Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.
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Artigo de método
Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações
Neste artigo
Resumo
Resumo
Preparações de matriz acelular extracelular são úteis para estudar interações célula-matriz e facilitam aplicações da terapia celular regenerativa. Vários produtos comerciais da matriz extracelular estão disponíveis como hidrogel ou membranas, mas estes não possuem atividade biológica de tecido-específica. Porque decellularization de perfusão geralmente não é possível com o tecido do coração humano, desenvolvemos um processo de decellularization de imersão de 3 passos. Fatias do miocárdio humanas, adquiridas durante a cirurgia são primeiro tratadas com tampão de Lise hiperosmolar livre de detergente, seguida de incubação com o iônico detergente, Dodecil sulfato de sódio, e o processo é concluído, explorando a atividade de DNase intrínseca de soro fetal bovino. Esta técnica resulta em folhas sem célula da matriz extracelular cardíaca com em grande parte preservada composição arquitetura e biopolímero de tecido fibroso, que foram mostrados para fornecer pistas ambientais específicas para populações de células cardíacas e tronco pluripotentes células. Folhas de matriz extracelular cardíaca podem então ser mais transformadas em um pó microparticulado sem mais modificação química, ou, através de digestão de pepsina a curto prazo, em um hidrogel de matriz extracelular cardíaca auto-montagem com conservados Bioatividade.
Introdução
A matriz extracelular (ECM) fornece não somente estrutural apoio mas também é importante para a célula biológica e tecido função1. No coração, o ECM participa na regulação das respostas fisiopatológicas como fibrose, inflamação, angiogênese, função contrátil de casos e viabilidade e destino de células progenitoras residente. Além de seus principais componentes fibrosas glicoproteínas, glicosaminoglicanos e proteoglicanos - contém uma série de fatores de crescimento secretados, citocinas e vesículas membranosas que contém proteínas e ácidos nucleicos2,3.
Recen....
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Protocolo
O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque e foi aprovado pela Comissão de Conselho e ética a revisão institucional da Universidade de medicina Charité. Todos os pacientes fornecidos escritos, consentimento informado para o uso de tecido cardíaco para estudos experimentais.
1. preparação do miocárdio humano para seccionamento
- Obter o miocárdio ventricular esquerdo (tamanho varia dependendo do tipo de cirurgia) diretamente da sala de operações e transporte em PBS frio em um recipiente estéril.
- Remova todo o tecido gordo com um bisturi estéril com uma lâmina n º....
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Resultados
O protocolo de 3 passos para decellularization do miocárdio humano aqui apresentados resultados em quase completa remoção de material celular, preservando-se os principais componentes de ECM e a estrutura fibrillar do ECM. Após decellularization, a bruta remoção de células do tecido é evidente pela mudança na cor (figura 1A). A análise histológica com H & E e Masson Trichrome manchas revelou a ausência completa de células intactas residuais (
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Discussão
Ao preparar o ECM do miocárdio humano, o objetivo é alcançar o seguinte: remoção de material celular imunogênica relevante, preservação da integridade de ECM e bioatividade, esterilidade, não-toxicidade do produto final, compatibilidade de GMP-processo, e adequação do produto para um determinado aplicativo em termos de manipulação. Combinando nosso protocolo de decellularization de 3 passos com tratamento subsequente em micropartículas ou auto-montagem hidrogel, material de ECM cardíaco humano é obtido que possui activid.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O protocolo do estudo está em conformidade com os princípios éticos descritos na declaração de Helsinque. Pacientes fornecido o consentimento informado para o uso do tecido para fins de investigação, e o processo de coleta de tecido foi aprovado pelo Comitê de ética da Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12) e Conselho de revisão institucional.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Suíça | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Alemanha | SK-10-004 | |
| Placas de cultura de células (6 poços) | Greiner, Frickenhausen, Alemanha | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Alemanha | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 8043.3 | |
| Tubos de reação Eppendorf (1,5 ou 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Alemanha | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Alemanha | 188271, 227270 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Biochrome, Berlim, Alemanha | S 0115 | |
| Sistema de Liofilização | Labconco, Kansas City, EUA | 7670520 | |
| Congelador (-80° C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 281.1 | |
| Lâminas de micrótomo Tipo 819 | Leica, Wetzlar, Alemanha | 14035838925 | |
| Minilys Homogeneizador | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA | 14190-094 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies, Darmstadt, Alemanha | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1,4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Alemanha | 91-PCS-CK14 | |
| Agitador de placas Rotamax 120 | Heidolph, Schwabach, Alemanha | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | Microscópio estéreo CN30.3 | |
| Leica, Wetzlar, Alemanha | M125 | ||
| Steriflip-GP, 0,22 µ m | Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha | SCGP00525 | |
| Misturadores analógicos de rolos e balancins Stuart | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T composto | Hartenstein, Würzburg, Alemanha | TTEK | |
| Conjunto de transfusão 200µ m | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Padrão, 125 mm | Destaques Médicos, Rohrdorf, Alemanha | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, Nova York, EUA | SI-0256 |
Referências
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse En....
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Reimpressões e permissões
