Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para o isolamento de axénica em larga escala e a coleção de miracidia livres de sangue fascíola Schistosoma mansoni e seu posterior processamento para introdução na cultura em vitro .

Resumo

Acasos de sangue humanos, Schistosoma spp., têm um ciclo de vida complexo que envolve as fases do desenvolvimento sexuais e assexuadas dentro de um caracol intermediário e mamífero hospedeiro final, respectivamente. A capacidade de isolar e sustentar os estágios do ciclo de vida diferentes condições em vitro cultura facilitou grandemente as investigações dos mecanismos celulares, bioquímicos e moleculares de regulação, host, desenvolvimento e crescimento do parasita interações. Transmissão da esquistossomose exige reprodução assexuada e o desenvolvimento de múltiplos estágios larvas dentro do anfitrião do caracol; o miracidium infecciosa, através de sporocysts primárias e secundárias, para a fase final do cercarial que é infecciosa para os seres humanos. Neste trabalho apresentamos um protocolo passo a passo para incubação em massa e isolamento de Schistosoma mansoni miracidia de ovos obtidos a partir de fígados de ratos infectados e sua subsequente introdução na cultura em vitro . Prevê-se que o protocolo detalhado irá incentivar novos pesquisadores a participar e ampliar este importante campo de pesquisa esquistossomíase.

Introdução

O ser humano sangue vermes Schistosoma spp., são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença tropical negligenciada que afligem um estimado de 230 milhões de pessoas em todo o mundo¹. A espécie mais difundida, Schistosoma mansoni, é geograficamente distribuída na América do Sul, o arquipélago das Caraíbas, o Médio Oriente e de África subsahariana². O ciclo de vida de S. mansonie outros schistosomes, é complexo, envolvendo um mamíferos hospedeiro definitivo e caramujos de água doce do gênero Biomphalaria que servem como hospedeiros intermediários obrigatórios.

Protocolo

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Wisconsin-Madison, sob protocolo e cuidados institucionais de Animal nenhum. V005717. O seguinte protocolo envolve o trabalho em uma instituição de nível de biossegurança 2 (BSL2) para patógenos humanos, apesar de nenhum dos estágios esquistossomíase retratados no presente protocolo são infectantes aos seres humanos ou outros mamíferos. Segui as políticas institucionais para a manipulação de agentes patogénicos humanos risco grupo 2 (RG2).

Nota: Nós usamos ratos fêmeas Swiss-Webster (6 - semanas de idade) devido à sua maior susc....

Resultados

A grande maioria dos miracidia normalmente será foram coletada os dois primeiros "colheitas". Incubação de miracidia isolado na CBSS + desencadeia o processo de transformação de miracidium-para-sporocyst (Figura 4A- C). Dentro da primeira hora seguinte transferência de cultura poços contendo CBSS +, a maioria dos miracidia cessar natação (Figura 4A). Às 6 h em cultura, miracidia estão ativamente derramamento suas.......

Discussão

Miracidia de S. mansoni, isolado e manipulados conforme descrito aqui, pode infectar somente o host intermediário de caracol e, portanto, não representam um risco biológico humano durante esta fase de desenvolvimento larval. No entanto, para evitar a exposição acidental/infecção de caracóis, tenha cuidado para realizar miracidial isolamentos em um local diferente de áreas onde espécies sensíveis de gênero Biomphalaria podem estar presentes ou mantida. Uma sala separada, registrada como espaço BSL2, é al.......

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
solução salina balanceada de Chernin (CBSS+)			Para 1L de solução
2,8 g de cloreto de sódio	Fisher Scientific	S271-3	Dissolva sais, exceto cloreto de cálcio, e
0,15 g de cloreto de potássio	Açúcares Sigma-Aldrich	P5405	em 800 mL ddH2O
0,07 g de fosfato de sódio, dibásico anidro	Fisher Scientific	S374-500	Dissolva o cloreto de cálcio separadamente em 200
0,45 g de sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma-Aldrich	M1880	mL ddH2O
0.53 g cloreto de cálcio di-hidratado	Mallinckrodt	4160	Adicione lentamente o soln de cálcio ao soln de sal/açúcar com
0,05 g de bicarbonato de sódio	Fisher Scientific	S233-3	com mistura constante
1 g de glicose	MP Biomedicals	152527	Ajuste para pH 7.2 e esterilize por filtro usando um
1 g de trealose	Sigma-Aldrich	T0167	0,22 µ m filtro descartável de garrafa
10 mL 100X penicilina/estreptomicina	Hyclone	SV30010	Adicione penicilina filtrada e sola de estreptomicina; uso prévio
Incompleto Bge  meio (Ibge)			Para solução de 900 mL
220 mL Schneider' s Drosophila meio modificado	Lonza	04-351Q	Misture o meio de Schneider com 680 mL ddH2O
4,5 g de hidrolisado enzimático de lactalbumina	Sigma-Aldrich	L9010	Adicione hidrolisado de lactalbumina e galactose
1,3 g de galactose	Sigma-Aldrich	G0625	Ajuste para pH 7,2 e filtre esterilize usando um 0,22 µ m filtro descartável pré-esterilizado
Meio Bge completo (cBge)			Para 100 mL de solução
90 mL Meio			Para inativar o FBS por calor: Incubar o FBS descongelado em
9 mL de calor inato. soro fetal bovino (FBS) (Optima)	Atlanta Biologicals	S12450	banho-maria a 60° C por 1 hora enquanto suavemente
1 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	girando o frasco a cada 10 min Alíquota FBS inativada por calor em tubos de 15 mL  e armazene a -20 graus Celsius. Misture o meio + FBS e esterilize com filtro usando um 0,22 µ m pré-esterilizado  filtro descartável de tampa de garrafa  Adicione penicilina e estreptomicina antes de usar
Água da lagoa (solução estoque)			1L de solução estoque
12,5 g de carbonato de cálcio	Fisher Scientific	C64-500	Misture todos os sais em 1L de ddH2O
1,25 g de carbonato de magnésio	Fisher Scientific	M27-500	Note que os sais não terão completamente
1,25 g  cloreto de sódio	Fisher Scientific	S271-3	dissolvido.  Agite vigorosamente para suspender
0,25 g  de cloreto de potássio	Sais Sigma-Aldrich	P5405	antes de fazer a sola de trabalho;
Água da lagoa (solução de trabalho)			1,5L de solução
0,8 mL de solução estoque água da lagoa (agite antes do uso) em			Misture o estoque para ddH2O
1500 mL de ddH2O			Esterilize a água da lagoa por autoclave (lento  ciclo)
1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	Adicione penicilina e estreptomicina uso prévio
solução salina (NaCl 1,2%)			1,5L de solução
18 g de cloreto de sódio em 1500 mL de ddH2O	Fisher Scientific	S271-3	para esterilizar
1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	Adicione penicilina e estreptomicina uso prévio
Equipamento e material adicionais:  Câmara de
7-L	Seguindo o protocolo IACUC aprovado nº V001551
Tanque e regulador			poços
	TPP	92424
Frascos
Fonte de luz (150W)	Chiu Tech Corp	Modelo F0-150
Centrífuga, refrigerada, balde oscilante	Eppendorf	Modelo 5810R
Centrífuga garrafas (250 mL)	Tubos
de 15 mL, tubos de transferência descartáveis estéreis	Corning	430053
Estéreis	Fisher Scientific	1371120
0.22 µ M Filtro de Garrafa Descartável Pré-esterilizado	Liquidificador EMD Millipore	SCGPS05RE
Aço inoxidável	Waring Commercial	Model 51BL31
Copo de liquidificador, capacidade de 100 mL	Microscópio
	Nikon Instruments	Eclipse TE300

Bge incompleto Solução salina em autoclave eutanásia de camundongo Ratos Taconic Biosciences Swiss-Webster, fêmea, 6 semanas de idade, murina  de CO placa de cultura de tecidos de 24 volumétricos de 1 L de centrífuga Nalgene composto invertido Waring Commercial