Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).
Abstract
טכניקת RT-מהר היא רגיש במבחנה פריון תא ללא הגברה assay בהתבסס בעיקר על הזריעה misfolding צבירה של פריון רקומביננטי לסובסטרט חלבון (PrP) באמצעות זרעים פריון כתבנית עבור ההמרה. RT-מהר היא טכניקה תפוקה גבוהה חדשניים אשר הוא אנלוגי לאופרטור תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (PCR). זיהוי של צמיחה עמילואיד fibril מבוסס על לצבוע Thioflavin T, אשר שזוהר על אינטראקציה מסוימת עם חלבונים עשיר ᵦ-גיליונות. לפיכך, היווצרות עמילואיד יכול להתגלות בזמן אמת. אנחנו ניסה לפתח אמין לא פולשנית לעבור בדיקה לגילוי כרונית prions המחלה (CWD) מבזבז את תמצית צואה. כאן, אנחנו במפורש הסתגלו הטכניקה RT-מהר כדי לחשוף PrPSc זריעה פעילות צואה של CWD נגוע cervids. בתחילה, הפעילות זריעה של תמציות צואה הכנו היה נמוך יחסית ב- RT-מהר, כנראה עקב פוטנציאליים מעכבי assay בחומר צואה. כדי לשפר את פעילות זריעה של צואה תמציות ולהסיר מעכבי assay פוטנציאליים, אנחנו הומוגני דגימות צואה במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. הגשנו גם את הדוגמאות כדי מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc על בסיס חלבון משקעים באמצעות חומצה phosphotungstic נתרן, ואת כוח צנטריפוגלי. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר שכלל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי. לכן, הקמנו פרוטוקול גילוי רגיש של פריון CWD זריעה פעילות צואה של ניסויים פרה-קליניים ומחקרים קליניים cervids מאת RT-מהר, אשר יכול להיות כלי שימושי לאבחון CWD לא פולשנית.
Introduction
פריון מחלות או מדבקות spongiform encephalopathies (TSE) הן הפרעות ניווניות כולל מחלת קרויצפלד - יעקב (מחלת קרויצפלד-. יעקב) בבני אדם, ספגת המוח (BSE), בקר, scrapie כבשים, עיזים, ואת מבזבז כרונית המחלה (CWD) cervids 1,2. TSEs מאופיינים במראה ייחודי spongiform ואובדן של נוירונים במוח. על-פי ההנחה "חלבון בלבד", prions מורכבים בעיקר PrPSc ('Sc' עבור scrapie) 3, isoform misfolded החלבון מקודד מארח את הסלולר פריון, PrPC. PrPSc נובעת ההמרה של PrPC לתוך קונפורמציה מועשר בגליונות ᵦ 4,5,6 אשר יכול לשמש זרע לאגד, להמיר מולקולות אחרות PrPC . מולקולות PrPSc החדש שנוצר משולבים גדל פולימר 7,8 אשר פורץ oligomers קטנים יותר, וכתוצאה מכך מספר גבוה יותר של גרעינים זיהומיות. PrPSc נוטה צבירת והיא עמידה חלקית פרוטאזות 9,10.
CWD משפיע על אייל מעובדים הפראית (Cervus קנדית), אייל פרדי שחור זנב (האייל hemionus), אייל פרדי לבן זנב (WTD; האייל virginianus), מוס (Alces alces), איילים (Rangifer tarandus ב tarandus ב) 11,12,13. היא נחשבת למחלה מדבקת ביותר פריון עם העברה אופקית המועדף על ידי אינטראקציות cervid והתמדה סביבתי של 14,infectivity15. שלא כמו מחלות אחרות פריון איפה PrPSc הצטברות ו infectivity מרותקים אל המוח, ב- CWD אלה מצויים גם רקמות היקפיים של נוזלי הגוף למשל רוק, שתן, צואה 16,17, 18.
אימונוהיסטוכימיה נחשב תקן הזהב לאבחון CWD לזהות PrPSc הפצה ו- spongiform נגעים 19,20. אליסה במקרים נדירים יותר, תספיג המשמשות גם עבור אבחון CWD. לכן, אבחון מחלת פריון הנוכחי מתבסס בעיקר על זיהוי prions ברקמות פוסט-מורטם. המוות. אבחנה CWD זמין על ידי לקיחת השקדים או ביופסיות recto-אנאלי רירית הקשורים רקמת הלימפה (RAMALT); עם זאת, הליך זה הוא פולשני ודורש לכידתו של בעלי החיים. לפיכך, השימוש של דגימות נגיש בקלות, כגון שתן וצואה, תהיה דרך מעשית לזיהוי פריון CWD. עם זאת, הנמל הפרשות האלה נמוך יחסית ריכוזי prions מתחת לגבול זיהוי של שיטות אבחון הנוכחי. כתוצאה מכך, נדרש יותר רגיש וגבוה תפוקה של כלי אבחון. במבחנה המרת מערכות, כגון חלבון misfolding הגברה מחזורית assay (PMCA) 21, עמילואיד זריעה assay, בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר) assay 22,23, 24 הם כלי רב עוצמה כדי לנצל היכולת שמתרבה של PrPSc לחקות במבחנה את תהליך ההמרה של פריון, ובכך להגביר את הנוכחות של כמויות זעירות של PrPSc לרמות לזיהוי 25 ,26. שיטת RT-מהר, עם זאת, מנצל העובדה כי המוצר ההמרה מועשר בβ-גיליון מבנה שניוני באפשרותך לאגוד במיוחד thioflavin T (ה-T). לכן, PrP רקומביננטי (rPrP) בעת הזריעה ההמרה גדל לתוך הסיבים עמילואיד אשר לאגד את ה-T, לכן ניתן להבחין בזמן אמת באמצעות מדידה של זריחה של ה-T לבטא יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) לאורך זמן. ברגע תחת פיקוח, RFU יכול לשמש כדי להעריך היחסי זריעה, ופעילויות פרמטרים כמותיים כגון שלב ההשהיה. השלב לג מייצג את הזמן (h) הנדרש כדי להגיע לסף, במהלך rPrP אשר המרה בשלב מוקדם של התגובה הוא מתחת לגבול זיהוי של ה-T זריחה. בסוף שלב ההשהיה לכאורה, והמצוות להיווצרות של גרעין עמילואיד מספיקות (התגרענות/התארכות), מתרחש כאשר קרינה פלואורסצנטית ה-T חורג רמת הסף הופך להיות חיובי. הצמיחה של עמילואיד הסיבים יכול להתגלות בזמן אמת, PrP הראשוניתSc או זריעה פעילות הכלולים במדגם מוגבר על ידי פילוח אשר מפיק יותר זרעים. זרעים אלה לגרום בתורו שלב מעריכי מהירה של סיבי עמילואיד צמיחה.
כי זה וזמינותו הוא מסוגל לזהות המתחילים 1 fg PrPSc 24, רגישות גבוהה מסמיך בטכניקה זו כדי להשיג את ההימור המוות או אבחון פולשני על ידי גילוי PrPSc שונים רקמות היקפיים, הפרשות או השני סוגים של הדגימה מחסה רמות נמוכות של infectivity. RT-מהר בהחלט מספק יתרונות אחרים מבחני שלו הפארמצבטית, פרקטיות, במהירות (פחות מ- 50 h), עלויות נמוכות בהשוואה bioassays. זה מונע את המורכבות הטכנית כגון sonication בשימוש PMCA; בנוסף, זה מתבצע ב- microplate הקלטת אטום אשר ממזער את הסיכון של זיהום תרסיס של כל טוב. התבנית מרובת טוב המאפשרת הניתוח של דוגמאות עד 96 אותו ניסוי. כדי לסתור את הבעיה חוזרים ונשנים של תוצאות חיוביות שגויות והמרה ספונטנית של rPrP ב מבחני הגיור במבחנה המימוש של סף (ניתוק) ב- RT-מהר הוא מאוד שימושי. אכן, על סמך התוצאות של הפקד שלילי (ממוצע RFU של דגימות שליליות +5 SD 27), תוכנית בסיסית מוגדר שממנו ניתן לעשות אפליה בין דוגמאות חיוביות ושליליות. השימוש של משכפל 4 עבור כל דגימה כך יכול לסייע להגדרת מדגם חיוביים כאשר לפחות 50% של משכפל הצג סימן חיובי, כלומר לחצות את ניתוק 28. הומולוגיה בין הזרע לבין המצע לא נדרש ב- RT-מהר, כמו למשל במחקר הקודם, אוגר rPrP נמצאה להיות מצע רגיש יותר בהשוואה המצע הומולוגי ב PrP האנושיvCJD נזרע הצאן scrapie נזרע תגובות 29. rPrP chimeric אוגר-כבשים הוצעה גם להיות מצע מתאים היטב יותר מאשר rPrP האנושית לזהות האנושית variant מחלת קרויצפלד-יעקב prions 30. לפיכך, השימוש rPrP סובסטרטים של מינים שונים נפוץ מאוד בזה וזמינותו. Assay זו הוחלה בהצלחה מספר מחלות פריון, כמו "טפטוף" מחלת קרויצפלד-יעקב 31,32,33, מהדור השניפריון etic מחלות 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36, CWD 38,39,40,41, 42. מחקרים באמצעות עיבוד נוזל מוחי שדרתי, דם, רוק, שתן כמו זרעים ב RT-מהר היו כולן מוצלחות כדי לזהות PrPSc 38,39,40,41, 42. לטפח את יכולת זיהוי בדגימות כמו פלזמה שעשויים להכיל מעכבי היווצרות עמילואיד, Orrú et al. (2011) פיתחה אסטרטגיה כדי להסיר מעכבי פוטנציאל היווצרות עמילואיד בסירוק שלב immunoprecipitation (IP) PrPSc ו- RT-QuIC, בשם assay "משופרת QuIC" (eQuIC). בנוסף, צעד החלפת המצע הועסק לאחר ~ 24 שעות של זמן התגובה על מנת לשפר את הרגישות. בסופו של דבר, כמו נמוך כמו 1 ag של PrPSc היה ניתן לגילוי על ידי eQuIC, 30.
על מנת לטהר צואה תמציות ולהסיר assay אפשרי מעכבי בצואה, דגימות צואה שנאסף בשלבים קליניות אייל על זיהום אוראלי ניסיוני היו הומוגני במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. צואה תמציות נוספות הוגשו מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc הדגימות ניצול החלבון משקעים באמצעות סודיום phosphotungstic חומצה (NaPTA) משקעים. שיטת משקעים NaPTA, תיאר לראשונה על ידי צפר. et al. 43, משמש להיכנס למצב של ריכוז PrPSc הבדיקה דוגמאות. הדגירה של NaPTA עם תוצאות המדגם בכמות המשקעים מועדף PrPSc ולא PrPC. עם זאת, מנגנון מולקולרי הוא עדיין לא ברור. שלב זה סייע המכיל ומונעים את ההמרה ספונטנית של rPrP, אשר נצפית במקרים מסוימים. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר באמצעות העכבר rPrP (aa 23-231) כמו מצע, כולל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי.
התוצאות כאן מדגימים כי שיטה משופרת זו ניתן לזהות ריכוזים נמוכים מאוד של CWD prions ומגביר את הרגישות של זיהוי וספציפיות דגימות צואה בהשוואה פרוטוקול ללא החלפה משקעים, המצע NaPTA. שיטה זו פוטנציאל שניתן להחיל על רקמות ו נוזלי גוף אחרים, יכול להיות תועלת רבה למעקב CWD ב cervids בשבי הפראית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. החומר הצואתי באמצעות RT-מהר
homogenate- הכנת cervid צואה תמציות
- לעשות צואה על-ידי הוספת 1 g של החומר הצואתי 10 מ"ל של צואה לחלץ מאגר (20 מ מ סודיום פוספט, pH 7.1, 130 מ מ NaCl. 0.05% Tween 20, 1 מ PMSF ו- 1 x להשלים מעכבי פרוטאז, נטולת EDTA) לתת ריכוז סופי של 10% (w/v). המאגר המגון יכול להיות מוכן לפני הניצול ומאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס
- Homogenize כדורי צואה (1 גרם), מאגר (10 מ"ל) בצינורות (למשל, gentleMACS ז. צינורות) באמצעות dissociator עם תוכנית מוגדר מראש של היצרן עבור חלבונים עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה פי שניים או שלושה ובודקים דגימות צואה הם לגמרי במאגר.
- לאטום את הצינורות עם מצלמות-מיקרוסקופים ומניחים אותם על גבי מטרף פלטפורמה או רוטרי נדנדה עבור דגירה 1 h בטמפרטורת החדר.
- Centrifuge הצינורות-g x 18,000 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאסוף supernatants אשר מכילים החלבון תמציות, aliquot אותם לתוך 1.5 mL צינורות. Aliquots שניתן לאחסן ב- 80 ° C עבור יישומים נוספים-
- ריכוז של PrP Sc בצואה תמציות
הערה: כדי להתרכז CWD prions הדגימות תמצית צואה, ובכך שיפור הרגישות של זיהוי מאת RT-מהר, צעד משקעים חלבון נוסף בפרוטוקול.- NaPTA משקעים שיטת
- להוסיף 250 µL של 10% (w/v) N-לאוריל sarcosinate (sarkosyl) עד 1 מ"ל של חלבון בצואה לחלץ לתת ריכוז הסופי של sarkosyl של 2% (v/v).
- חותם הצינורות אשר מכילים את הדגימות עם מצלמות-מיקרוסקופים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת טלטול מתמיד ב- 1400 סל ד ב thermomixer.
- להתאים את התמהיל של תמצית חלבון בצואה, sarkosyl עם פתרון מניות המכיל 10% (w/v) של חומצה phosphotungstic נתרן ו- 170 מ מ מגנזיום כלוריד, pH 7.4 בריכוז הסופי של 0.3% (w/v) נתרן חומצה phosphotungstic הדגימות.
- דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עם טלטול מתמיד ב- 400 סל ד.
- Centrifuge הדגימות ב 14 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב- 15,800 x g... להסיר את supernatants בזהירות.
- לרחוץ את כדורי מאת resuspending אותם במאגר לשטוף (10 מ מ טריס-קלרנית, pH 7.5, 100 מ מ NaCl, 0.5% טריטון-X 100, 10 מ מ EDTA, 0.5% נתרן deoxycholate (w/v) ו- 0.1% sarkosyl (w/v)).
- Centrifuge הדגימות ב 14 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ב- 15,800 x g... להסיר את supernatants בזהירות.
- Resuspend כדורי ב- 100 µL (1/10 של אמצעי האחסון המקורי של החלבון צואה לחלץ) מאגר דילול RT-מהר.
הערה: RT-מהר מאגר דילול (20 מ מ סודיום פוספט, pH 6.9, 130 מ מ NaCl, 0.1% מרחביות (w/v) ו- 1 X N2 השלמה) מוכן לפני הניצול. הנפח הכולל של 10 מ"ל הוא מסונן דרך מסנן מזרק acrodisc 0.2 µm באמצעות מזרק ולאחר מכן מאוחסן ב-20 ° C עד שימוש. - לאחסן את הדגימות NaPTA שטופלו ב-20 ° C עד ניצול אותם ב- assay RT-מהר.
- Assay RT-מהר
- להכין פתרון מניות טריים 10 מ מ ה-T (0.032 g של ה-T ב- 10 מ"ל כפול מזוקקים H 2 O).
- לגרום לדילול 1:10 של ה-T פתרון מניות כפול מזוקקים H 2 O כדי להפוך ריכוז סופי של ה-T של 1 מ מ את המסנן זה באמצעות מזרק acrodisc 0.2 µm סינון באמצעות מזרק.
- הפשרת העכבר רקומביננטי PrP (rPrP, א. א. 23-231) המצע (10 µg/mL לכל תגובה RT-מהר) המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס על קרח
- µL 500 עומס של המצע rPrP בכל פעם לתוך 100 kDa גודל אי-הכללה של מסנן microtubes, צנטריפוגה ב 14,000 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (צינור/מסנן אחד יכול לשמש עד שתי פעמים).
- להעביר את המצע eluted לתוך צינור mL 1.5 סטרילי ולשמור אותו ב 4 ° C עד שימוש.
- מאגר דילול להפשיר RT-מהר המאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס מאגר דילול
- להפוך דילולים של הזרע (תמצית חלבון בצואה) ב- RT-מהר:
מדגם מדולל: להשתמש את תמצית חלבון בצואה מדולל
מדולל 2 x 10 -1
מדולל 2 x 10 -2
מדולל 2 x 10 -3 - להכין מלאי פתרונות RT-מהר תערובת התגובה:
באגירה פוספט (מלוחים PBS): 5 X
NaCl: 2 מ' במניה תמיסת NaCl המבושלות זוגי מזוקקים H 2 O.
EDTA: 100 מ מ מניות תמיסת EDTA המבושלות כפול מזוקקים H 2 O. - לפני ניצול של כל הפתרונות (שלב 1.3.8), לסנן את כל הפתרונות בנפרד דרך מסנן מזרק acrodisc 0.2 µm באמצעות מזרק ולשמור אותם סטרילי בטמפרטורת החדר.
- להכין את הנפח הכולל של תערובת התגובה RT-מהר לפי מספר דוגמאות (µL 98, עוצמת התגובה לדגימה וארבעה משכפל עבור דגימה) כדי לשמש פלוס 10% של אמצעי אחסון זה, ודא שיש מספיק תערובת על כל התגובות.
- שימוש צינור 15 מ"ל להכין לתערובת התגובה RT-מהר (20 מ מ סודיום פוספט, pH 6.9, 300 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 10 מיקרומטר Th-T 10 המצע rPrP µg/mL, מים מזוקקים כפול כדי להתאים את הריכוז הסופי של rPrP בעקבות התגובות) באמצעות את סול במלאי utions.
- לערבב כל הפתרונות היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה עם טיפ מסנן. יש להימנע ככל הניתן משימוש בחומרי מערבולת.
- שופכים את התערובת לתוך מאגר pipetting חד פעמי 50 מ ל.
- השתמש פיפטה רב-ערוצי כדי לטעון µL 98 תערובת התגובה RT-מהר לתוך כל טוב של צלחת התחתון אופטי 96-ובכן.
- להוסיף לכל µL RT-מהר התגובה 2 של מדולל או תמצית 10-fold חלבון בצואה מדולל באופן סדרתי. מבחן כל מדגם משכפל ארבע.
הערה: ניסוי, דילולים טורי של דגימות צואה (ועד מדולל 2 x 10 -3) מתוך CWD-שלילי וחיות CWD-חיוביות מאומת משמשים בפקדים שליליים או חיוביים, בהתאמה. - לאטום את הצלחת עם קלטת איטום לפני המקננת ב קורא צלחת ב 42 ° C עבור 25 קמ"ש עם מחזורים חוזרים ונשנים של 1 דקות כפול מסלולית רועד (700 סל ד) ו- 1 דקות מנוחה במהלך הדגירה.
- קבע פלורסצנטיות מדידה הגדרות:
עירור: 450 nm
פליטה: 480 ננומטר
התחתונה לקרוא, מספר הבזקים: 20
רווח ידני: 1000 (תלוי במכונה)
הזמן אינטגרציה: 20 µs - הסר את לוחית מהקורא את הצלחת בסוף ה 25
- ספין למטה הצלחת ב 3000 g x למשך 3 דקות למנוע זיהום פוטנציאלי בין הבארות.
- להסיר את החותם הצלחת.
- להכין צלחת 96-ובכן חדשה על-ידי הוספת µL 90 של RT-מהר התגובה תערובת המכילה מצע טרי, טרי פלורסצנטיות לצבוע את ה-T כמתואר בסעיף 1.3.1 כדי 1.3.6.
- µL להעביר 10 מכל קידוח של צלחת הראשונה היה מוכן לאחרונה צלחת טוב.
- לאטום את המשטח החדש והמשך וזמינותו RT-מהר על זובידאת נוספים, השלבים המתוארים שלב 1.3.13. זה צעד נוסף זובידאת יהפכו את זמן התגובה הכולל של ה 75
הערה: כל ההליכים של RT-מהר assay נעשים תחת אבטחה ארון- - לאסוף את הנתונים.
- לקריאה ולתעד האות פלורסצנטיות ה-T של כל טוב כל 15 דקות
- לאסוף נתונים הכולל מחזורים באמצעות ניתוח נתונים ותוכנה העברת לתוך גיליון אלקטרוני עם הממוצע של תגובות quadruplicate.
- להתוות את הממוצעים של נתונים. ציר ה-x תואם לזמן התגובה של RT-מהר (h), ציר ה-y תואם יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU). כל עקומה מתאים לדילול מדגם ידוע.
- ניסוי, לגדור לסף מסוים על-ידי חישוב הערכים רשע הגבוהה של הפקד שלילי פלוס סטיות תקן 5 כפי שמתואר הנוכחית לאור ספרות 41.
הערה: כל מעתיק אשר חצה את הסף שהוגדרו נחשבים חיוביים. אם לפחות שניים מתוך ארבעת משכפל לחצות את הסף, המדגם ואז נחשב חיובי.
2. טיהור של חלבון רקומביננטי פריון (rPrP)
- הצמיחה של מניות חיידקי הביטוי של rPrP
הערה: Escherichia coli (e. coli) זן רוזטה (DE3) הפך בקידוד pET-24 וקטור העכבר PrP (שאריות 23-231) נעשה שימוש כדי להכין את rPrP.- להפשיר גליצרול מלאי של רוזטה (DE3) הפך עם חיית המחמד-24 mPrP(23-231) על קרח
- פס ליברות (לוריא Bertani) צלחות עם ריכוז סופי של kanamycin של µg 50/mL, דגירה בין לילה בחממה 37 ° C. ודא כי הלוחיות הן הפוך כדי למנוע לחות עיבוי בתקשורת מוצק המכיל החיידקים. להכין שתי צלחות, לוודא כי לפחות לאחד שתי צלחות צמיחה.
- להכין 1 L של LB והחיטוי כדי להצליח סטרילי.
- תוספת 1 L סטרילי המדיה ליברות עם 1 מ ל kanamycin (50 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל כלוראמפניקול (34 מ"ג/מ"ל).
- לבחור מושבה אחת של כל צלחת באמצעות לולאה חיסון חד פעמיות כדי לחסן 3 מ"ל של מדיום LB המכילה kanamycin, כלורמפניקול.
- המקום מיני-תרבויות באינקובטור ב 37 ° C עם טלטול מתמיד ב- rpm 225 עבור 5-6 ח'
- להוסיף המיני-התרבויות לשאר l 1 המקורי של מדיה LB יחד עם מערכת Autoinduction אקספרס 1 עבור אינדוקציה של ביטוי חלבון.
- המקום התרבות ב 2 ל' מבחנה או גדול יותר, בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם טלטול מתמיד ב- rpm 200 עבור 20-24 ח'
- לפצל את תרבות 1 ליטר 4 x 250 מל צנטריפוגה צינורות.
- ספין לטמיון המכיל את התרבות ב 3,750 g x עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את תגובת שיקוע, לאסוף את כדורי חיידקי צינורות צנטריפוגה 50 מ ל, לאחר מכן להקפיא אותם ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף. כדורי וכתוצאה מכך שקל 3 עד 4 g עבור תשואה חלבון טוב.
- הכנה של הגוף הכללה
- להפשיר בגדר קפואים (3-4 גרם) ב 37 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות.
- והפשרה שוב של הקפאת בגדר שוב 10 דקות ב-80 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה של הקפאה והפשרה פעמיים נוספות של.
- Resuspend בגדר חיידקי 1 X ריאגנט פירוק (למשל מיקס מאסטר BugBuster) על ידי pipetting ביסודיות. השתמש 5 מיליליטר הכימית 1g של גלולה חיידקי. הקפד לגמרי homogenize את המיקס.
- דגירה של homogenate על כיסא נדנדה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- Centrifuge את homogenate ב g 16,000 x עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את supernatants על ידי בקפידה למזוג הנהגים
- Homogenize כדורי בהיקף 1 X פירוק ריאגנט משמש בשלב הקודם אותו.
- דגירה את homogenate למשך 15 דקות על כיסא נדנדה בטמפרטורת החדר.
- להוסיף נפח מספיק של 1:10 (0.1 x) פירוק ריאגנט כדי לקבל נפח homogenate סך של 40 מ ל. מיקס על ידי היפוך כדי לוודא homogenize טוב.
- Centrifuge את homogenate ב g x 7,900 למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- למחוק את תגובת שיקוע על ידי בקפידה לשפוך את זה
- Resuspend בגדר ב- 40 מ"ל של 0.1 x פירוק ריאגנט.
- Centrifuge את homogenate ב g x 16,000 למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- למחוק את תגובת שיקוע בקפידה על ידי למזוג ולאחסן את גלולה המכילה את הגופות הכללה ב-20 ° C עד עיבוד נוסף-
- חלבון טיהור
- להפשיר את הגופות הכללה בטמפרטורת החדר.
- לפזר את הגופות הכללה המופשרים 14 מ ל ז 8 guanidine-HCl (38 גרם הידרוכלוריד Guanidine ב 0.1 M נאפו 4 pH 8.0 ולמלא הבולם עם H 2 O ל- 50 מ ל; לא להתאים את ה-pH-הפתרון הסופי) כדי solubilize חלבונים.
- הקפד homogenize היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- Incubate lysate על כיסא נדנדה בטמפרטורת החדר במשך 50 דק
- 18 להכין g של שרף Ni-נ חרוזים (18 גרם עבור צניפה חיידקי 3 עד 4 g); לשטוף אותם עם 100 מ של מים באמצעות אבק ומסנן 100 מ ל 0.22 מיקרומטר בקבוק העליון.
- למקם את 18 גרם Ni-נ שרף חרוזים בצינור 50 מ ל, להוסיף נפח מספיק של denaturing מאגר (100 מ מ סודיום פוספט, 10 מ מ טריס, pH 8.0, 6 מ' guanidine הידרוכלוריד, pH 8) כדי להפוך את אמצעי האחסון הסופית עד 50 מ ל.
- Equilibrate את החרוזים במאגר denaturing למשך 50 דקות על כיסא נדנדה בטמפרטורת החדר.
- Centrifuge הגוף הכללה lysate ב g 16,000 x עבור 5 דקות כדי להסיר את הלכלוך לא מסיסים.
- להוסיף את תגובת שיקוע החרוזים equilibrated וזורקים כדורי.
- לערבב לשים כיסא נדנדה למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר מחייב חלבון שרף Ni-נ. ת.
הערה: חרוזים chelate ניקל משמשות לטיהור PrP שלו זיקה ניקל. האזור עשיר היסטידין N-מסוף PrP רינדור של זיקה nickel(II), אשר מאפשר החלבון לאגד ניקל יונים ללא כל שלו-תג. - FPLC לשטוף עם מים כדי לנקות את שני הקווים (A ו- B).
- הפעל מאגר denaturing (100 מ מ סודיום פוספט, 10 מ מ טריס, pH 8.0, 6 מ' guanidine הידרוכלוריד, pH 8) דרך שני הקווים (A ו- B) לשפר את המערכת (העמודה עדיין לא מצורפת.)
- טען השרף על עמודה. לוודא למזער את בועות האוויר.
- לצרף את העמודה FPLC וברח מעבר צבע ליניארי מ 100% denaturing מאגר A ו- 0% של מאגר refolding B (100 מ מ סודיום פוספט, 10 מ מ טריס, pH 8.0) בהתחלה על 0% denaturing מאגר ל- 100% refolding מאגר עד הסוף. שינוי הדרגתי זה מנוהל בספיקה של 0.75 mL/min 240 דקות, יש צורך קיפול נאותה של PrP-
הערה: במהלך תהליך טיהור כרומטוגרפי, PrP denatured זה קודם לאט refolded על השרף על-ידי החלת מעבר צבע ליניארי של מאגר refolding להחליף את מאגר denaturing. שלב זה מסיר גם את ה-chaotropic guanidine-HCl. - ודא מאגר refolding 100% ממשיך לזרום דרך העמודה עבור נוספת 30 דקות ב- 0.75 מ ל לדקה
- שטיפה קו A עם מים ואחריו • תנאי מאגר (100 מ מ סודיום פוספט, 10 מ מ טריס, 500 מ מ imidazole, pH 5.8) לעקוף את העמודה. זה ינקה את המאגר denaturing אשר הוחלף כעת על-ידי המאגר • תנאי במערכת אקטע.
- Elute חלבון ב- 2 מ ל/דקה על-ידי הפעלת מעבר צבע ליניארי עבור 40 דקות מ 100% refolding מאגר B ו- 0% • תנאי מאגר א בהתחלה על 0% refolding מאגר ומאגר • תנאי 100%-
הערה: הריכוז הגבוה של imidazole במאגר • תנאי יתחרו PrP ' s מחייב nickel(II). הפסגה החלבון העיקרי אמור להתחיל elute כ 1/3 של הדרך דרך מעבר הצבע.- לצפות chromatogram עבור יתר 280 ננומטר להגדיל.
- לאסוף רק הצינורות המכילים החלבון במרכז הפסגה גדול.
הערה: שברים eluted של 2 מ ל כל אחד נאספים לתוך צינורות 15 mL- - לדלל את החלבון הכלול הצינורות מייד עם נפח כ 1/3 (1 מ"ל) מאגר דיאליזה (10 מ מ סודיום פוספט, pH 5.8).
- מיד מקום הצינורות על קרח
- מאגר החלבון eluted הכלול הצינורות.
- המסכן החלבון לתוך דיאליזה קלטות (משקל מולקולרי ניתוק 10 kDa).
- הקלטות מאגר צוננת טרום דיאליזה (3.6 L) עבור 2 h ב 4 ° C, ואז להעביר את הקלטות לתוך מאגר טרייה דיאליזה (3.6 L) נלון. להפוך בטוח כי המאגר דיאליזה נמצא תחת עצבנות מתמדת.
- סינון חלבון לאחר דיאליזה דרך מסנן מזרק acrodisc 0.2 µm באמצעות מזרק.
- מודדים את ריכוז חלבון באמצעות ערכת וזמינותו של חלבון BCA-
- תרכיז או לדלל במידת הצורך להתאים את ריכוז חלבון 0.3 mg/mL-
הערה: לאשר את טוהר על ידי עמודים מרחביות וכחול Coomassie מכתים. - Aliquots 1 מ"ל של חלבון microcentrifuge צינורות ולבצע מיד לאחסן ב- 80 ° C עד להמשך השימוש כמפורט בפרוטוקול RT-מהר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמציות צואה CWD מוכן ב-10% (w/v) הצליחו זרע התגובה RT-מהר, אך הרגישות של זיהוי היה נמוך 27. באמצעות מאגר ספציפי עבור המגון צואה היה צעד קריטי כדי להימנע רקע זריחה ב- RT-מהר תגובות והמצוות לשימוש בעכבר rPrP המצע במקום rPrP הצבאים אשר אפשרה להגיע ספציפי יותר תוצאות 27. תוספת המשקעים NaPTA מופחת המרה ספונטנית של rPrP ב RT-מהר (איור 1) ללא עיכוב הגברה של הפעילות זריעה של התגובות (איור 2). למרות הגברה טובה יותר נצפתה על טיפול NaPTA, וכתוצאה מכך אותות זריחה של דגימות צואה CWD-חיוביות היו עדיין נמוך (איור 1). בנוסף, הגברה פריון של דגימות להגיע אל מישור קבוע ברמות קרינה פלואורסצנטית נמוכה. אפשרות זו מציינת את הרוויה של תגובות, אשר יכול לנבוע ההשפלה/דנטורציה של rPrP או היווצרות של אגרגטים חופש-מסלול אשר צורכים את הבריכה rPrP 30. עוד לשפר ההגברה של prions ולשפר את הרגישות של זיהוי, צעד החלפת המצע סופחה בפרוטוקול. המבוא של החלפת המצע בפרוטוקול RT-מהר (איור 2) את הרגישות מוגברת (77%; 14 מתוך 18 דגימות ב RT-מהר היו חיוביות) וספציפיות (100%; אף אחד הפקדים שלילי לחיובי פנתה RT-מהר) של זיהוי (ראה טבלה 1 מ נג. et al. 27). לבסוף, כל הצעדים הללו (איור 3) הוביל אופטימיזציה של פרוטוקול אמין ורגיש RT-מהר גילוי של prions CWD, באמצעות הדגימה המכילה רמות נמוכות של infectivity.
החלפת המצע הונהג אחרי ה 25 הראשון של התגובה RT-מהר, על ידי חידוש התגובה מאגר המכיל מצע טרי טרי פלורסצנטיות לצבוע Th-טי על ידי הצגת השלב החלפת המצע בפרוטוקול, הורחב וזמן התגובה RT-מהר מ 50 h 75 h. כפי שמוצג באיור 2 עם שילוב של החלפת המצע, שיפור משמעותי של הגברה הפריון נצפתה.
איור 1: מופחת המרה ספונטנית של העכבר המצע rPrP ב RT-מהר נזרע עם מטוהרים CWD-שלילי צואה homogenate. Homogenates צואה של אייל לבריא (C181-006) או לצבי היו הומוגני במאגר תמצית צואה הסופי בריכוז של 10% (w/v). לטיהור, אלה homogenates צואה היו מעובדים, 10 פעמים מרוכז על ידי משקעים NaPTA. ולזרימה צואה homogenates (), טפסים NaPTA טהור ומרוכז (b) מדולל כמצוין שימשו זרע quadruplicate תגובות RT-מהר עם העכבר rPrP כמו מצע. Y-axes הצג יחידות קרינה פלואורסצנטית Th-T יחסית, ש-x-axes מתארים את זמן התגובה. ירידה של המרות ספונטנית נראתה מטוהר NaPTA דגימות צואה (b). הנתונים המשמשים מ נג. et al. 27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. זיהוי משופרת של CWD prions בצואה להשתמש בתחליף המצע. Homogenates צואה של אייל בודדים (C051-05, C052-05) נגוע אורלית CWD prions היו מטוהרים, מרוכז על ידי משקעים NaPTA. דגימות שטופלו NaPTA היו מדולל בין 2 x 10-1 עד 2 x 10-3 נהגו תגובות RT-מהר quadruplicate זרע עם העכבר rPrP סובסטרט. RT-מהר וזמינותו בוצעה ללא סובסטרט החלפה () בפרק זמן קבוע של 50 h או עם שילוב של החלפת המצע עבור תקופת דגירה ממושכת של 75 h (b). על האחרון, החלפת המצע הונהג אחרי ה 25 הראשון של התגובה RT-מהר. תשעים אחוז של אמצעי האחסון התגובה היה הוסר והוחלף הטרי תערובת התגובה RT-מהר המכילות מצע rPrP ואת ה-טי על ידי הצגת השלב החלפת המצע בפרוטוקול, וזמן התגובה RT-מהר הורחב מ 50 h ה 75 הנתונים המשמשים מ נג. et al. 27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תרשים זרימה המתאר PrPSc . מן cervids נגועה CWD החילוץ צואה, זריעה הגברה פעילות של פריון באמצעות RT-מהר assay. דגימות צואה של בעלי חיים נגועים CWD הם הומוגני במאגר החילוץ צואה, נאספו לשיטה משקעים NaPTA ונבדק על ידי assay RT-מהר. האחרון בוצע על ידי החדרת צעד החלפת המצע. שילוב של NaPTA, המצע החלפת שלבים הביא לירידה של המרה ספונטנית ובשיפור חזקה זריעה הגברה פעילות של פריון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RT-מהר קודם לכן הועסק לזהות CWD prions שתן ותמציות צואה של אייל פרדי לבן זנב, אייל פרדי שחור זנב דרך הפה הנגוע 38. מערכת שמוצג בכתב היד היא שיטה מותאם וזמינותו RT-מהר. צעדים נוספים אוחדו וזמינותו RT-מהר "הקלאסי" כדי לשפר את זיהוי ואת הרגישות של וזמינותו עבור CWD prions בחומר צואה של חיות נגועות.
הרגישות הנמוכה של זיהוי צואה תמציות הובילו אותנו לשיפור של פרוטוקול RT-מהר. כדי להשיג זיהוי רגיש במבחנה של prions בצואה, נוספו שלבים קריטיים עבור הכנת הדוגמא על מנת להסיר רכיבים אשר להפריע ההמרה פריון ו/או הפצת ולשפר את רמת הרגישות של זיהוי. שילוב החלפת המצע בפרוטוקול של RT-מהר וטיפול NaPTA/sarkosyl היה קריטי לגילוי פעילות זריעה וקליני נגועה CWD אייל, ולשם שיפור לגבולות זיהוי של הגיור פריון צואה תמציות .
משקעים NaPTA היא טכניקה נפוצה מלווה בדרך כלל sarkosyl החילוץ לבודד ולרכז PrPSc לרמה לזיהוי. NaPTA ידוע רצוי לזרז PrPSc על PrPג 43 בעוד sarkosyl הוא חומר ניקוי ידוע כדי להקל על פריון ההמרה בריכוזים נמוכים ב- מערכת חופשית תא 44. יישור עם זה, באמצעות שילוב של NaPTA ו- sarkosyl עשוי להפיק תשואה גבוהה יותר של אגרגטים fibrillar במבחנה כפי שמוצג לפני 45,46,47. מתודולוגיה זו שולבו בעבר assay RT-מהר כדי לזהות היקפיים CWD prions בהצלחה הדגימה כגון רוק מטוהרים 39 ו דם מלא 40. המחקר שלנו מספק הוכחה ראשונה כי שילוב טיהור NaPTA/sarkosyl בפרוטוקול של הכנת הדוגמא צואה מאפשרת גילוי פריון CWD מאת RT-מהר. יתר על כן, עם מתודולוגיה זו הצלחנו להפחית המרה ספונטנית של המצע rPrP ב CWD-שלילי homogenates צואה ב assay RT-מהר.
הוצע מנגנון אפשרי להסביר את ההשפעה של החלפת המצע 30. הסיבוב הראשון של התגובה (לפני התוספת של מצע טרי), רק כמות קטנה של זרעים מתווסף תגובות RT-מהר. בעוד רק על חלק rPrP הוא שולב התגובות הזריעה, שאר המצע יכול גם לשמש על ידי אינטראקציה עם הקירות של התגובה בארות צלחת על טופס שאינו עמילואיד אגרגטים, או להשתנות לצורה שבה פחות נוטה להיות מומר על ידי רואה מוצרים ded RT-מהר יותר את הזרעים המקוריים. כתוצאה מכך, שיעור התאגדות rPrP לזרעים הוא איטי, ואינו היווצרות fibril לזיהוי בשלב השהיה. כמו המוצרים RT-מהר הזריעה גדל בשלב לג בסופו של דבר הם מוארכים להגיע "שלב הרכבה מהירה" prions יכול להיות תוספת מוגבר במהירות על ידי פילוח באמצעות טלטול או לרוחב של אגרגטים קטנים יותר. בשלב זה, המצע טריים להוספה התגובה נכללת ברצון המוצרים הזריעה במקום להרכיב אגרגטים לא ספציפי. שילוב של הצעד החלפת המצע פרוטוקול שלנו היה שינוי רגישות; מוגברת זה היה שימושי לזהות זרעים פריון בדגימות עם כמות נמוכה מאוד של PrPSc חיות פרה-קליניים ו/או המכילים תרכובות מעכבות.
שימוש assay RT-מהר יותר מאשר PMCA, אשר היא הראשונה במבחנה החלבון misfolding assay הגברה תיאר 21, יש מספר יתרונות. ב- PMCA הצינורות מתפשט, sonicated בתוך אמבט המים הנכלל את sonicator; הצינורות הממוקמים בפריפריה של sonicator הצג פחות יעילות של הגברה בהשוואה הצינורות בכיוון מרכז 48. RT-מהר מערכת רועד מפחד נראה קל יותר לשליטה. השימוש של תבנית טוב 96 הוא יתרון אמיתי של RT-מהר, עם זאת, מגה-PMCA שפותחה על ידי. Moudjo et al. 49 , 50, הראה יתרונות דומים אך עדיין פחות משתמשים ב- PMCA.
כמו המצע, RT-מהר משתמשת rPrP רקומביננטי לגיור; לעומת זאת, PMCA ברוב המקרים נעשה שימוש homogenate מוח נורמלי. בנוסף, ב- RT-מהר ללא לרצף הומולוגיה נדרש בין 51–של זרעים ו המצע-53.
הנוכחות של cofactors הוא הכרחי עבור שכפול פריון ב PMCA והוא ובמוצר זיהומיות. עם זאת, assay RT-מהר, PrP מוגבר אינה מדבקת. במבחנה הגברה מבחני המופע של תגובות חיוביות שווא ככל הנראה בגלל המרה ספונטנית של PrPC הוא לבעיה חוזרת. לכן, assay ואת התנאים בהם נעשה שימוש במחקר זה היו מותאם כדי למזער הפרעות כאלה כדי למקסם את ההבדל בין rPrP הזריעה-המרה והמרה ספונטנית.
לסיכום, הטיפול NaPTA/sarkosyl מאפשר הסרה של מעכבי assay בצואה ומקטינה את ההמרה ספונטנית. מעניין, הטיפול לא ה"בלתי פעילות זריעה של precipitatedPrPSc. בנוסף, הרגישות של זיהוי היה משמעותי משופרת בעת החלפת המצע אומצה/ת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה ד ר ביירון Caughey (NIH מעבדות הר סלעי) עבור מספקים את פלסמיד חיידקי הביטוי PrP cervid והדרכה. SG נתמך על-ידי התוכנית קנדה מחקר הכיסא. אנו להכיר מימון למחקר זה ס ג מן הגנום קנדה, אלברטה פריון מכון מחקר, אלברטה לחקלאות ויערנות דרך הגנום אלברטה, מאוניברסיטת קלגרי לתמיכה עבודה זו. אנו להכיר במענק מחקר של הקרן גאן מרגרט לחקר בעלי חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
References
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
- Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
- Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
- Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
- Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
- Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
- Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
- Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
- Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
- Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
- Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
- Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
- Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
- Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
- Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
- Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
- Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
- Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
- Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
- Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
- Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
- Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
- Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
- Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
- Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
- John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
- Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
- Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
- Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
- Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
- Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
- Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
- Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
- Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
- Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
- Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
- Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
- Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
