Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para o isolamento de axénica em larga escala e a coleção de miracidia livres de sangue fascíola Schistosoma mansoni e seu posterior processamento para introdução na cultura em vitro .

Resumo

Acasos de sangue humanos, Schistosoma spp., têm um ciclo de vida complexo que envolve as fases do desenvolvimento sexuais e assexuadas dentro de um caracol intermediário e mamífero hospedeiro final, respectivamente. A capacidade de isolar e sustentar os estágios do ciclo de vida diferentes condições em vitro cultura facilitou grandemente as investigações dos mecanismos celulares, bioquímicos e moleculares de regulação, host, desenvolvimento e crescimento do parasita interações. Transmissão da esquistossomose exige reprodução assexuada e o desenvolvimento de múltiplos estágios larvas dentro do anfitrião do caracol; o miracidium infecciosa, através de sporocysts primárias e secundárias, para a fase final do cercarial que é infecciosa para os seres humanos. Neste trabalho apresentamos um protocolo passo a passo para incubação em massa e isolamento de Schistosoma mansoni miracidia de ovos obtidos a partir de fígados de ratos infectados e sua subsequente introdução na cultura em vitro . Prevê-se que o protocolo detalhado irá incentivar novos pesquisadores a participar e ampliar este importante campo de pesquisa esquistossomíase.

Introdução

O ser humano sangue vermes Schistosoma spp., são os agentes causadores da esquistossomose, uma doença tropical negligenciada que afligem um estimado de 230 milhões de pessoas em todo o mundo¹. A espécie mais difundida, Schistosoma mansoni, é geograficamente distribuída na América do Sul, o arquipélago das Caraíbas, o Médio Oriente e de África subsahariana². O ciclo de vida de S. mansonie outros schistosomes, é complexo, envolvendo um mamíferos hospedeiro definitivo e caramujos de água doce do gênero Biomphalaria que servem como hospedeiros intermediários obrigatórios.

Adulto masculino e feminino de S. mansoni verme pares vivem nas veias mesentéricas posteriores de reproduzir o anfitrião dos mamíferos, resultando na liberação de ovos embrionados (óvulos) que se alojaram nas pequenas vênulas da mucosa intestinal. Ovos, em seguida, rompe as paredes dos vasos, migram através do tecido da mucosa e acabaram por inserir o lúmen intestinal onde eles são anulados com as fezes. Quando óvulos digite escotilha de larvas de água doce e livres (miracidia), eles devem, na ordem curta, encontrar um caracol de Biomphalaria apropriado para infectar a fim de continuar seu ciclo de vida. Esse processo de infecção envolve miracidial apego à superfície do corpo exterior o caracol seguido por penetração ativa e entrada da larva no hospedeiro. Logo após a entrada, o miracidium começa a derramar suas placas epidérmicas ciliadas exteriores como forma um sincício que se tornará a nova superfície externa (tegumento) do próximo estágio larval, o sporocyst primário ou mãe. Através de reprodução assexuada, cada sporocyst primário produz e libera uma segunda geração de sporocysts, denominados secundários ou sporocysts filha, que por sua vez, geram e liberar um grande número de fase intramolluscan final, a cercaria³ . Após a fuga do host de caracol, cercárias livres são capazes de anexar a e penetrando diretamente na pele de um humano ou outro hospedeiro adequado mamífera. Com a entrada em seu novo hospedeiro, cercárias transformam-se para a fase de parasitas schistosomula e invadem o sistema vascular. Eles, por sua vez, migraram para o pulmão e depois para a veia hepática onde amadurecem aos vermes adultos, formam pares masculinos e femininos e viajar para as veias mesentéricas para completar seu ciclo de vida.

Intramolluscan de sucesso ou desenvolvimento de "fase de caracol" de schistosomes larvas é essencial para a continuação do ciclo de transmissão humana de host para host. De importância crítica é a seguinte entrada de período do miracidium livres para o host de caracol e a sua transformação precoce à fase primária sporocyst. Dependendo da compatibilidade fisiológica e imunológica entre hospedeiro e parasita, é durante esta fase de desenvolvimento larval esse sucesso inicial ou falha estabelecer infecções é determinado^4,5,6 . Desenvolvimento subsequente de primários sporocysts capazes de produzir assexuadamente sporocysts secundários, o que geram humanos-infectantes cercárias, mais exigem um ambiente de host fisiológicas permissiva que fornece para todo o crescimento do parasita e precisa de reprodutiva.

Até à data, pouco é conhecido sobre a base fisiológica, bioquímica e moleculares processos controlar interações esquistossomíase-caracol, especialmente as moléculas e vias envolveram na regulação da reprodução e desenvolvimento larval, ou modulando respostas imunes de anfitrião. Pronto acesso a um grande número destes estágios larval condições em vitro cultura que permitem a manipulação experimental que iria facilitar muito a descoberta de caminhos do desenvolvimento e os mecanismos subjacentes do crescimento celular, diferenciação e reprodução. Caminhos críticos parasita ou mecanismos, identificados através de experimentos em vitro , poderiam então ser usados para interromper o crescimento larval/reprodução do acolhimento de caracol, ou para identificar mecanismos imunes de anfitrião de caracol envolvidos no reconhecimento e eliminação de estágios miracidial ou sporocyst.

Neste artigo e o vídeo de apresentação, nós fornecemos uma descrição detalhada de um método para isolar um grande número de livres de S. mansoni miracidia para introdução em vitro de cultura que pode ser sujeito a acompanhamento experimental manipulação (ver Figura 1 para uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo). Embora os procedimentos semelhantes têm sido descritos anteriormente^7,8,9, nós sentimos que um protocolo detalhado seria útil para pesquisadores que desejam empregar este modelo para abordar questões ainda sem resposta relacionadas com intramolluscan desenvolvimento larval, proliferação celular e interações imune esquistossomíase-caracol. Além disso, esta abordagem pode facilmente ser adaptada para isolamento de ovos provenientes de outras tremátodes medicamente importantes como bexiga-moradia S. haematobium, solhas de fígado ou acasos de pulmão.

Protocolo

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Wisconsin-Madison, sob protocolo e cuidados institucionais de Animal nenhum. V005717. O seguinte protocolo envolve o trabalho em uma instituição de nível de biossegurança 2 (BSL2) para patógenos humanos, apesar de nenhum dos estágios esquistossomíase retratados no presente protocolo são infectantes aos seres humanos ou outros mamíferos. Segui as políticas institucionais para a manipulação de agentes patogénicos humanos risco grupo 2 (RG2).

Nota: Nós usamos ratos fêmeas Swiss-Webster (6 - semanas de idade) devido à sua maior susceptibilidade à infecção¹⁰, desse modo, produzindo fardos de ovo maiores. Tucker et al descrevem os protocolos de infecção mouse e caracol usados neste modelo sistema¹¹. A Tabela de materiais lista todos os equipamentos específicos, materiais, reagentes e animais fontes necessárias para realizar este protocolo experimental.

1. processamento de fígados infectados

1. Eutanásia em ratos, pós-infecção 6-7 semanas, por asfixia de CO₂ (taxa de 10-30% do volume da câmara por minuto). Monitor de ratos para cessação da respiração e batimento cardíaco.
   Nota: Normalmente, até 20 ratos podem ser transformados em um determinado momento.
2. Após a transferência de ratos sacrificados para uma armário de biossegurança, coloque os ratos em suas costas e pulverizar suas superfícies ventrais com etanol a 70%. Deixe de molho por 1 min.
3. Beliscar e puxar a pele do abdômen inferior e corte em toda a base da pele comprimida mais próximo ao abdômen com uma tesoura cirúrgica estéril. Puxe a pele cortada anteriormente (ou seja, em direção a cabeça) para revelar o fígado. Observe que o fígado deve ser ampliado e salpicado devido a uma reação granulomatosa induzida por ovo (Figura 2A).
4. Remover o fígado e coloque-o em um béquer contendo 200 mL de estéril 1,2% NaCl solução contendo caneta/estreptococos.
5. Repita as etapas de 1.3 e 1.4 com ratos restantes.
   Nota: Vinte ratos geralmente são processados em uma única colheita.
6. Coloque os fígados em uma placa de Petri estéril e remover não-fígado gordo/conjuntivo tecidos com Pinças esterilizadas.
7. Transferi aparadas/limpa fígados para uma garrafa de centrífuga estéril de 250 mL contendo ~ 200 mL de solução de NaCl de 1,2% estéril com caneta/estreptococos.
8. Vigorosamente agitar o frasco que contém os fígados e, usando uma pipeta descartável estéril, remover a excesso superfície espuma/flutuante de detritos. Lentamente, despeje o restante da solução salina em um recipiente ou afundar contendo 1% de cloro (desinfectante).
9. Adicionar ~ 200 mL de solução salina fresca para os fígados e repita o passo 1.8 mais três vezes.

2. fígado isolamento de extração e miracidial

1. Coloque os fígados em um copo pequeno estéril aço inoxidável liquidificador e adicionar ~ 2 mL da solução de NaCl de 1,2% (Figura 2B).
2. Cubra o copo com papel alumínio e uma placa de Petri para evitar derramamentos e misturar por 1 min, alternando-se baixa e alta velocidade (20 s baixa velocidade/10 s alta velocidade; repetir) (Figura 2).
3. Distribua uniformemente a suspensão de fígado misturada em frascos estéreis 250 mL centrífuga (para 20 fígados usam 4 garrafas).
4. Adicione uma solução salina estéril com antibióticos para o volume total de ~ 200 mL/frasco. Peso/equilíbrio garrafas antes da centrifugação.
5. Centrífuga de fígados misturados a 290 x g durante 15 min em 4 ^óC. delicadamente despeje sobrenadantes em um recipiente com água sanitária antes de serem eliminados.
6. Repita os passos de 2.4-2.5 uma vez. Certifique-se de completamente Ressuspender o sedimento fígado antes da centrifugação.
7. Após descartar a última solução salina lavar (passo 2.6), adicionar 200 mL de água estéril lagoa com caneta/estreptococo no tecido hepático peletizadas, shake para Ressuspender o sedimento e a suspensão de transferência para um balão aferido de 1L esterilizado que foi completamente coberto com alumínio folha, exceto a parte superior do pescoço (Figura 2D) de 3 cm.
   Nota: Use duas garrafas (= 10 fígados) por balão 1-L. Água da lagoa simula o ambiente de água doce natural necessário para estimular o miracidial para incubação de ovos.
8. Usando a água da lagoa estéril, encha o balão para cerca de 3 cm acima da folha cobrindo no pescoço. Então, sem demora (como miracidia logo começam a eclodir), retire a espuma residual e flutuando na superfície, pipetando rapidamente até ~ 12 mL de água da lagoa contendo os restos de tecido hepático e descartá-lo em um separado descartar o tubo. Substitua por água fresca lagoa estéril.
9. Repita a limpeza passo 2.8, mais três vezes, verificando a presença de miracidia no tubo de descarte. Cesse a repetição da etapa de limpeza se miracidia aparece na solução de lavagem.
10. Após a última lavagem, adicione lentamente ~ 12 mL de água da lagoa estéril quente (pré aquecida a 30 ^oC) para criar um gradiente de temperatura com água morna limpa e esterilizada por cima.
    Nota: Isto é realizado melhor por descarregando lentamente a água ao longo da lateral do pescoço do frasco para evitar a mistura.
11. Coloque uma pequeno prato de Petri de capa sobre a abertura do frasco e brilhar uma luz brilhante na parte superior do balão acima a capa da folha para iluminar a superfície superior da água.
    Nota: Normalmente, dentro de 5-10 min, natação miracidia, atraído pela luz, irá se concentrar em grandes números dentro o primeiros 2-3 cm de água da lagoa (Figura 3A).

3. Miracidial colheita e cultivo

1. Quando miracidia reuniram-se na superfície após 10min, usando uma pipeta de transferência estéril, remova ~ 8 mL de água da lagoa e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Coloca o tubo contendo miracidia no gelo.
2. Adicionar fundo 8 mL de água estéril quente ao longo do interior do balão volumétrico e esperar mais 10 minutos.
3. Usando novos tubos de cada vez, repita as etapas de 3.1 e 3.2 mais três vezes. Após a coleta de^th 4, mantenha o tubo final no gelo durante 10 minutos permitir que o miracidia resolver. Este conjunto de tubos compreende a primeira colheita.
4. Tubos de centrífuga contendo miracidia a 290 x g por 1 min em 4 ^óC numa centrifugadora refrigerada pre-cooled.
5. Imediatamente remova a maior parte do sobrenadante (~ 7 mL), tomando cuidado para não perturbar a pelota de parasita (Figura 3B).
6. Piscina toda a miracidia desta primeira colheita em um tubo, então Lave todos os tubos originais com água da lagoa estéril ~ 1 mL e adicionar ao tubo de "pool".
7. Permitir que os parasitas que se contentar em gelo ~ 5 min e centrifugue novamente os parasitas a 290 x g por 1 min em 4 ^oC.
8. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e adicionar que 6-8 mL estéril Chernin balanceamento de solução salina (CBSS +; ver tabela de materiais) contendo caneta/estreptococos.
9. Suspenda suavemente o miracidia e alíquota-los em uma placa de cultura de 24 poços (1 mL por bem), seguido de lavagem do tubo em 6-8 mL CBSS + e adicionar 1 mL de lavagem a cada poço. Incube os parasitas em 26 ^oC sob condições normoxic. Concentrações de miracidia isolado irão variar, mas geralmente média ~ 7000/mL.
10. Se parasitas ainda estão se concentrando na fonte luminosa, repita os passos 3.1 a 3.9 para continuar a colheita final-incubação miracidia mas aumentar o intervalo de tempo entre coleções de 15-20 min.
    Nota: Este novo conjunto de tubos representa a segunda colheita. No entanto, porque os números de miracidial normalmente são baixos, as larvas de todos os tubos normalmente são agrupadas em uma única cultura bem contendo 2 mL CBSS +.
11. Em 24h pós-colheita e cultivo, Ressuspender delicadamente sporocysts em seus poços pipetando.
12. Espere alguns minutos para permitir que os parasitas resolver no fundo dos poços. Uma vez que eles se instalaram, remova cuidadosamente o sobrenadante (~1.5 mL), que irá conter a maioria das placas ciliadas epidérmicas derramadas por miracidia durante transformação larval. Essa "transformação" sobrenadante pode ser descartada ou incorporada em estudos de seguimento de produtos secretoras larvas.
13. Adicione 1,5 mL de CBSS fresco + para cada bem e delicadamente pipeta para Ressuspender sporocysts. Repita a etapa 3.12 se desejar ainda mais lavagem ou mudar para um meio diferente.

Resultados

A grande maioria dos miracidia normalmente será foram coletada os dois primeiros "colheitas". Incubação de miracidia isolado na CBSS + desencadeia o processo de transformação de miracidium-para-sporocyst (Figura 4A- C). Dentro da primeira hora seguinte transferência de cultura poços contendo CBSS +, a maioria dos miracidia cessar natação (Figura 4A). Às 6 h em cultura, miracidia estão ativamente derramamento suas...

Discussão

Miracidia de S. mansoni, isolado e manipulados conforme descrito aqui, pode infectar somente o host intermediário de caracol e, portanto, não representam um risco biológico humano durante esta fase de desenvolvimento larval. No entanto, para evitar a exposição acidental/infecção de caracóis, tenha cuidado para realizar miracidial isolamentos em um local diferente de áreas onde espécies sensíveis de gênero Biomphalaria podem estar presentes ou mantida. Uma sala separada, registrada como espaço BSL2, é al...

Materiais

₂

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
solução salina balanceada de Chernin (CBSS+)			Para 1L de solução
2,8 g de cloreto de sódio	Fisher Scientific	S271-3	Dissolva sais, exceto cloreto de cálcio, e
0,15 g de cloreto de potássio	Açúcares Sigma-Aldrich	P5405	em 800 mL ddH2O
0,07 g de fosfato de sódio, dibásico anidro	Fisher Scientific	S374-500	Dissolva o cloreto de cálcio separadamente em 200
0,45 g de sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma-Aldrich	M1880	mL ddH2O
0.53 g cloreto de cálcio di-hidratado	Mallinckrodt	4160	Adicione lentamente o soln de cálcio ao soln de sal/açúcar com
0,05 g de bicarbonato de sódio	Fisher Scientific	S233-3	com mistura constante
1 g de glicose	MP Biomedicals	152527	Ajuste para pH 7.2 e esterilize por filtro usando um
1 g de trealose	Sigma-Aldrich	T0167	0,22 µ m filtro descartável de garrafa
10 mL 100X penicilina/estreptomicina	Hyclone	SV30010	Adicione penicilina filtrada e sola de estreptomicina; uso prévio
Incompleto Bge  meio (Ibge)			Para solução de 900 mL
220 mL Schneider' s Drosophila meio modificado	Lonza	04-351Q	Misture o meio de Schneider com 680 mL ddH2O
4,5 g de hidrolisado enzimático de lactalbumina	Sigma-Aldrich	L9010	Adicione hidrolisado de lactalbumina e galactose
1,3 g de galactose	Sigma-Aldrich	G0625	Ajuste para pH 7,2 e filtre esterilize usando um 0,22 µ m filtro descartável pré-esterilizado
Meio Bge completo (cBge)			Para 100 mL de solução
90 mL Meio			Para inativar o FBS por calor: Incubar o FBS descongelado em
9 mL de calor inato. soro fetal bovino (FBS) (Optima)	Atlanta Biologicals	S12450	banho-maria a 60° C por 1 hora enquanto suavemente
1 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	girando o frasco a cada 10 min Alíquota FBS inativada por calor em tubos de 15 mL  e armazene a -20 graus Celsius. Misture o meio + FBS e esterilize com filtro usando um 0,22 µ m pré-esterilizado  filtro descartável de tampa de garrafa  Adicione penicilina e estreptomicina antes de usar
Água da lagoa (solução estoque)			1L de solução estoque
12,5 g de carbonato de cálcio	Fisher Scientific	C64-500	Misture todos os sais em 1L de ddH2O
1,25 g de carbonato de magnésio	Fisher Scientific	M27-500	Note que os sais não terão completamente
1,25 g  cloreto de sódio	Fisher Scientific	S271-3	dissolvido.  Agite vigorosamente para suspender
0,25 g  de cloreto de potássio	Sais Sigma-Aldrich	P5405	antes de fazer a sola de trabalho;
Água da lagoa (solução de trabalho)			1,5L de solução
0,8 mL de solução estoque água da lagoa (agite antes do uso) em			Misture o estoque para ddH2O
1500 mL de ddH2O			Esterilize a água da lagoa por autoclave (lento  ciclo)
1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	Adicione penicilina e estreptomicina uso prévio
solução salina (NaCl 1,2%)			1,5L de solução
18 g de cloreto de sódio em 1500 mL de ddH2O	Fisher Scientific	S271-3	para esterilizar
1,5 mL de penicilina/estreptomicina 100X	Hyclone	SV30010	Adicione penicilina e estreptomicina uso prévio
Equipamento e material adicionais:  Câmara de
7-L	Seguindo o protocolo IACUC aprovado nº V001551
Tanque e regulador			poços
	TPP	92424
Frascos
Fonte de luz (150W)	Chiu Tech Corp	Modelo F0-150
Centrífuga, refrigerada, balde oscilante	Eppendorf	Modelo 5810R
Centrífuga garrafas (250 mL)	Tubos
de 15 mL, tubos de transferência descartáveis estéreis	Corning	430053
Estéreis	Fisher Scientific	1371120
0.22 µ M Filtro de Garrafa Descartável Pré-esterilizado	Liquidificador EMD Millipore	SCGPS05RE
Aço inoxidável	Waring Commercial	Model 51BL31
Copo de liquidificador, capacidade de 100 mL	Microscópio
	Nikon Instruments	Eclipse TE300

Bge incompleto Solução salina em autoclave eutanásia de camundongo Ratos Taconic Biosciences Swiss-Webster, fêmea, 6 semanas de idade, murina  de CO placa de cultura de tecidos de 24 volumétricos de 1 L de centrífuga Nalgene composto invertido Waring Commercial