Microscopia holográfica digital (DHM) é uma técnica volumétrica que permite amostras de imagens realizadas 50-100x mais espesso que brightfield microscopia em resolução comparável, com o foco de pós-processamento. Aqui DHM é usado para identificar, contando e acompanhamento de microorganismos em muito baixas densidades e em comparação com medições de densidade óptica, contagem de placa e contagem direta.
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Artigo de método
Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Com a detecção e contagem de amostras bacterianas esparsas tem muitas aplicações na comida, bebidas e indústrias de processamento farmacêutico, em diagnósticos médicos e para a detecção de vida por missões robóticas para outros planetas e luas do sistema solar. Atualmente, esparsas amostras bacterianas são contadas por microscopia de chapeamento ou epifluorescência de cultura. Placas de cultura exigem longo tempo de incubação (dias ou semanas) e microscopia de epifluorescência requer mancha extensa e concentração da amostra. Aqui, demonstramos como usar fora do eixo microscopia holográfica digital (DHM) para enumerar as bactérias em culturas muito diluídas (100-104 células/mL). Em primeiro lugar, a construção da DHM personalizado é discutida, juntamente com instruções detalhadas sobre a criação de um instrumento de baixo custo. São discutidos os princípios da holografia, e um modelo estatístico é usado para estimar quanto tempo vídeos devem ser para detectar células, com base nas características desempenho óptico do instrumento e a concentração da solução bacteriana (tabela 2) . A detecção de células em 105, 104, 103e 100 células/mL é demonstrada em tempo real usando hologramas un-reconstruídos. Reconstrução de imagens de amplitude e fase é demonstrada usando um pacote de software open-source.
Introdução
Determinação da precisa contagens bacterianas em amostras muito diluídas é crucial em muitas aplicações: alguns exemplos são a água e a comida qualidade análise1,2,3; deteção de patógenos no sangue, líquido cefalorraquidiano ou escarro4,5; produção de produtos farmacêuticos, incluindo água estéril6; e análise ambiental da Comunidade em ambientes oligotróficos como o aberto oceano e sedimentos7,8,9. Exi....
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Protocolo
1. crescimento e enumeração de bactérias
Nota: isso se aplica a quase qualquer estirpe bacteriana crescida no médio adequado 36. No nosso exemplo, usamos três estirpes: Serratia marcescens como uma cepa comum, fácil laboratório identificáveis; e uma menor, altamente motile tensão ambiental, Shewanella oneidensis MR-1. Para comparar a deteção de motile vs pilhas non-motile, um non-motile Shewanella mutante, Δ FlgM, também é usado para comparação 37. Todas as cepas são cultivadas em caldo lisogenia (LB).
- Preparar estéril LB médio (por litro de água destil....
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Resultados
Os resultados devem indicar a capacidade de detectar bactérias vivas e mortas em níveis muito baixos por DHM. O número de bactérias contadas deve coadunar-se com os resultados obtidos usando as contagem de Petroff-Hauser câmara e placa contagens. Métodos estatísticos padrão fornecem informações sobre a precisão dos métodos de deteção diferentes concentrações bacterianas.
A Figura 1 mostra a câmara d.......
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Discussão
Reconstrução numérica de hologramas: para a reconstrução numérica de hologramas, é usado o método do espectro angular (ASM). Isso envolve a convolução do holograma com a função Green para a DHM. O wavefront complexo da imagem em um determinado plano focal pode ser calculada utilizando o teorema da convolução Fourier como segue:
(1)
Onde
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o Gordon e Betty Moore Foundation Grants 4037 e 4038 ao Instituto de tecnologia da Califórnia, para o financiamento deste trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Triptona | BD Biosciences | 211705 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | 7710 | Muitas opções de compra |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| Placas de Petri de 10 cm | VWR | 10053-704 | |
| Tubos de cultura de 15 mL | Falcon ( Corning Life Sciences) | 352002 | |
| Câmara Petroff-Hauser | Microscopia Eletrônica Sciences | 3920 | |
| Seringas de 10 mL | BD Biosciences | 309604 | ponta Luer-Lok não é necessária |
| Luer macho para encaixe farpado de 1/16" | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavável 1/16" Tubo de PVC ID para fluxo | Nalgene | 8000-0004 | Vendido por comprimento, compre de acordo |
| Bomba de seringa | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Câmara de Amostra | Personalizado | n/a | Ver Seção de Materiais |
| Microscópio Holográfico | Personalizado | n/a | Ver Wallace et al. |
| Software de código aberto | Custom https://github.com/bmorris3/shampoo |
Referências
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.
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Reimpressões e permissões
