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Artigo de método

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

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DOI:

10.3791/56411

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9 de novembro de 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.

Resumo

Quimiotaxia, ou migração de um gradiente de um quimiotático, é o melhor modo compreendido de migração dirigida. Estudos utilizando social ameba Dictyostelium discoideum revelou que uma rede de transdução de sinal complexo de vias paralelas amplifica a resposta ao quimioatraentes e leva a polimerização de actina tendenciosa e protrusão de um pseudopod no direção de um gradiente. Em contraste, os mecanismos moleculares dirigindo outros tipos de migração dirigida, por exemplo, devido à exposição ao cisalhamento fluxo ou campos elétricos, não são conhecidos. Muitos reguladores de quimiotaxia exibem localização no líder ou borda de revestimento de uma célula de migração, bem como mostram mudanças transientes na localização ou ativação após estimulação global com um quimiotático. Para entender os mecanismos moleculares de outros tipos de migração dirigida, desenvolvemos um método que permite o exame da resposta celular à estimulação mecânica aguda, com base em breve (2-5 s) exposição ao fluxo de cisalhamento. Esta estimulação pode ser entregue em um canal enquanto imagem células expressando fluorescente-etiquetadas biosensores para examinar o comportamento de células individuais. Além disso, a população celular pode ser estimulada em um prato, lysed e immunoblotted usando anticorpos que reconhecem versões ativas de proteínas de interesse. Combinando os dois ensaios, um pode examinar uma ampla gama de moléculas ativadas por alterações na localização subcellular e/ou fosforilação. Usando esse método, determinamos que estimulação mecânica aguda provoca ativação das redes de citoesqueleto sinal quimiotáxico transdução e actina. A capacidade de examinar as respostas celulares à estimulação mecânica aguda é importante para compreender os eventos inicial necessários para motilidade induzida pelo fluxo de cisalhamento. Esta abordagem também fornece uma ferramenta para o estudo da rede de transdução de sinal quimiotáxico sem a influência de confundimento do receptor quimiotático.

Introdução

Migração de células eucarióticas é tendencioso por diversas pistas químicas e físicas no ambiente, incluindo gradientes de solúveis ou substrato-limite quimioatraentes, rigidez variável de substratos, campos elétricos, o fluxo de cisalhamento. Embora tenha havido muitos avanços na nossa compreensão dos mecanismos moleculares dirigindo quimiotaxia, menos é conhecido sobre outros tipos de migração dirigida e como esses diversos sinais são integrados no nível celular para produzir um unificado migratórias resposta.

Dirigido a migração em direção a uma concentração crescente de um quimiotático envolve três componentes comportamentais: motilidade direcional sensoriamento e polaridade1. Motilidade refere-se ao movimento aleatório de células alcançado pela protrusão pseudopod. Direcional é a capacidade de uma célula para detectar a origem de um quimiotático de detecção, que pode ocorrer mesmo em imobilizado células. Polaridade se refere à distribuição assimétrica mais estável dos componentes intracelulares, entre a borda do revestimento de uma célula, o que leva a maior persistência em movimento e líderes.

Resposta celular a um quimiotático depende da atividade de quatro redes reguladoras conceitualmente definidas: receptor / proteína G, transdução de sinal, citoesqueleto de actina e polaridade1. Quimiotático de ligação ao receptor acoplado à proteína G transmite o sinal via Via G proteínas α e βγ para a rede de transdução de sinal a jusante, que amplifica o sinal direcional. Vários caminhos dentro da rede de transdução de sinal agem em paralelo e alimentam a rede de citoesqueleto de actina para polimerização de actina viés e protrusão pseudopod consequente, na direção do gradiente. Entre os importantes reguladores da quimiotaxia são Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-quinase (PI3K), homólogo fosfatase e tensin (PTEN) e guanylyl-ciclase. Mecanismos de feedback dentro da rede de transdução de sinal e entre a transdução de sinal e redes de citoesqueleto de actina mais amplificam a resposta. Finalmente, a rede de polaridade mal definidos recebe entrada do citoesqueleto de actina e preconceitos ainda mais a rede de transdução de sinal para promover a migração persistente na direção do gradiente.

Muito de nossa compreensão mecanicista da quimiotaxia foi tornado possível por causa do desenvolvimento de biossensores fluorescente-tag para vários componentes das redes reguladoras. Muitos reguladores de quimiotaxia tem uma distribuição assimétrica da molécula reguladora em si ou a sua actividade. Por exemplo, biosensores que reconhecem ativado versões de pequenas GTPases Ras e Rap1 – domínios de ligação de Ras de Raf1 (referido como RBD aqui) e RalGDS, respectivamente – localizar a extremidade dianteira de uma célula de chemotaxing2,3. Da mesma forma, PI3K e seu produto fosfatidilinositol (3, 4,5)-triphosphate (PIP3), reconhecido por um domínio de homologia (PH) plecstrina, também mostram a localização na frente de um celular4,5. Em contraste, um 3-fosfatase PTEN, que converte a PIP3 volta a fosfatidilinositol (4,5)-bisfosfato, localiza-se à borda da célula6de atraso. Importante, estes biosensores alterar sua localização em resposta à estimulação global com um quimiotático. Marcadores de ponta, que são citosólica ou nas pontas de saliências em uma célula de descanso, relocalize ao córtex, Considerando que o atraso marcadores de borda, que têm localização cortical e estão ausentes das pontas dos saliências em uma célula de descanso, se tornar citosólico após estimulação. Análise da distribuição de biosensor em resposta à estimulação global com um quimiotático minimiza a contribuição de motilidade e polaridade, que muitas vezes confundem as observações. Estimulação global ou uniforme de uma suspensão de células com um quimiotático também é usada como uma ferramenta para avaliar alterações de toda a população na ativação da proteína, muitas vezes detectado por fosforilação de proteínas a7,8,9 . Este ensaio bioquímico é usado principalmente para obter informação temporal, Considerando que a microscopia é usada para reunir informações temporais e espaciais sobre o comportamento de vários componentes das redes reguladoras.

A rede de transdução de sinal incorpora características de um sistema excitável10,11. Respostas aos estímulos Quimiotáticos supralimiar são "tudo ou nada" e exibir os períodos refratários. As respostas também são acionadas estocàstica e podem mostrar comportamento oscilatório. Eventos de transdução de sinal estão localizados as regiões do córtex que se propagam como ondas12,13,14,15. Frente, trás, marcadores são recrutados para ou dissociam-se, as zonas activas das ondas propagação. Devido a região refratária à direita da zona activa, as ondas opostas dirigidas aniquilar como eles se encontram. As propagação ondas de transdução de sinal fundamentam as saliências celulares que medeiam a migração de células10.

Grande parte das informações acima mencionadas na quimiotaxia veio os estudos sobre a ameba social Dictyostelium discoideum, embora semelhantes mecanismos reguladores são também aplicáveis aos neutrófilos e outros tipos de células de mamíferos16 . Dictyostelium é um organismo modelo bem estabelecida que tem uma robusta quimiotático resposta durante a fome, quando milhares de células únicas migram em direção a um centro de agregação, eventualmente formando um corpo multicelular de frutificação contendo esporos. Quimiotaxia é também essencial durante a fase de crescimento de célula única deste organismo para localizar fontes de alimento bacteriana. Importante, migração de células únicas Dictyostelium é notavelmente semelhante a migração de neutrófilos mamíferos ou células de câncer metastático, os quais sofrem muito rápida migração ameboide-tipo. Na verdade, ambos a topologia global das redes reguladoras, bem como muitas das vias de transdução de sinal individuais envolvidas na quimiotaxia são conservadas entre Dictyostelium e leucócitos mamíferos17. Além disso, outras células, como fibroblastos, usam quinase de tirosina do receptor (RTK) em vez de GPCRs; no entanto, RTKs pode alimentar em redes semelhantes.

Em contraste com a quimiotaxia, informação detalhada sobre os mecanismos de sinalização que levam vários outros modos de migração dirigida é carente. Da mesma forma às células migrando em um gradiente quimiotático vários estudos relataram ativação e/ou localização de marcadores típicos de vanguarda, incluindo polimerização de actina, PIP3 e/ou quinase de sinal-regulado extracellular (ERK) 1/2, no frente de células em fase dirigido a migração em resposta ao cisalhamento fluxo ou alterações nos campos elétricos18,19,20,21. No entanto, nestes estudos exposição contínua ao estímulo também resultou na migração celular, deixando em aberto a questão se, por exemplo, os marcadores de ponta localizar especificamente em resposta a um estímulo, ou se eles simplesmente localizar na vanguarda por causa do aumento do número de pseudopods na frente de uma célula de migração.

Desenvolvemos os ensaios que nos permitem observar a resposta das células à aguda perturbação mecânica entregada como fluxo de cisalhamento, tanto a nível da população e como células individuais22. Semelhante à estimulação global com um quimiotático, pós-dose agudação com fluxo de cisalhamento permite o estudo da resposta celular a um estímulo mecânico sem a contribuição de confundimento de motilidade ou polaridade. Combinar estes ensaios bioquímicos e microscópicos com perturbações genéticas ou farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecânicos como são percebidos e transmitida. Além disso, esta abordagem também fornece um método novo para grampear a jusante do sistema do receptor quimiotático na ausência de um quimiotático, isolando, assim, as redes sinal transdução e actina citoesqueleto do receptor/G rede de proteínas.

Usando as técnicas descritas abaixo nós recentemente demonstrou que a tensão de cisalhamento aguda leva à ativação de vários componentes do sinal quimiotáxico transdução e actina citoesqueleto redes22. Aplicando o estímulo mecânico agudo em intervalos variáveis, temos demonstrado que, da mesma forma quimioatraentes, resposta a estímulos mecânicos também exibe características de um sistema excitável, incluindo o comportamento tudo ou nada da resposta sob saturar as condições e a presença de um período refratário. Finalmente, combinando estimulação mecânica e química, mostramos que os dois estímulos compartilham sinal transdução e actina citoesqueleto redes, permitindo que o provável para a integração de múltiplos estímulos a migração celular viés.

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Protocolo

1. preparação de soluções

  1. HL-5 preparar mídia usando o seguinte: glicose 10 g/L, peptona proteose de 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 de 0,965 g/L PO 4 e, salvo indicação em contrário, estreptomicina 0,03 g/L em água desionizada. Autoclave a médio e armazenar à temperatura ambiente.
    Nota: Devido às diferenças entre proteose peptona e levedura extrato adquiridos de fornecedores diferentes, bem como entre lotes individuais, pH dos meios de comunicação pode precisar ser ajustada ao intervalo típico de 6,4 para 6.7.
  2. Placas de SM preparar usando o seguinte: glicose 10 g/L, peptona de 10 g/L, 1 g/L de levedura extrato, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1G/L K 2 HPO 4 e ágar de 20 g/L em água desionizada. Autoclave, esfriar e despeje 30 mL da solução de agar por prato de Petri de 10 cm. Uma vez que o ágar solidifies, armazenar as placas a 4 ° C por até 1 mês.
  3. Preparar 10 x usando o tampão de fosfato (PB) 13,4 g/L, Na 2 HPO 4 ·7H 2 O e 6,8 g/L KH 2 PO 4 em água desionizada. Armazenar o estoque de 10x em 4 ° C. diluir para 1 x com água desionizada para uso.
  4. Preparar o Buffer de DB, completando 1 X PB com 2 mM de MgSO 4 e 0,2 mM CaCl 2.
  5. Preparar cafeína de 100mm em água desionizada. Guarde este medicamento em − 20 ° C.
  6. Preparar 100 mM acampamento solução dissolvendo-se acampamento de sódio monohidratado sal em água desionizada. Prepare um 1mm trabalhar ações em água desionizada. Armazenar as duas soluções estoque em − 20 ° C. preparar acampamento solução final na concentração desejada no DB no dia do experimento.
    Nota: Soluções de estoque podem ser congelar-descongelar algumas vezes.
  7. Preparar ácido fólico de 25 mM em 1 x PB. Adicione algumas gotas de 1 N de NaOH até o pó dissolve-se completamente. Guarde este medicamento em − 20 ° C.
  8. Prepara amortecedor da amostra x 3 usando o seguinte: pH 187,5 mM Tris-HCl 6,8, 6% (p/v) sulfato dodecyl de sódio (SDS), 30% de glicerol, ditiotreitol 126 mM e 0,03% (p/v) de bromofenol. Alíquota e loja em − 20 ° C.
    1. Antes de usar, descongelar em banho maria a 37 ° C e prosseguir para preparar o amortecedor da amostra com inibidores de protease e fosfatase diluindo 3 x amortecedor da amostra a 1 x, e adicionando 50mm NaF, 2mm at 3 VO 4, pirofosfato de sódio 25 mM e 1 x completo livre de EDTA inibidor da protease cocktail em água desionizada. Adicionar os inibidores imediatamente antes de iniciar o procedimento descrito nos passos 3.1.2-3.1.3.
  9. Preparar 5 mM Latrunculin A solução em DMSO. Alíquota e loja em − 20 ° C.

2. Preparação de células de d. discoideum

Nota: manter as células d. discoideum na mídia HL-5 também em placas de cultura de tecidos ou em suspensão cultura conforme descrito anteriormente 23. Quando necessário, transformar células com biossensores fluorescente-etiquetadas de acordo com o padrão electroporation protocolos 24. Várias cepas de d. discoideum, bem como plasmídeos codificação biosensores ou outros genes de interesse podem ser obtidas com o centro de estoque Dicty (dictybase.org).

  1. Crescimento e coleção de células vegetativas d. discoideum
    1. para análise de células vegetativas, desenvolvem-se células na presença de bactérias para reduzir o número de macropinosomes, que são tipicamente observadas as células cultivadas axenically 25.
      1. Prepare uma cultura de Klebsiella aerogenes pela inoculação de um pequeno número de células de um estoque de glicerol ou de uma cultura anterior para o volume desejado de HL-5 meio sem antibióticos. Incubar a cultura bacteriana em um agitador orbital a 200 rpm (0,42 x g) à temperatura ambiente (20-22 ° C) por 16-18 h.
        Nota: O K. aerogenes estirpes utilizadas aqui é não-patogênicas (veja a Tabela de materiais).
    2. Recolher d. discoideum em fase de crescimento exponencial de placas de cultura de tecido ou de uma cultura de suspensão e contar as células usando um hemocytometer de acordo com o fabricante ' instruções s. Espalhe 1 x 10 5 d. discoideum células com suspensão de K. aerogenes µ l 260 em um prato de SM. Vire a placa de cabeça para baixo no dia seguinte. Desenvolvem-se células em temperatura ambiente até as células de d. discoideum começam a limpar o gramado bacteriano, mas antes que eles começam a agregar (~ 36-48 h).
    3. Coletar células de d. discoideum no buffer de 5ml DB raspando-os com um difusor de vidro. Transferência de células para um tubo de polipropileno de 50 mL. Lave a placa com outro 5 mL DB e piscina com a suspensão original. Encha o tubo de 50 mL com tampão DB.
    4. Centrifugue a suspensão de d. discoideum x 360 g 3-4 min. Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 50 mL Buffer DB. Repita as etapas de lavagem até que o sobrenadante é claro (~ 3 a 4 lavagens). Resuspenda o pellet de final de célula no buffer DB para uma densidade final de ~ 5 x 10 6 células/mL.
  2. Preparação de agregação-células competentes d. discoideum
    1. desenvolver d. discoideum células por inanição de 1 h, seguida por 4h de inanição e pulsando com acampamento de 50 nM cada 6 min de acordo com a norma protocolos 23.
    2. Na sequência de desenvolvimento, medir o volume final da suspensão celular.
    3. Com base no número inicial de células utilizadas para o desenvolvimento, calcular a densidade celular da suspensão final.
      Nota: Se o acampamento é entregue em 100 volumes de µ l de cada 6 min, volume das células aumenta em 1 mL por cada hora de campo pulsante. Assim, para as condições padrão usando 8 x 10 7 células em 4 mL de DB, após 4 h de desenvolvimento, o volume final é 7 mL e a densidade celular final é ~1.1 x 10 7 células/mL.

3. Análise bioquímica da resposta celular mecânica ou química de estimulação

  1. Aguda mecânica estimulação de células seguido de lise celular
    1. placa de 2 x 10 6 competente-agregação de células (da etapa 2.2) após 4 h de desenvolvimento em 35mm pratos com 2ml DB. Permitir que as células anexar por 10 min à temperatura ambiente. Lave as células duas vezes com 1 mL de DB. Incubar as células no DB com cafeína 2,5 mM por 30 min sem qualquer perturbação das placas.
      Nota: Se as células precisam ser tratados com um inibidor farmacológico, adicionar a concentração desejada de inibidor ou o mesmo volume de veículo apropriado durante basalation com cafeína.
    2. Aplicar estimulação mecânica, coloque a placa (um de cada vez) em um agitador orbital e imediatamente ligá-lo a 150 rpm (0,24 x g) por 5 s.
      Nota: A placa pode também ser manualmente estimulada pelo movimento de forma ft.lb por cerca de 5 s.
    3. Aspirado o buffer para o indicado vezes após o início da estimulação. Lyse imediatamente as pilhas pela adição de tampão de amostra 100 µ l com inibidores de protease e fosfatase.
    4. Colocar a placa no gelo e coletar o lisado em um tubo de 1,5 mL. Para ' tempo 0 ', lisar as células sem tremer. Transferi os tubos a um bloco de calor de 95 ° C por 10 min, imediatamente após a Lise. Proceder com immunoblotting ou armazenar lysates em -20 ° C.
  2. Estimulação de células com um quimiotático
    1. Basalate células competentes de agregação após 4 h de desenvolvimento agitando rapidamente-os na presença de cafeína de 5 mM a 200 rpm (0,42 x g) em um agitador orbital por 30 min.
      1. Centrifugar a suspensão de célula x 360 g 3-4 min. Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 10 mL gelada Buffer DB. Repita a etapa de lavagem.
    2. Resuspenda o pellet de final de célula no buffer gelado de DB para uma densidade final de 4 x 10 7 células/mL, baseada o número de célula inicial utilizado para desenvolver as células (ver passo 2.2). Manter a suspensão de células no gelo antes stimulation.
      1. Pipeta 50 µ l de 10 µM acampamento ou veículo em um copo de poliestireno colocado em um agitador orbital.
    3. Para estimular as células, adicionar 450 µ l de suspensão de célula gelada no mesmo copo e ligar imediatamente o abanador a 200 rpm (0,42 x g). Em vários momentos após o início da estimulação (por exemplo, 10, 30, 45, 60, 120 s), brevemente interromper o abanador, tirar 50 alíquotas µ l de suspensão de células e lisar as células adicionando-as aos tubos de 1,5 mL contendo 25 µ l 3 X amortecedor da amostra.
      1. Para ' tempo 0 ', usar as células da suspensão celular gelada unstimulated.
        Nota: A temperatura final da suspensão celular durante a estimulação é ~ 9 ° C 26. Nestas condições, o pico de resposta ocorre um pouco mais tarde do que o pico observado para a estimulação realizada à temperatura ambiente (por exemplo, estímulo quimiotático de células aderentes no microscópio, ou estimulação mecânica das células aderentes).
    4. Transferir os tubos para um bloco de calor de 95 ° C por 10 min, imediatamente após a Lise. Proceder com immunoblotting ou armazenar lysates em -20 ° C.
  3. Análise da resposta das células por Immunoblotting
    1. executar lysates (a partir de etapas 3.1.3 ou 3.2.4) em gel de poliacrilamida Tris-HCl 4-15%, transferir para uma membrana de fluoreto de polivinilideno e bloco immunoblot com phospho-PKC Ζ Thr410 (para detectar fosfo-PKBR1 e phospho-PKBA). Detectar o sinal pela incubação com rábano conjugada com peroxidase anticoelho anticorpo secundário, seguido por quimioluminescência utilizando substrato reforçada quimioluminescência.
    2. Para detecção de proteínas múltiplas, tira o blot com buffer de descascamento e re-sonda com um anticorpo primário contra phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (para detectar fosfo-ERK2). Confirmar a proteína igual carregamento pela coloração da membrana de fluoreto de polivinilideno com azul brilhante de Coomassie.

4. Aguda de estimulação mecânica e ao vivo de imagens de células únicas no microscópio

  1. avaliação da resposta à estimulação mecânica aguda usando um dispositivo de fluxo
    1. recolher e diluir vegetativa ou agregação-competente células para ~ 1 x 10 6 células/mL em DB conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2, respectivamente. Carregar ~ 600 µ l para o slide com um canal (consulte a Tabela de Material para obter detalhes). Permitir que as células anexar para 10 min. Certifique-se de que todas as entradas no slide estão completamente cheios. Top-up com buffer extra se necessário.
      Nota: O slide específico usado para análise tem três entradas, que alimentam em canais estreitos, 1 mm, mas em seguida, mesclar para um canal de largo, 3 mm. A altura do canal é de 0,4 mm. Embora as células são banhadas em todo o canal, apenas a parte larga é fotografada.
    2. Passar uma das linhas que é anexado a um reservatório de 50 mL através da válvula direita da frente da unidade fluídico (consulte a Tabela de materiais para obter detalhes). Usando o software para a bomba, verifique se a válvula está fechada (ou seja, para a esquerda). Encha o reservatório com DB.
      1. Ajustar a pressão a 50 mbar e ligá-lo. Preencher e passe a linha com DB clicando sobre a válvula para abri-lo. Transformar a pressão volta a 0 e fechar a válvula depois de ~ 30 s.
    3. Conectar a linha de uma das três entradas em um lado da lâmina sem interceptação quaisquer bolhas de ar. Conecte as outras duas entradas. Conectar a linha do dreno para a única entrada do segundo lado do slide.
      Nota: O tubo usado para as linhas de entrada e drenagem nesta configuração tem um diâmetro interno de 1,6 mm.
    4. Colocar o slide no microscópio sob um objectivo de ar X 20. Para lavar o canal, trocar a válvula para abrir a linha e clique em " pressão ON ", começando a pressão superior (~ 50 mbar ou ~ 40 dyn/cm 2) para empurrar o líquido através de para o ralo.
      1. Uma vez que o líquido é retirado o dreno, reduzir a pressão externa para zero (i. e. gravidade apenas, fluxo ~ 15 dyn/cm 2) e continuar enxaguando para ~ 30 s. interruptor da válvula para a posição oposta para parar o fluxo.
    5. Adquirir imagens com iluminação RFP ou GFP em um microscópio de fluorescência invertido sob um 40 X objetivo de óleo com 3 intervalos de s. Com a válvula na posição fechada, ligue a pressão à pressão desejada, normalmente entre 15 e 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
    6. Depois de adquirir 5 quadros, entregar o estímulo comutando a válvula para o " abrir " posição. Desligue o fluxo após 2-5 s comutando a válvula para o sentido oposto.
      Nota: Para certos biossensores mais fracos (por exemplo, PTEN, CynA e RalGDS) pode ser necessário para células de imagem usando um microscópio confocal, equipado com um 40 X objetivo petróleo.
  2. Teste de efeitos de inibidores farmacológicos em resposta à estimulação mecânica aguda, usando um dispositivo de fluxo de
    1. placa células no slide com um canal, conforme descrito na etapa 4.1.1. Configurar duas linhas: passar uma linha através da válvula direita frontal como na etapa 4.1.2, e o segundo pela parte de trás deixou a válvula. Prenda a linha esquerda e coloque a válvula " fechado " posição (esquerda). Preencher uma linha com DB contendo o veículo apropriado e a segunda com a solução que contém um inibidor farmacológico de interesse (por exemplo, 5 µM Latrunculin A).
      Nota: É necessário fixar fisicamente a linha esquerda porque o " fechado " posição esquerda abre a válvula para essa linha.
    2. Preenchimento e enxaguar o direito linha ligando a pressão a 50 mbar e a comutação da válvula para o " abrir " posição (à direita). Trocar a válvula à esquerda depois de ~ 30 s. preenchimento e enxaguar a linha esquerda, removendo o grampo para ~ 30 s. Connect ambas as linhas para duas das entradas de um lado da lâmina com um canal, ligar a entrada restante e conectar o ralo da única entrada no segundo lado. < / l Eu >
    3. lavar o slide com o amortecedor na linha certa e realizar a estimulação a mesma reserva, conforme descrito nas etapas 4.1.3 e 4.1.4 acima.
      Nota: Embora a linha certa foi escolhida como o primeiro nesta configuração, a ordem pode ser invertida.
    4. Após estimulação, trocar a válvula para abrir a linha certa à pressão zero (ou seja, fluxo de gravidade somente, ~ 15 dyn/cm 2). Remova o grampo da linha de esquerda e trocar a válvula à esquerda para abrir essa linha. Braçadeira de primeira linha.
    5. Após a execução de 3-5 mL de tampão com inibidor através de, trocar a válvula para a direita para parar o fluxo e incube as celulas com o inibidor para o comprimento necessário de tempo (por exemplo, 15 min). Ligue o fluxo comutando a válvula cada min ~ 10 ~ 15 s para evitar a privação de oxigênio. Repita a estimulação com a segunda linha.
  3. Método alternativo para avaliar a resposta à estimulação mecânica aguda utilizando uma micropipeta
    1. Configurar a micropipeta preenchida com DB, de acordo com o protocolo padrão 23. Manter a pressão de compensação a 1.500 psi.
    2. Recolher e diluir as células vegetativas, conforme descrito no passo 2.1. Gotas de lugar 25 µ l de ~7.5 x 10 5 células/mL em uma câmara de 1-bem, permitem aderir pelo menos 10 min e cobrir com 3 mL DB.
    3. Coloque a câmara em um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objectivo de óleo X 40. Localize as células. Baixe a micropipeta suavemente no meio do campo de visão até que primeiro toca o fundo da câmara.
      Nota: Desde que a pressão de compensação foi fixada em 1.500 Psi, as células serão continuamente expostas a um fluxo muito lento de DB da micropipeta.
    4. Começar a aquisição de imagens com iluminação RFP ou GFP com 3 intervalos de s. Aplicar o ' limpa ' função para liberar um bolus de líquido proveniente da micropipeta. Continue eu imagingn a presença de fluxo devido à pressão de compensação sozinho.
  4. Um método alternativo para avaliar a resposta à estimulação mecânica aguda, usando a adição de tampão de massa
    1. recolher e diluir as células vegetativas, conforme descrito no passo 2.1. Coloque 20 gotas de µ l de células em ~ 1 x 10 6 células/mL em DB no meio de um poço de uma câmara de 8 poços. Permitir que as células aderir durante pelo menos 10 min.
    2. Começar a aquisição de imagens com iluminação de RFP GFP-específico ou em um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objetivo X 40 em 3 intervalos de s. Focar em uma área perto da borda da gota.
    3. Rapidamente adicionar 430 µ l de DB para o lado do bem. Continue imagens.
    4. Para análise da interação entre estímulos mecânicos e químicos, 12 ou 45 s após estimulação mecânica, suavemente adicionar 50 µ l de ácido fólico (concentração final 20 nM) ou veículo (DB) sem induzir uma resposta mecânica. Continue imagens.
  5. Quantificação da resposta
    1. abrir a imagem TIFF de 32 bits do software de análise de imagem (veja Tabela de materiais para obter detalhes) 27.
    2. Sob a ' Analyze ' guia, vá para " conjunto de medições ". Marque a caixa para ' valor de Gray quer dizer '. Certifique-se que as outras caixas não são verificadas. Clique " Okey ".
    3. Sob a ' processo ' guia, clique em " subtrair fundo ". Manter o raio de esfera rolamento de 50 pixels e fazer não verificação de qualquer uma das opções listadas no menu. Zoom em uma célula usando o ' lupa ' ferramenta.
    4. Usando o ' retângulo ' tool, desenhe uma caixa (~2.5 x 2,5 µm 2) no citosol, certificando-se não de desenhá-lo sobre o núcleo ou a membrana plasmática. Imprensa " Ctrl " + " M " de teclas ou ir para o ' Analyze ' guia e clique no " medida " para determinar o valor médio de cinza da caixa. Avanço para quadros subsequentes e medir novamente, certificando-se a caixa fica no citosol.
      Nota: Como d. discoideum células se move muito rapidamente a caixa pode ser movida de um quadro para o outro para mantê-lo no citosol.
    5. Afinal os quadros foram analisadas, copiar os valores em uma planilha. Para compensar a variação de célula para célula dos níveis de expressão de diversos biossensores, normalize os valores para o valor de cinza médio observado no tempo 0. Calcular a recíproca dos valores para refletir o acúmulo do sinal no córtex.

5. Contínua estimulação mecânica e ao vivo de imagens de células únicas no microscópio

  1. configurar as células exatamente como descrito acima para a análise de estimulação mecânica aguda em etapas 4.1.1 - 4.1.3. Abra a ficha cobrindo o reservatório com o buffer, então o volume pode ser coberto, se a resposta é analisada por mais de alguns minutos a uma hora.
    Nota: Porque o reservatório permanece aberto para a duração do experimento, este ensaio é realizado na ausência de pressão externa e baseia-se no fluxo de gravidade sozinho. Para aumentar a taxa de fluxo por gravidade, o dreno pode ser colocado em uma tabela abaixo do microscópio.
  2. Começar células com iluminação de RFP GFP-específico ou em um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objetivo X 40 em 3 intervalos de s para a análise das respostas de biosensor de imagem. Alternativamente, imagem com contraste de fase usando um objectivo X 20 intervalos de 10 s para análise de migração celular global.
  3. Ligue o fluxo após vários quadros no ajuste de pressão zero (ou seja, o fluxo é devido à gravidade sozinha ou ~ 15 dyn/cm 2) comutando a válvula na posição aberta. Quando o nível do líquido cai para 5-10 mL no reservatório, cobri com mais reserva. Certifique-se de adicionar o líquido cuidadosamente para que as bolhas de ar não ficar preso nas linhas.
    Nota: É importante adicionar fluido da mesma temperatura para evitar uma resposta de choque nas células.
  4. Quantificar a velocidade de célula e persistência usando software de análise de migração (veja a Tabela de materiais para obter detalhes) de acordo com o fabricante ' instruções de s.

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Resultados

Resposta temporal de reguladores de quimiotaxia para estimulação mecânica aguda

Para avaliar a resposta das células de d. discoideum à estimulação mecânica, células aderentes de agregação-competentes foram expostas a um breve pulso de fluxo de cisalhamento. Agregação-competente D. discoideum células secretam o acampamento, que pode ser percebido pelas células. Para superar a contribuição de sinalização celular, as...

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Discussão

Os métodos descritos aqui para oferecer uma maneira conveniente para avaliar a população e comportamento de células individuais em resposta para distorcer o fluxo. Importante, enquanto estudos anteriores analisaram localização de líder e retardamento marcadores de borda durante a migração, a abordagem atual permite investigação dos efeitos imediatos aplicando-se o fluxo de cisalhamento aguda. Usando este método demonstrámos que, na verdade, a resposta inicial de células de fluxo de cisalhamento não requer migração celula...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenção de saúde R35 GM118177 ao PND.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
DextroseFisherD16-1Use para preparar meios HL-5 e placas SM (etapas 1.1, 1.2)
Peptona de proteoseFisherDF0120-17-6Use para preparar mídia HL-5 (etapa 1.1)
Extrato de leveduraFisher50-550-445Use para preparar mídia HL-5 e placas SM (etapas 1.1, 1.2)
Na2HPO4· 7H2OFisherS373-500Use para preparar meios HL-5 e tampão fosfato 10X (etapas 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500Use para preparar meios HL-5, placas SM e tampão fosfato 10X (etapas 1.1-1.3)
Estreptomicina (sulfato de diidroestreptomicina)FisherICN10040525Use para preparar meios HL-5 (etapa 1.1)
Peptona (Bacto)FisherDF0118-17-0Use para preparar placas SM (etapa 1.2)
K2HPO4FisherP288-100Use para preparar placas SM (etapa 1.2)
AgarFisherBP1423-500Use para preparar placas SM (etapa 1.2)
MgSO4FisherM65-500Use para preparar o DB Buffer (etapa 1.4)
CaCl2FisherC79-500Use para preparar DB Buffer (passo 1.4)
CafeínaFisherO1728-500Use para preparar cafeína (passo 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-monofosfato cíclico, Sal de Sódio)Fisher11-680-1100MGUse para preparar cAMP (passo 1.6)
Ácido fólicoSigmaF7876Use para preparar folic ácido (etapa 1.7)
Base TrisFisherBP152-500Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)
Dodecil sulfato de sódio (SDS)FisherBP166-500Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)
GlicerolFisherG33-500Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)
Ditiotreitol (DTT)Bio-Rad1610610Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)
Azul de bromofenolBio-Rad1610404Use para preparar tampão de amostra 3X (etapa 1.8)
NaFFisherS299-100Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)
Pirofosfato de sódio decahidratadoFisherS390-500Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)
Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTA (Roche)Sigma11873580001Use para preparar tampão de amostra com inibidores de protease e fosfatase (etapa 1.8)
Latrunculina AEnzo Life SciencesBML-T119-0100Use para preparar Latrunculina A (etapa 1.9)
4-15% Tris-HCl gel de poliacrilamidaBio-Rad3450029Uso para immunoblotting (etapa 3.3)
Membrana de fluoreto de polivinilidenoBio-Rad1620177Uso para immunoblotting (etapa 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticorpo de coelhoSinalização celular2060Anticorpo primário para uso em immunoblotting (etapa 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticorpo XPCell Signaling4370Anticorpo primário para uso em immunoblotting (etapa 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (de burro)GE HealthcareNA934-100ULAnticorpo secundário para uso em immunoblotting (etapa 3.3)
Substrato de quimioluminescência aprimorado (Clarity Western ECL Substrate)Bio-Rad1705060Uso para immunoblotting (etapa 3.3)
Tampão de decapagem (tampão de decapagem Restore Plus Western blot)PiercePI46430Uso para immunoblotting (etapa 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278Uso para immunoblotting (etapa 3.3)
K. aerogenes cepa (não patogênica)Dicty Stock Center (dictybase.org)
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais e Equipamentos
Agitador orbital (modelo G-33, ou uma alternativa comparável)New Brunswick ScientificUse para cultivar K. aerogenes (etapa 2.1.1) e para basalar e estimular células D. discoideum (etapa 3). O raio de giro para este agitador é de 9,5 mm.
Placa de Petri de 10 cmFisherFB0875712Use para preparar placas SM (etapa 1.2)
HemocitômetroFisher02-671-51BUse para contar células D. discoideum (etapa 2.1.2)
Placa de 35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)Fisher08-772AUse para plaquear D. discoideumcélulas para estimulação mecânica seguida de lise celular (etapa 3.1.1)
Copo de poliestireno (5 ml)VWR13915-985Utilizar para estimular a suspensão celular D. discoideum com um quimioatraente (passo 3.2.2)
Unidade fluídica com bomba (ibidi Pump System)Ibidi10902Utilizar para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum num canal (passos 4.1, 4.2 e 5)
Lâmina com canal (μ-Slide III 3 em 1 ibiTreat: #1.5 lamínula de polímero, tratamento para cultura de tecidos, esterilizado)Ibidi80316Use para plaquear células D. discoideum para estimulação mecânica fornecida por um dispositivo fluídico (etapas 4.1, 4.2 e 5)
Reservatórios de 50 mL (Suporte de reservatório Ibidi para unidade fluídica)Ibidi10978Use para configurar o dispositivo fluídico para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum em um canal (etapas 4.1, 4.2 e 5)
Linhas para a unidade fluídica (Conjunto de Perfusão AMARELO e VERDE)Ibidi10964Use para configurar o dispositivo fluídico para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum em um canal (etapas 4.1, 4.2 e 5). Nota: as duas linhas também podem ser cortadas da tubulação de 1,6 mm (número de catálogo 10842).
Linha para o dreno (tubulação de 1,6 mm de diâmetro interno)Ibidi10842Use para configurar o dispositivo fluídico para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum em um canal (etapas 4.1, 4.2 e 5).
Microscópio invertido Zeiss Observer.Z1 equipado com uma objetiva de óleo 40X/1,3 e uma objetiva de ar 20X/0,3 (ou uma alternativa comparável)ZeissUsado para obter imagens de células D. discoideum com contraste de fase ou iluminação de fluorescência (etapas 4 e 5)
Microscópio confocal de disco giratório UltraView equipado com um microscópio confocal de disco giratório 40&vezes;/1,25– 0,75 objetiva de óleo (ou uma alternativa comparável)Perkin-ElmerDM 16000Uma alternativa usada para criar imagens de células D. discoideum (etapa 4.1.4)
Microinjetor FemtoJet (Eppendorf; modelo 5247, ou uma alternativa comparável) com Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D e 5192000027Use para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum por uma micropipeta (etapa 4.3). Nota: o número de catálogo é para a versão mais recente do equipamento (4i).
Micropipeta (Femtotip; 1 μ m diâmetro externo, 0,5 μ m de diâmetro interno )Eppendorf930000035Use para fornecer estimulação mecânica a células D. discoideum por uma micropipeta (passo 4.3)
Pontas de microcarregador (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)Eppendorf5242956.003Use para encher a micropipeta (femtotip) com tampão (passo 4.3.1)
Câmara de 1 poço (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)Fisher12-565-472Use para plaquear células D. discoideum para estimulação mecânica fornecida por uma micropipeta (etapa 4.3.2)
Câmara de 8 poços (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)Fisher12-565-338Use para plaquear células D. discoideum para estimulação mecânica fornecida por adição de tampão em massa (etapa 4.4.1)
NomeCompanyNúmero de catálogo<strong>Comentários
SoftwareSoftware de Análise de
Imagem (Fiji)NIHhttps://fiji.sc/Use para quantificar a resposta à estimulação mecânica (etapa 4.5)
Software de análise de migração (Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/Use para quantificar a velocidade e persistência da célula (etapa 5.4)

Referências

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