Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)

Summary

Microscopia holográfica digital (DHM) é uma técnica volumétrica que permite amostras de imagens realizadas 50-100x mais espesso que brightfield microscopia em resolução comparável, com o foco de pós-processamento. Aqui DHM é usado para identificar, contando e acompanhamento de microorganismos em muito baixas densidades e em comparação com medições de densidade óptica, contagem de placa e contagem direta.

Abstract

Com a detecção e contagem de amostras bacterianas esparsas tem muitas aplicações na comida, bebidas e indústrias de processamento farmacêutico, em diagnósticos médicos e para a detecção de vida por missões robóticas para outros planetas e luas do sistema solar. Atualmente, esparsas amostras bacterianas são contadas por microscopia de chapeamento ou epifluorescência de cultura. Placas de cultura exigem longo tempo de incubação (dias ou semanas) e microscopia de epifluorescência requer mancha extensa e concentração da amostra. Aqui, demonstramos como usar fora do eixo microscopia holográfica digital (DHM) para enumerar as bactérias em culturas muito diluídas (100-10⁴ células/mL). Em primeiro lugar, a construção da DHM personalizado é discutida, juntamente com instruções detalhadas sobre a criação de um instrumento de baixo custo. São discutidos os princípios da holografia, e um modelo estatístico é usado para estimar quanto tempo vídeos devem ser para detectar células, com base nas características desempenho óptico do instrumento e a concentração da solução bacteriana (tabela 2) . A detecção de células em 10⁵, 10⁴, 10³e 100 células/mL é demonstrada em tempo real usando hologramas un-reconstruídos. Reconstrução de imagens de amplitude e fase é demonstrada usando um pacote de software open-source.

Introduction

Determinação da precisa contagens bacterianas em amostras muito diluídas é crucial em muitas aplicações: alguns exemplos são a água e a comida qualidade análise^1,2,3; deteção de patógenos no sangue, líquido cefalorraquidiano ou escarro^4,5; produção de produtos farmacêuticos, incluindo água estéril⁶; e análise ambiental da Comunidade em ambientes oligotróficos como o aberto oceano e sedimentos^7,8,9. Exi....

Protocol

1. crescimento e enumeração de bactérias

Nota: isso se aplica a quase qualquer estirpe bacteriana crescida no médio adequado ³⁶. No nosso exemplo, usamos três estirpes: Serratia marcescens como uma cepa comum, fácil laboratório identificáveis; e uma menor, altamente motile tensão ambiental, Shewanella oneidensis MR-1. Para comparar a deteção de motile vs pilhas non-motile, um non-motile Shewanella mutante, Δ FlgM, também é usado para comparação ³⁷. Todas as cepas são cultivadas em caldo lisogenia (LB).

1. Preparar estéril LB médio (por litro de água destil....

Results

Os resultados devem indicar a capacidade de detectar bactérias vivas e mortas em níveis muito baixos por DHM. O número de bactérias contadas deve coadunar-se com os resultados obtidos usando as contagem de Petroff-Hauser câmara e placa contagens. Métodos estatísticos padrão fornecem informações sobre a precisão dos métodos de deteção diferentes concentrações bacterianas.

A Figura 1 mostra a câmara d.......

Discussion

Reconstrução numérica de hologramas: para a reconstrução numérica de hologramas, é usado o método do espectro angular (ASM). Isso envolve a convolução do holograma com a função Green para a DHM. O wavefront complexo da imagem em um determinado plano focal pode ser calculada utilizando o teorema da convolução Fourier como segue:

(1)

Onde

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Yeast	BD Biosciences	212750
Bacto Triptona	BD Biosciences	211705
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	7710	Muitas opções de compra
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
Placas de Petri de 10 cm	VWR	10053-704
Tubos de cultura de 15 mL	Falcon ( Corning Life Sciences)	352002
Câmara Petroff-Hauser	Microscopia Eletrônica Sciences	3920
Seringas de 10 mL	BD Biosciences	309604	ponta Luer-Lok não é necessária
Luer macho para encaixe farpado de 1/16"	McMaster-Carr	51525K291
Autoclavável 1/16" Tubo de PVC ID para fluxo	Nalgene	8000-0004	Vendido por comprimento, compre de acordo
Bomba de seringa	Harvard Apparatus	PHD 2000
Câmara de Amostra	Personalizado	n/a	Ver Seção de Materiais
Microscópio Holográfico	Personalizado	n/a	Ver Wallace et al.
Software de código aberto		Custom https://github.com/bmorris3/shampoo