Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Summary

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Abstract

Nas células-alvo rara podem ser isoladas de um fundo elevado de células não-alvo, usando anticorpos específicos para proteínas de superfície das células alvo. Um método recentemente desenvolvido utiliza um fio médico acrescido com células antiadesão epiteliais molécula (EpCAM) anticorpos específicos na vivo isolamento circulantes de tumor de células (CTC)¹. Uma coorte de paciente-combinadas em câncer de próstata metastático-não mostrou que a técnica de isolamento na vivo resultou em uma maior percentagem de pacientes positivos para CTC, bem como a maior contagem de CTC, em comparação com o atual padrão-ouro na enumeração de CTC. Como células não podem ser recuperadas de dispositivos médicos atuais, um novo fio funcionalizado (referido como dispositivo) foi fabricado que permite a captura e subsequente desprendimento de células por tratamento enzimático. As células são permitidas para anexar ao dispositivo, visualizada em um microscópio e desanexado usando tratamento enzimático. Células recuperadas são citocentrifugados em slides membrana revestida e colhidas individualmente por meio do laser microdissection ou micromanipulação. Monocelulares amostras são então submetidas a amplificação do genoma inteiro de célula única permitindo análise múltipla a jusante, incluindo abordagens de triagem e destino-específicos. O procedimento de isolamento e recuperação produz alta qualidade DNA de células únicas e não afecte a amplificação do genoma inteiro subsequente (WGA). DNA amplificado de uma única célula pode ser encaminhado para triagem e/ou alvo de análise tais como hibridação de matriz comparativa do genoma (matriz-CGH) ou arranjar em sequência. O dispositivo permite ex vivo isolamento de amostras de células raras artificial (ou seja, 500 células alvo cravadas em 5 mL de sangue periférico). Considerando que taxas de desprendimento de células são aceitável (50-90%), a taxa de recuperação de células destacadas em slides abrange uma ampla gama de dependente da linhagem celular usada (< 10 - > 50%) e precisa de mais atenção. Este dispositivo não é liberado para o uso em pacientes.

Introduction

Recentemente, CellCollector DC01, um médico fio acrescido com anticorpos anti-EpCAM para isolar o CTC de sangue periférico de pacientes com câncer, foi adicionado ao espectro metódico de CTC enumeração^1,2,3 . Em um estudo atualmente em curso no câncer de próstata não-metastático, este fio funcionalizado relata quase duas vezes mais pacientes para ser positivo de CTC e maior CTC conta em pacientes de CTC-positivos em comparação com o CellSearch, o padrão-ouro na enumeração CTC³ . Devido a esse desempenho animador, isolamento de células de um fio funcionalizado médica para análise de célula única seria desejável, mas tratamento enzimático com soluções de desprendimento de células (por exemplo, a tripsina), nem do laser microdissection permite a recuperação de células intactas (dados não mostrados).

Para permitir o desprendimento de células capturadas, uma nova geração de fios funcionalizados foi equipada com um polímero específico. Este polímero, que liga os anticorpos de captura para o fio, é suscetível a um tratamento de tampão de lançamento permitindo o desprendimento de células intactas (CellCollector DC03 referido como dispositivo). O novo dispositivo funcionalizado, permite o isolamento das células-alvo de diferentes concentrações de célula linha as células cancerosas cravadas em albumina de soro bovino (BSA) / tampão fosfato salino (PBS) e sangue periférico, respectivamente.

Para facilitar a detecção visual de células no dispositivo e após a recuperação, as células cancerosas do alvo são rotuladas com carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) e uma mancha de DNA antes do tratamento de recuperação (i. e. carregamento e desanexação). Efeitos do tratamento sobre a qualidade do DNA de células únicas anteriormente foram avaliados após o WGA por meio de um controle de qualidade do PCR^4,5, matriz-CGH^6,7 e alvo de sequenciamento⁷ não mostrando nenhuma diferença em comparação com células não-tratados micromanipulated de célula suspensões⁷. A vantagem deste método reside na combinação de pre-enriquecimento raro-célula-alvo e a recuperação de células para análise a jusante de célula única (Figura 1). O dispositivo de recolha com rótulo CE na vivo atual é usado geralmente para enumeração de CTC, ao invés de caracterização molecular de célula única^2,8. No entanto, uma análise mais abrangente para investigar a heterogeneidade entre CTC tempo para análise a nível de célula individual (ou seja, alvejado de sequenciamento no nível de célula única). Outros métodos baseados em células baseiam-se na Fima isolamento do CTC EpCAM-positivo e manipulação de célula única baseada em Dieletroforese para posterior análise genética molecular^9,10. Caracterização molecular do CTC é um requisito importante para a sua aplicação útil em um ambiente clínico e é igualmente importante na investigação de base da cascata metastática. Paralelamente à CTC, DNA de tumor circulantes (ctDNA) tornou-se de grande importância pois permite a análise de DNA dos encargos tumor com procedimentos de isolamento técnico mínimo^11,12. As abordagens de célula com base podem servir como uma contribuição complementar pois permite RNA^13,14 e proteína¹⁵ análise da expressão e também para CTC derivado da célula culturas ou xenografts^{16, 17}. embora obstáculos como célula baixa recuperação e autorização para o uso em pacientes ainda precisam ser superados, o método de captura e libertação leva um importante passo na próxima para caracterização das células-alvo rara.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética da universidade médica de Graz (25-240 ex 12/13). Sangue periférico para cravação experimentos foi amostrado de indivíduos saudáveis.

Nota: Este protocolo descreve o isolamento de células HT-29 (linha humana de célula câncer cólon) de PBS ou de misturas artificiais de células HT-29 e sangue periférico. O mesmo experimento foi realizado com duas linhas de células adicionais (LNCaP e capnografia, dados experimentais nos resultados do representante) e teoricamente pode ser executado com todas as células expressando EpCAM.

1. preparação das células alvo

1. Cultura celular e rotulagem de células
   Nota: No presente protocolo, as células são cultivadas em frascos de cultura de 75 cm ². Por favor, ajustar as quantidades de reagentes de acordo se forem utilizados outros dispositivos de cultura de células (por exemplo, os pratos de cultura 25 cm ², placas 6-poços, etc.). Todos os líquidos usados são pré aquecidos a 37 ° C em banho-maria. Se não indicação em contrário, todas as etapas do protocolo são realizadas à temperatura ambiente (RT).
   1. Células de cultura HT-29 em 5a modificado suplementado McCoy com 2 mM L-glutamina, 20 mM Hepes, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera 5% CO₂ .
   2. Quando as células são 90% de confluencia, remover o meio e enxágue as células com 10 mL de 1X PBS.
   3. Para colher células, adicionar 2 mL da solução de desprendimento de células (tabela de materiais e reagentes) para as células e incube as celulas por aproximadamente 5 min a 37 ° C.
      Nota: A solução de desprendimento contém proteolíticas e collagenolytic enzimas em 1X PBS, o ácido 0,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e vermelho de fenol 3 mg/L. Reduzir o tempo de pré-aquecimento da solução de desprendimento de células ao mínimo, como isso vai ser inativo após 1 h a 37 ° C. Cubra a camada de células inteiras para obter o desprendimento de célula ideal.
   4. Verifica o desprendimento de células usando um microscópio invertido.
   5. Transfira todos desanexadas células para um tubo de 50ml pré-carregadas com 10 mL de meio de cultura celular (o mesmo que usou na etapa 1.1.1.) e ressuspender as células pipetando.
   6. Coloque a restante suspensão de células em um misturador horizontal do rolo no RT e prossiga para a etapa de rotulagem.
2. Vivo celular rotulagem das células-alvo
   1. Diluir 1 µ l de 5mm CFSE (fornecido em dimetilsulfóxido, DMSO) em 1 mL de 1X PBS pré aquecido a 37 ° C para obter a solução de 5 µM ready-to-use CFSE rotulagem.
      Nota: Para obter melhores resultados de coloração, use soluções preparadas.
   2. Preparar uma ready-to-use coloração solução do ADN (tabela de materiais e reagentes) em PBS 1x e armazená-lo em 2-6 ° C, protegido da luz.
      Nota: Para obter melhores resultados de coloração, use soluções preparadas.
   3. As células do misturador horizontal do rolo (etapa 1.1.6.) e pelota que as células a 300 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de 1X PBS.
   4. Enxagúe as células mais uma vez com PBS 1x e ressuspender as células em solução de rotulagem CFSE de ready-to-use da 500 µ l.
   5. Incubar as células a 37 ° C por 15 min e recolher as células após centrifugação a 300 x g durante 3 minutos.
   6. Ressuspender as células marcadas em 1 mL de meio de cultura celular previamente aquecido e permitir que as células regenerar a 37 ° C por 30 min.
   7. Recolher as células por centrifugação a 300 x g durante 3 min e ressuspender as pelotas de células em 1 mL de DNA de ready-to-use, manchando a 37 ° C por 10 min.
   8. As células de Pelotas, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 4 mL de 1X PBS. Avaliar a densidade celular usando um hemocytometer e verificação de rotulagem de fluorescência usando um microscópio de fluorescência equipados com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e isotiocianato de fluoresceína filtros (FITC) (Figura 2A e 2E).
   9. Centrifugar as células em 300 x g durante 3 min e ressuspender as células de acordo com as densidades de células necessárias para a respectiva experiência como dado na próxima seção e lugar no gelo.

2. o cabo de carregamento

Nota: As células podem ser isoladas de alvo celular/periférico sangue spikings à escala mililitro ou fornecendo o baixo número de células em uma escala de microlitro. Considerando que a primeira abordagem permite imitando condição rara-celular no sangue periférico, este último pode ser a maneira preferencial para anexar algumas células para fins de ensaio/otimização de protocolo.

1. O fio usando um grande volume de suspensões celulares de carregamento
   1. Prepare um 2% BSA obstrui a solução dissolvendo-se 0,8 g de BSA em 40 mL de 1X PBS (uso de cultura de células). Dissolva o BSA num Vortex inicial e posterior incubação a RT em um misturador horizontal do rolo para 10-20 min.
   2. Enxágue vazio EDTA de sódio tubos heparina tubos com 2 mL de 2% de BSA para remover resíduos de anticoagulante e descartar a solução. Bloquear a superfície do tubo por incubação a RT com 5 mL de 2% BSA em um misturador horizontal do rolo a 15 rpm por 30 min e descartar a solução.
   3. Diluir as células rotuladas (seção 1.2.) para uma densidade de 100 000 células/ml e usar 5 mL para cobrar o fio.
   4. Adicione 5 mL de suspensão de célula rotulados (de 500 000 células no total) para o tubo. Evite bolhas quando adicionando a suspensão de eritrócitos.
   5. Retire o fio do compartimento de armazenagem, bem como a tampa de borracha, segurando o fio e enxaguá-lo em 1X PBS (Figura 3).
   6. Penetrar a tampa do tubo de borracha do tubo EDTA (etapa 2.1.4.) com a ajuda de uma agulha de seringa (20G) e insira o fio, de tal forma que a parte funcional está totalmente imerso na suspensão de célula quando a tampa é volta sobre o tubo e o tubo colocada na mesa de mixagem de rolo inclinado.
      Nota: A parte funcional triple-helicoidal do fio deve ser coberta com suspensão de células durante o carregamento.
   7. Gire os tubos em um misturador de rolo inclinado a 5 rpm durante 30 min permitir que as células anexar ao fio.
   8. Passe o fio com 5 mL 1X PBS e armazená-lo no escuro a 2-6 ° C em um tubo de 15 mL contendo 1X PBS até exame visual.
      Nota: A parte funcional do fio sempre deve ser submersa em PBS para evitar danificar as células.
2. Isolar as células alvo de misturas artificiais com sangue periférico (alternativa método para de carregamento: 2.1. O fio usando um grande volume de suspensões celulares de carregamento)
   1. Diluir as células rotuladas (seção 1.2.) para obter suspensões celulares com densidade de pilha alta (> 1 000 000 células/mL), assim, mantendo o volume da suspensão de células adicionado ao sangue periférico baixa.
   2. Adicionar 500 para 500 000 células de 5 mL de sangue periférico e misturá-los por inversão do tubo.
   3. Retire o fio do compartimento de arrumação, retire a tampa de borracha segurando o fio e enxaguá-lo em 1X PBS.
   4. Penetra uma nova tampa do tubo com a parte não-funcional do dispositivo usando uma agulha de seringa (20G) tal que a parte funcional está totalmente imerso no sangue cravado quando a tampa é volta sobre o tubo e o tubo colocada na mesa de mixagem de rolo inclinado.
      Nota: A parte funcional triple-helicoidal do fio deve ser coberta com suspensão de células durante o carregamento.
   5. Incubar o tubo sobre o misturador de rolos inclinado a 5 rpm durante 30 min à RT
   6. Enxágue o fio 3 vezes em PBS 1x e armazená-lo no escuro em um tubo de 15 mL contendo 1X PBS até exame visual.
      Nota: A parte funcional do fio deve ser sempre submersa para evitar danificar as células.
3. O fio de suspensões celulares de baixo volume de carga (alternativa método para de carregamento: 2.1. O fio usando um grande volume de suspensões celulares de carregamento)
   1. Ressuspender as células marcadas no 1 000 000 células/mL de 1X PBS.
   2. Consertar um copo descartável de 150 mm pipeta Pasteur horizontalmente em um rack.
   3. Retire o fio do compartimento de arrumação, mas mantenha a tampa de borracha amarelo segurando o fio.
   4. Coloque o fio na pipeta, tal que a parte funcionalizada situa-se na ponta da pipeta Pasteur não tocar no vidro.
      Nota: A ponta do fio não deve ficar fora a ponta da pipeta Pasteur. Evite conectar a extremidade posterior da ponta da pipeta Pasteur com a tampa de borracha, segurando o fio. Se anexado firme, suspensões celulares não podem ser carregadas do outro lado para a ponta da pipeta.
   5. Carrega 15 µ l de suspensão de células para a ponta da pipeta Pasteur cobrindo a parte funcionalizada do fio.
   6. Incube o fio de 10 min. manualmente quarto de volta a ponta da pipeta fio montado/Pasteur cada minuto.
   7. Retire o fio da ponta de uma pipeta Pasteur, enxágue-o em 5 mL de 1X PBS e armazená-lo no escuro a 2-6 ° C em um tubo de 15 mL contendo 1X PBS até exame visual.
      Nota: A parte funcional sempre deve ser submersa em 1X PBS para evitar danificar as células.

3. contagem de células no fio

Nota: Sempre manter a parte funcional do fio submergida em 1X PBS para evitar danificar as células.

1. Use uma caneta de graxa para desenhar uma área retangular em uma lâmina de vidro e adicione 500 µ l de PBS 1x.
2. Dobre a parte não-funcional do fio e coloque-o sobre a lâmina de vidro tal que a parte funcional está imerso em 1X PBS.
   Nota: Ajuste a área do retângulo e volume de 1X PBS para cobrir completamente a parte funcional do fio. Use uma fita adesiva dupla face para montar a parte não-funcional do fio no slide.
3. Inspecione visualmente os dois lados do fio para enumerar as células capturadas (Figura 2B e 2F).
   Nota: A presença de células é determinada usando um microscópio de fluorescência, equipado com filtros para DAPI e FITC. Ambos os lados do fio podem ser inspecionados e o número de células ou avaliados (para números de celular alta) ou contados (só viável se baixos números de células são anexados ao fio). Esta etapa pode ser ignorada se a enumeração de células não é necessária.
4. Após a digitalização, coloque o fio de volta no tubo de 15 mL contendo a PBS 1x (ver nota de 2.3.6. e seção 3.), armazená-lo o fio no escuro.
   Nota: A maioria da parte não-funcional do fio pode ser cortados (incluindo a curva) e removido suavização de armazenamento.

4. desprendimento e recuperação das células alvo

Nota: O desprendimento das células será feito dentro de 4 h após o isolamento.

1. Dissolver 4 mg de componente de reserva o lançamento (tabela de materiais e reagentes) por mL de 1X PBS e filtrar a solução através de 0,2 µm filtro estéril para obter o tampão de ready-to-use.
   Nota: O polímero do fio é composto de um hidrogel que é acrescido com anticorpos anti-EpCAM, permitindo a ligação a células apresentadoras EpCAM do alvo. O buffer de lançamento contém uma enzima proteolítica de carbono-oxigênio capaz de fendendo o hidrogel. Clivagem proteolítica resulta na degradação do polímero e, assim, desprendimento de células capturados.
2. Pré-aquecer o buffer de lançamento a 37 ° C por 5 min.
3. Adicione 1,6 mL de tampão de liberação para encher um tubo de reação de 1,5 mL.
   Nota: Projetados para volumes de reação de 1,5 mL de tubos permitem aplicação de 1,6 mL que é necessário para submergir a parte funcional do fio.
4. Incube a parte funcional do fio no buffer de lançamento a 37 ° C (banho-maria) por 20 min. Use a tampa de borracha que acompanha o fio em vez da tampa do tubo para fixar o fio no tubo de 1,5 mL, para evitar a contaminação durante a incubação em banho-maria.
5. Transferi o conjunto de fio/tubo para uma coqueteleira em RT e 500 rpm por 15 min.
   Nota: O agitador tem uma órbita de 1,5 mm.
6. Colocar o conjunto de fio/tubo em uma centrífuga e girá-lo em 300 x g durante 10 minutos.
7. Retire o fio do tubo, fechar a tampa e centrifugar o tubo novo em 300 x g durante 10 minutos.
   Nota: O fio pode ser armazenado em PBS 1x 2-6 ° c no escuro para a célula contagem avaliar destacamento eficiência/seleção para as células restantes no fio.
8. Para reduzir o volume da suspensão celular, remover todos, mas 100 µ l (micromanipulação) ou alternativamente 300 µ l (citocentrifugação e subsequentes do laser microdissection) do líquido sobrenadante e imediatamente proceder à amostragem de célula única.

5. célula única amostragem

1. Micromanipulação
   Nota: Células únicas serão adicionadas a 2 µ l do mix de mestre de lise celular permitindo WGA. Prepare a mistura principal de acordo com o número de células a ser processada, calcular volumes extras para perda devido a pipetagem lugar célula lise mestre mistura e no gelo.
   1. Prepare a célula lise mestre mistura (componentes do kit do WGA, tabela de materiais e reagentes) de acordo com o protocolo descrito por Czyż et al.¹⁸. Brevemente, misturar 2,0 µ l de tampão de reação, 1,3 µ l de octylphenoxypolyethoxyethanol (10% solução), 1,3 µ l de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenoglicol (10% solução), 2,6 µ l de uma solução de proteinase K e µ l 12.8 RNase/DNase livre água para obter uma mistura de mestre para 10 amostras (volume total 20 µ l).
      Nota: Para obter mais exemplos, aumente o volume conformemente. A composição da mistura de mestre lise celular difere da utilizada no procedimento alternativo utilizando amostras de microdissection do laser (ver 5.2).
   2. Use uma caneta de graxa para desenhar uma área segurando a suspensão de células no lugar. Ajustar a área e o volume se a densidade celular é muito alta (i. e. marcar uma área maior do slide de vidro, 1X PBS e uma alíquota de suspensão de células de carga).
   3. Pipete a suspensão de toda a célula manchada (obtida na etapa 4.8.) a lâmina de vidro.
   4. Transferi a lâmina de vidro para microscópio equipado com um micromanipulador. Deixe que as células se contentar com 5 min (Figura 2D e 2h).
   5. Prepare-se 0,2 mL da polimerase carregada com 2,0 µ l do mestre de lise celular mistura (veja etapa 5.1.1.) e armazená-lo no gelo.
   6. Coletar células únicas em 1 µ l de PBS 1x usando o micromanipulador e transferir as células para um tubo contendo a mistura de mestre da lise celular.
      Nota: Para a transferência de células micromanipulated para o buffer de lise celular colocar o capilar diretamente na 2 µ l de solução de Lise e ejetar até que as bolhas podem ser vistas.
   7. Brevemente, girar a amostra a 2000 x g por 3 s usando uma desktop microcentrífuga para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo. Coloca as amostras no gelo.
   8. Proceder diretamente à célula única WGA (ver secção 6. e Czyż et al ¹⁹).
2. Microdissection do laser (método de amostragem de célula única alternativa para: 5.1. Micromanipulação)
   Nota: A composição da mistura mestre usada nesta seção difere daquele usado na secção 5.1 para micromanipulação. Células únicas serão adicionadas a 4,5 µ l do mix mestre do lise celular (componentes do kit do WGA, tabela de materiais e reagentes) para WGA.
   1. Preparar a mistura de mestre de lise celular segundo Czyż et al ¹⁹ misturando 5,0 µ l de tampão de reação, 1,3 µ l de octylphenoxypolyethoxyethanol (10% solução), 1,3 µ l de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenoglicol (10% solução), resp., 2,6 µ l de uma solução de proteinase K e 34,8 µ l de RNase / Livre de DNase água para obter uma mistura de mestre para 10 amostras (volume total 45 µ l). Coloque a mistura de mestre no gelo.
      Nota: Para obter mais exemplos, aumente o volume conformemente.
   2. Slides de membrana revestida de UV-tratamento adequado para o laser microdissection. Portanto, coloque os slides em um DNA Cruz dispositivo vinculador e expor aos raios UV mais alto por cerca de 10 min.
   3. Monte o slide de membrana revestida em um cytocentrifuge e cytospin a suspensão de toda a célula a 300 x g por 5 min.
      Nota: Quando utilizar o sistema em líquido, onde as células são citocentrifugados para o slide em solução, remover o sobrenadante após citocentrifugação e aplicar um seco-gire a 1140 x g por 1 min.
   4. Diretamente proceda Microdissection do laser ou deixar o cytospins secar ao ar durante a noite e congelar as amostras a-20 º C para o armazenamento de longo prazo.
   5. Pipete 4,5 µ l de mistura de mestre lise celular na tampa de um tubo PCR de 0,2 mL e colher células simples por meio do laser microdissection.
   6. Recuperar o tubo do PCR do microscópio de microdissection do laser e fechar o tubo. Recolher todo o líquido na parte inferior do tubo pela curta-spin e coloque a amostra no gelo.
   7. Prosseguir com a única célula WGA ou armazenar as amostras isoladas a-80 ° C por até 1 mês antes de processamento adicional.

6. adaptador-linker com base de ^18,de amplificação do genoma inteiro¹⁹

Nota: Certifique-se de que todas as misturas de mestre necessárias (componentes do kit do WGA, tabela de materiais e reagentes) são preparadas e armazenadas no gelo pronto para usar. Mestre misturas incluem a mistura de digestão de DNA 1 para micromanipulated (ver 5.1) amostras (contendo 2,0 µ l de tampão de reação, 2,0 µ l de Mseeu enzima de restrição e 16,0 µ l de RNase/DNase livre água) ou digestão de DNA misturar 2 para o laser microdissection (ver 5.2). amostras (contendo 2,5 µ l de Mseenzima de restrição e 2,5 µ l de RNase/DNase-livre de água), pre-recozimento mix mestre (contendo 5,0 µ l de tampão de reação e 5,0 µ l de cada um dos adaptadores de PCR preannealing 15,0 µ l de RNase/DNase-livre de água), ligadura mistura de mestre (contendo 30,0 µ l de 10,0 µ l T4 ligase solution, solução de trifosfato de adenosina 10,0 µ l e adaptadores PCR pre-recozidos) e mestre de PCR primária misturam (contendo 30,0 µ l de um buffer PCR, 20,0 µ l da solução de mistura de deoxynucleotide de 10 mM, 10,0 µ l de um polymerase mistura e 340.0 µ l de RNase/DNase-livre de água). Todos os volumes são dadas para a preparação de 10 amostras. Ajustar de acordo com o número de amostras.

1. Por lise celular, colocar as amostras de microdissection micromanipulated/laser em um termociclador e execute lise de célula única incubando a célula a 42 ° C por 45 min, 65 ° C por 30 min e 80 ° C por 10 min.
   Nota: Use um termociclador com uma tampa aquecida. Lysis da pilha podem ser feito O/N para 10 a 15 h. Nesse caso, omitir a etapa de incubação a 65 ° C.
2. Execute pre-recozimento dos adaptadores do PCR. Portanto, incubar a mistura pré-recozimento mestre em um termociclador a 65 ° C por 1 min, seguido por ainda mais 49 ciclos, 1 min cada, com progressivamente, diminuindo a temperatura de 1 ° C/ciclo. Depois de 50 ciclos (a 15 ° C), incube a mestre mistura a 15 ° C até utilização posterior.
   Nota: Este passo é necessário para gerar assimétricas adaptadores apropriados para ligadura (consulte a etapa 6.6.) com DNA de célula única sujeita a Msedigest de restrição.
3. Após a lise celular, spin para baixo as amostras lisadas a 2000 x g durante 3 s para coletar todo o líquido na parte inferior e coloque-o no gelo.
4. Para fragmentar o DNA, adicionar 2 µ l do DNA digestão mix 1 para cada amostra de lisados micromanipulated ou 0,5 µ l da digestão de DNA misturar 2 à amostra do laser microdissection e executar digest de restrição. Use um termociclador com uma tampa aquecida a 37 ° C por 5 min, seguido por uma etapa de inactivação de enzima de restrição a 65 ° C por 5 min.
   Nota: Digestão a 37 ° C pode ser alargada a 3h. Este é o único passo protocolo diferindo entre amostras obtidas de micromanipulação e amostras obtidas a partir do laser microdissection.
5. Gire para baixo as amostras a recolher todo o líquido na parte inferior e coloque-o no gelo.
6. Para ligar DNA restrição digerida e adaptadores pre-recozidos, adicione 5,0 µ l do mestre ligadura misture para cada amostra de DNA digerida e ligate-lo em um termociclador a 15 ° C, durante 1 h.
   Nota: Este passo pode ser estendido para 12 h ou realizado O/N.
7. Gire para baixo as amostras a recolher todo o líquido na parte inferior e coloque-o no gelo.
8. Para WGA adicionar 40,0 µ l de mistura de mestre PCR primária para cada um dos produtos da ligadura e executar WGA em um termociclador com uma tampa aquecida como segue: primeiro, incubar as amostras em 68 ° C por 3 min. Em segundo lugar, ciclo de 15 vezes a 94 ° C, por 40 s, 57 ° C por 30 s e 68 ° C por 1 min 30 s + 1 s/ciclo. Em seguida, adicionar 9 ciclos de 94 ° c, durante 40 s, 57 ° C + 1 ° C/ciclo por 30 s, 68 ° C por 1 min 45 s + 1 s/ciclo. Daí em diante, ciclo para 23 vezes em 94 ° C por 40 s, 65 ° C por 30 s, 68 ° C por 1 min 53 s + 1 s/ciclo. Finalmente, realizar uma extensão final a 68 ° C por 3 min 40 s e relaxar as amostras a 4 ° C.
9. Gire para baixo as amostras a recolher todo o líquido no fundo e verificar a qualidade do DNA ou armazenar as amostras a-20 ° C ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

7. controle de qualidade dos produtos WGA

Nota: Verifique a qualidade dos produtos WGA com base no intervalo de manchar a imagem de DNA e o número de produtos de amplificação depois de executar uma 4plex QC-PCR ⁵. Executar alíquotas WGA e respectivos QC-PCR amostras em um gel de agarose 1,0% para avaliação.

1. Prepare 100 µM soluções estoque de todos os primers utilizados para controle de qualidade 4plex PCR (tabela 1). Adicione 8 µ l de cada primer a 136.0 µ l de água da PCR-classe para gerar 200 µ l de pool da primeira demão. Vórtice a solução por 3 s, girá-lo para baixo a 2000 x g por 3 s e alíquota 20 µ l de armazenamento-20 ° c.
2. Uso padrão PCR kits para preparar um mestre de PCR multiplex misturam contendo µ l 6.0 de 2 componentes x PCR (exceto as primeiras demão), 4,5 µ l de água da PCR-classe e 0,5 µ l da piscina da primeira demão.
3. Adicionar 1,0 µ l dos produtos WGA, girá-lo para baixo e execução PCR a 94 ° C por 2 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 1 min, cartilha de recozimento no 56 ° C durante 1 minuto e extensão da primeira demão a 72 ° C, durante 1 min 30 s e uma etapa da extensão final a 72 ° C por 7 min. Chill-lo a 4 ° C, girá-lo para baixo e colocar as amostras no gelo para a análise do gel no mesmo dia, ou a-20 ° C para posterior análise.
   Nota: Refrigeração no termociclador pode ser realizada em 12 ° C, para aumentar a longevidade dos elementos Peltier.
4. Analise o WGA (obtidos de 6.8.) e respectivos 4plex QC-PCR produtos em um gel de agarose⁵.

Results

Células após CFSE e coloração ácidos nucleicos podem ser avaliadas usando um microscópio de imunofluorescência equipado com filtros para DAPI e FITC. Núcleos apresentam-se com um corante de contraste brilhante no canal DAPI enquanto citoplasma das células mostrar rotulagem uniforme com CFSE com intensidade de inter celular heterogênea (Figura 2A e 2E). Forma semelhante e as intensidades de coloração são esperadas de células anexadas ao fio (Figura 2B e 2F), bem como retirados o fio e recuperados em um slide (Figura 2D e 2h).

Densidades de pilha elevada (por exemplo, > 1 000 000 células/mL) pode resultar em uma cobertura total do fio com células quando os fios de carga. No entanto, baixa densidade celular, mudanças na velocidade de rotação durante a incubação e o uso de linhas celulares diferentes afetam a eficiência do isolamento e precisam ser testados separadamente. Quando os fios foram incubados com 5 mL de células HT-29 no 100 000 células / mL como descrito na secção 2.1., média de 254 ± 103 células (n = 5) foram capturados nos fios. Com a mesma experiência usando células LNCaP, média de 440 ± 319 células (n = 5) por fio foi obtido.

Apresentar as células HT-29 500, 5 000 e 50 000 em um plano de 5 mL de sangue periférico para fios (de acordo com o protocolo secção 2.2.) resultou na captura de 75 ± 18 células, 25 ± 9 células e 47 ± 57 células (n = 3, cada), respectivamente. Se o fio é acusado de 15 µ l de suspensão de células (1 000 000 células/mL), de acordo com o protocolo na seção 2.3., até a 1 000 (HT-29), as células podem anexar a um fio.

Celular eficiências de desprendimento variou de 81% nas células HT-29 (range 54,9 93,2% e n = 5) para 81% (escala 63.51 92.87%, n = 6) e 91% (faixa de 84,7% - 95,3%, n = 6) em LNCaP e capnografia células, respectivamente. Da mesma forma, a recuperação de células desanexadas difere entre linhagens celulares: uma média de 28% de desanexado células HT-29 foram recuperadas por citocentrifugação. Considerando que a taxa de recuperação para LNCaP foi inferior a 10%, a taxa de recuperação média para células CV foi 55%.

Aproximadamente 75% de células únicas submetidas a produtos WGA WGA rendimento da alta qualidade: Este é o 1) esfregaço de produtos WGA, variando de 0,1 a > 1 kb (Figura 4, painel superior) e 2) três ou quatro bandas na qualidade 4plex controlam PCR (Figura 4, painel de fundo) . Produtos WGA podem ser usados para 1) matriz-CGH perfis que correspondem aos critérios de qualidade de célula única matriz-CGH perfis ^6,7 e 2) alvo NGS após re-amplificação WGA ⁷.

Figura 1: fluxo de trabalho para isolar e recuperar as células alvo para análise de célula única. (A) as células são cultivadas a confluência de 90%, e (B) colhidas para obter uma suspensão de célula única. Depois da coloração com CFSE e ácidos nucleico mancha, (C) o fio funcionalizado é incubado na presença de células em um volume de 5 mL, utilizando tubos de reação ou em um volume baixo usando a ponta da pipeta Pasteur. Este último permite aplicação de volumes de suspensão celular tão baixo quanto 15 µ l. (D) células precisam ser destacado dentro de 4 h após o carregamento. Portanto, o fio é colocado em um tubo de reação de 1,5 mL cheio com liberação buffer. Após a incubação de 15 min em uma cadeira de balanço e centrifugação 10 min, o fio é removido e a suspensão celular é centrifugada para as células de Pelotas. (E) Recovered células são ou transferidas para uma lâmina de vidro para micromanipulação de célula única (topo) ou citocentrifugados numa lâmina de membrana revestida e encaminhadas para laser microdissection (parte inferior). (F) finalmente, colhidas células únicas são amplificadas por meio de amplificação do genoma inteiro (WGA). WGA produtos são compatíveis com a matriz-CGH e análise a jusante de alvo NGS. Epítopo EpCAM: círculo verde na superfície da célula. Acrescida de fio: dispositivo, cinzas fios triplo-helicoidal. Polímero: linhas roxas. Anticorpos anti-EpCAM: laranja. Liberar a atividade de tampão: seta vermelha. Marcador de gordura para manter a suspensão de células no local: elipse azul escuro. Suspensão de células se recuperou: azul claro. Capilar para micromanipulação: preto de linha. Ampliação: célula recuperada colhida por micromanipulação, cytospin na membrana-coberto slide contendo células recuperadas (elipse preenchida cinza). Ampliação: célula recuperada sendo laser microdissected (cinza linha circular: membrana de slide de membrana, servindo como espinha dorsal para o laser microdissection), objetiva com raio laser (linha azul aproximando-se o slide de membrana de baixo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: visualização de células rotuladas. (A, E) As células antes de carregar: as células são marcadas com CFSE e counterstained com um DNA intercalante tintura mostrando uma intensidade de sinal do intervalo de CFSE (verde). (B,F) Células rotuladas capturadas no fio. (C,G) Fio após procedimento de célula-destacamento. (D,H) Células desanexado do fio e recuperaram por citocentrifugação numa lâmina. CFSE: Canal FITC (verde). Mancha de DNA: canal DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: compartimento do fio e armazenamento. (A) compartimentos do fio. (B) detalhe da parte funcionalizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: controle de qualidade dos produtos WGA obtidos de células única micromanipulated. Painel superior: produtos WGA obtidos de células únicas normalmente resultam em DNA manchas variando de 0,2 kb a > 1,0 kb com o pico de intensidade em cerca de 0,5 kb. Número de amostras 1, 7 e 13 (indicados com asteriscos) Mostrar qualidade inferior ou sem DNA manchas. Painel inferior: WGA produtos são de qualidade suficiente, se a 4plex PCR produz três ou quatro de quatro produtos PCR (em 100, 200, 300 e 400 bp). Amostras de 1, 7, 10 e 13 mostram menos de três bandas e seriam excluídas uma análise mais aprofundada. Lane M contém uma escada bp 100 e asteriscos indicam as amostras insuficiente WGA da qualidade do produto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sequência da primeira demão	NOTA
5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '	cartilha de frente 100 bp
5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 '	primeira demão reversa de 100 bp
5 '-agg tgg agc amordaçar agc de gct-3 '	cartilha de frente 200 bp
5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 '	primeira demão reversa de 200 bp
5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3 '	primeira demão para a frente de 300 bp
5 '-tcc ato aac cag tca gcg tc-3 '	primeira demão reversa de 300 bp
5 '-aca gtc gato gcc atc ato gc-3 '	primeira demão para a frente de 400 bp
5 '-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 '	primeira demão reversa de 400 bp

Tabela 1: Sequências de Primer para controle de qualidade 4plex PCR

Discussion

O protocolo descrito visa recuperar as células de um fio funcionalizado (referido como dispositivo) para ex vivo célula única análise genômica. Nós testamos três linhas de célula EpCAM-positivo (HT-29, LNCaP e CV), mas em princípio, este método pode ser aplicado a qualquer linha de células expressando EpCAM. Nas células-alvo EpCAM positivo podem ser apresentadas para o dispositivo como suspensão de células puro (ver 2.1) ou misturadas em um excesso de células de fundo (EG. periférica sangue, ver 2.2.). Considerando que, especialmente este último pode ser usado para testar as capacidades de isolamento em condições raras células, ajuste fino do número de células anexado ao fio pode ser feito usando o baixo volume descrito abordagem (ver ponto 2.3.). Como as diferenças entre as linhas de célula são esperadas, densidades de celular adequada para carregar o fio, rotação velocidade, bem como o tempo de incubação precisam ser testadas empiricamente, avaliando o número de células anexados usando um microscópio de imunofluorescência.

Para aplicações a jusante genômicas a nível de célula única WGA, é necessária. O método WGA de escolha pode diferir entre laboratórios e, em princípio, nosso método é aberto a todos os métodos que pode manipular as amostras obtidas de micromanipulação ou laser microdissection. Neste protocolo, usamos um método baseado em DNA enzimaticamente fragmentado devido a um melhor desempenho em comparação com um calor-fragmentação baseada WGA⁷. Células opcionais, única podem ser encaminhadas para WGA isotérmico permitindo subsequente DNA profiling^20,21.

O protocolo descrito visa recuperar células intactas depois de ser anexado a uma nova geração de fios funcionalizados para análise genômica de célula única. A primeira geração de fios funcionalizados, que também representam os dispositivos de enriquecimento apenas CE-aprovado na vivo no mercado até agora, foram usada para enumerar CTC em pacientes com câncer metastático. Publicações anteriores e nossos próprios dados sugerem que a técnica de isolamento na vivo para ser mais sensível em comparação com a tecnologia atual padrão-ouro². Assim, equipar esta técnica de isolamento na vivo com um recurso de recuperação como perceberam no dispositivo permite combinar alta recuperação do CTC com caracterização a nível de célula única.

No entanto, o dispositivo não está liberado para o uso em pacientes, portanto, não estão disponíveis dados clínicos. Ex vivo aplicações (ou seja, isolando o CTC do sangue periférico após a amostragem) não são recomendados porque a tecnologia é adaptada para as configurações presentes no cubital vaidoso, por exemplo, baixo diâmetro do vaidoso (aumentando a probabilidade de contato entre CTC e anticorpos de capturando direto) e tempo de retenção longa (30 min, permitindo que 2-3 L de sangue para passar o fio). No entanto, conforme descrito na seção 2.2. nas células-alvo também podem ser isoladas de amostras misturadas⁷.

Uma limitação atual do método é a recuperação ineficiente de células não fixadas após o desprendimento de fios. Isso, no entanto, pode ser melhorado por uma etapa de fixação de célula antes do tratamento de desprendimento.

Em resumo, este protocolo é um primeiro passo para o uso combinado de uma técnica de isolamento na vivo com recuperação de células para caracterizar geneticamente células únicas. Os esforços no sentido necessidade de abordar a otimização da recuperação celular e liberação para a sua aplicação em pacientes^1,2. No entanto, a medicina personalizada para decisões de terapia e acompanhamento do tratamento é além da enumeração do CTC. Assim, esse método é um primeiro passo para a caracterização genômica de CTC no nível da célula única.

Aplicações para análise do transcriptoma de célula única parecem viáveis como são colhidas células intactas. No entanto, ela continua a ser avaliado se o processo de recuperação tem um impacto na integridade do RNA (por exemplo, células únicas recuperadas para lise direta, seguido por RT-qPCR²²de encaminhamento). Se for bem-sucedido, caracterização de células únicas (por exemplo, CTC) pode ser deslocada para o nível de transcriptoma, permitindo análises mais detalhadas. A este respeito, RNA-seq usar Smart-seq2 fornece uma ferramenta valiosa para análise a jusante de RNA de células únicas como o cDNA pré-amplificado (obtido durante a preparação do RNA-seq biblioteca) pode ser submetido a PCR quantitativo. Isto irá permitir uma análise baseada em triagem de células únicas recuperado^22,23e destino combinado.

Os fios funcionalizados atuais são baseados em anticorpos anti-EpCAM que é um marcador epitelial amplamente utilizado para a seleção positiva de CTC²⁴. Como vários CTC pode downregulate marcadores epiteliais como citoqueratinas ou EpCAM²⁵, adição de anticorpos como HER2/new aumentaria a chance de isolamento do CTC. Vários anticorpos baseado enriquecimento estratégias foram desenvolvidas e revistas por Ferreira et al. em 2016,²⁶. Uma mistura de anticorpos imobilizados em um fio poderia ser uma futura melhoria da tecnologia levando para o isolamento de um número maior e subtipos adicionais do CTC.

É obrigatório para todas as etapas envolvendo o fio para manter a parte funcional do fio submergido na solução a fim de manter a sua funcionalidade de manipulação. Recomendamos colocar o fio no 1X PBS durante a avaliação (microscópio; ex. 3.1 os passos. -3.3.) e armazenamento. Para evitar coloração inadequada, recomendamos usando recém preparada solução coloração em etapas 1.2.1. e 1.2.2. Células fracamente coradas dificultam a célula contando com o fio e podem originar a subestimação das células anexadas.

É necessário evitar entupimento da pipeta Pasteur com a tampa de borracha ao inserir o fio na pipeta Pasteur para carregamento subsequente da suspensão celular (passo 2.3.4.). A tampa de borracha é usada para prender o fio no lugar para que a parte funcional situa-se dentro a ponta da pipeta Pasteur. Se a tampa está ligada também firmemente para a retaguarda da pipeta Pasteur, carregamento de suspensão de célula não é possível. Nesse caso, facilitar a tampa tal que o ar que é deslocado pela suspensão celular carregado pode deixar a pipeta.

Dobrar o fio é crucial para sua orientação durante a célula contando em etapas 3.2. e 3.3. Monte os fios usando a fita adesiva de tal forma que a extremidade não-funcional do fio vem mentir para um lado. Após a digitalização de todo o comprimento da parte funcional, o fio é rolado 180°, então a outra metade do fio funcional pode ser digitalizada. Este passo é importante para os primeiros experimentos avaliar o número de células no fio. Uma vez que o número de células para uma determinada linha celular e procedimento é avaliado, o procedimento pode ser repetido sem contagem de células (ex. apenas verificar a presença de células ou omitir esta etapa). Pipetagem cuidadosa é fundamental para evitar a perda de células quando a redução do volume do líquido sobrenadante na etapa 4.8. Certifique-se de pipetagem é feito suavemente, sem causar turbulências para a pelota.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampão de Liberação Gilupi	Gilupi	GIL083	Usado para separar células do fio
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. com L-Glutamina	Thermo Fisher Scientific	16600-082	Meio de cultura usado para células HT-29, adapte o meio de cultura à linha celular usada para os experimentos
Solução Tampão HEPES (1 M)	PAA	S11-001	Suplemento para McCoy's 5A Medium
Suplemento de Soro Bovino Fetal Gold	PAA	A15-151	para McCoy's 5a Modificado
Médio Penicilina-Estreptomicina (100x)	Biowest	L0018-100	Suplemento para McCoy's 5a Modificado
Meio Fosfato Tampolado Salino (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-015
Accutase	Biowest	L0950-100	Solução de descolamento celular (cultura de células)
Banho-maria	GFL	Tipo 1003	Utilizado para soluções de pré-aquecimento
Incubadora	Thermo Fisher Scientific		Utilizado para incubar células (cultura de células)
Tubos de reação de 50 mL	VWR	525-0403
Misturador de rolos	Stuart Scientific	SRT6D	Utilizado para fixar células ao fio, evitando a sedimentação das células
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Thermo Fisher Scientific	C34554	Usado para marcar células vivas (marcador citoplasmático)
Hoechst 33342	H3570	Thermo Fisher Scientific	Usado para colorir DNA (contracoloração nucleica)
Centrífuga (equipada para segurar tubos de reação de 15 mL e 50 mL)	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Megafuge 40R	Usado para peletizar células
Observer Z1 (microscópio de microdissecção a laser/fluorescência)	Carl Zeiss Microimaging		Microscópio invertido (imunofluorescência) capaz de microdissecção a laser; Os microscópios de fluorescência devem ser capazes de detectar Hoechst 33342 (filtro DAPI) e CFSE (filtro FITC)
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Usado para revestir superfícies de vidro/plástico
MS1 Minishaker	Sigma-Aldrich	Z404039	Usado para vórtice
Tubos Vacutainer EDTA (ou Na-heparina)	BD	366450 (ou 366480)	Usado como tubo de reação para captura ex vivo de células-alvo
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Fio funcionalizado capaz de isolar e separar células positivas para EpCAM (também conhecido como catch& lançamento, C& R)
Agulhas de seringa (G20)	VWR	613-0554	Usado para perfurar tampas de borracha para permitir que a parte não funcional do C & R para conduzir através dele
Câmara de Neubauer	Roth	T729.1	Usado para contar células
Pipetas de Pasteur 150 mm	Volac	D810	Usado para a aplicação de baixo volume de células ao C&
R Caneta de graxa	Dako	S2002	Usada em lâminas de vidro para manter a suspensão da célula no lugar
Filtro de seringa estéril (0.2 µ m)	Corning	431219	Para filtrar Gilupi Release Buffer
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	1296-003	Usado para agitação durante o desprendimento celular
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf	30,125,150
Ampli1 WGA Kit	Silicon Biosystems		A ser encomendado via Silicon Biosystems
Axiovert M200 equipado com Mikromanipulator MMJ e CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Use micromanipulação à mão
Microcapilares (25 µ m de diâmetro), CustomTip Tipo I	Eppendorf	930001201	Usado para micromanipular células
Tubos de PCR de 0,2 mL	Biozym	710920
Citocentrífuga e equipamento	Hettich	Universal 32	Use citocentrífuga à mão
Termocicladora	Bio-Rad	DNA Engine Díade	Cada termocicladora com tampa aquecida pode ser usada
Microcentrífuga	Roth	CX73.1	Use centrífuga de mesa à mão
MembraneSlide 1.0 PET	Zeiss	415101-4401-050	Lâminas de vidro revestidas com membrana usadas para microdissecção
a laser UV Stratalinker 1800	Stratagene	400072	Use reticulador de DNA à mão
Reagentes
6x Carregamento de DNA	Thermo Fisher Scientific	R0611	Use gel carregando corante à mão
Escada de DNA	BioLabs	N0551G	Use escada de 100 bp à mão
Agarose	Biozym	840004
Estação de eletromorfose em gel	Bio-Rad		Use sistema de eletroforese à mão
Gel Red Nucleic Acid Stain	Biotium	41003	Corante intercalante para visualização de DNA Em géis de agarose