonogenic1. Por outro lado, outros argumentam que essa catástrofe mitótica não é um modo distinto de morte celular, mas sim um processo que precede a morte celular, incluindo apoptose e necrose de13,14. Assim, apoptose e catástrofe mitótica podem sobrepor-se em certa medida. Anteriores, segundo estudos sugerem que a senescência celular pode ocorrer na ausência de SAHF em algumas linhas de célula e as configurações de tratamento2. No presentes, outros ensaios projetados especificamente para cada célula de clonogenic modo de morte deve ser usado para aumentar a robustez das conclusões de um determinado experimento. Em terceiro lugar, o DAPI manchando o ensaio não pode apreciar modos de clonogenic morte celular além de apoptose, catástrofe mitótica e senescência celular (por exemplo, necrose e autofagia). Em quarto lugar, o utilitário do DAPI coloração ensaio como preditor de resposta do tumor à radioterapia não foi elucidado na clínica. Deste ponto de vista, o ensaio de sobrevivência de clonogenic, que avalia a quantidade total de morte celular de clonogenic, é superior da DAPI coloração ensaio porque estabeleceu uma correlação entre SF2, a sobrevivente fração de células irradiadas com 2 Gy Raios-x e a resposta do tumor à radioterapia15. No entanto, é notável que o ensaio de sobrevivência de clonogenic não é utilizado amplamente na clínica, principalmente devido à exigência de um alto grau de especialização e um longo período de tempo (ou seja, 14 dias) para aquisição de dados. Em comparação, o procedimento para o DAPI ensaio de coloração é mais simples e leva significativamente menos tempo, aproximadamente 3-4 dias, para gerar resultados. O utilitário de manchar o DAPIensaio como um preditor de resposta do tumor à radioterapia será testado na clínica em um futuro próximo.

Em resumo, o DAPI manchando o ensaio é um ensaio de uma etapa cost-effective para avaliar simultaneamente os três modos principais de morte celular de clonogenic induzida por IR. Esta abordagem permite facilmente de tela para os modos de clonogenic morte celular para várias linhas celulares, ambientes de tratamento e pontos de tempo, com o objetivo de elucidar os mecanismos de morte celular nas células-alvo e condições de interesse.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Sra. Akiko Shibata para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Grants-in-Aid do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão para programas para as principais escolas de pós-graduação, cultivando líderes globais em pesadas Therapeutics íons e engenharia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
lamínulaMatsunamiC013001
paraformaldeídoSigma-AldrichP6148-1KG
sacaroseSigma-Aldrich84097-250G
solução salina tamponada com fosfatoCosmo Bio16232000
bisturiKai MedicalNo.20, 520-A
35 mm placa de cultura de célulasFalcon
tripsinaWako201-16945
microscópio de fase invertidaShimazu114-909
irradiador de raios-XFaxitron BiopticsFaxitron RX-650
placa de cultura quadradaCorning431110
vidro deslizanteMatsunamiPro-11
DAPI reagentede coloraçãoMicroscópio de fluorescência de sinalização celular8961S
NikonECLIPSE Ni
microscópio de fluorescência Filtro DAPINikonU-FUW, BP340-390, BA420IF, lente de microscópio de fluorescência DM410
(20 vezes;)NikonPlan Apo λ lente de microscópio de fluorescência 20X/0.75
(60&vezes;, óleo)NikonPlan Apo λ 60X/1.40 óleo
óleo OlympusN5218600
câmera CCDNikonDS-Qi2
software de aquisição de imagem digitalNikonNIS-Elements Limpador
OlympusOT0552
clorofórmioWako035-02616
353001 de lente de documento

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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