Guiada por estereotaxia ablação do córtex auditivo de ratos e localização da lesão no cérebro

Summary

Nós descrevemos um método para a localização de guiada por estereotaxia, exposição e ablação do córtex auditivo em ratos. A localização da ablação é avaliada utilizando uma autópsia de coordenadas de mapa.

Abstract

O córtex auditivo de ratos (AC) está se tornando popular entre investigadores de neurociência auditivo que estão interessados na plasticidade de experiência-dependência, processos de percepção auditivos e controle cortical de processamento nos núcleos auditivos subcorticais de som. Para enfrentar novos desafios, um procedimento para localizar com precisão e cirurgicamente expor o córtex auditivo aceleraria esse esforço de investigação. Neurocirurgia estereotáxica é usada rotineiramente na investigação pré-clínicos em modelos animais para engraft uma agulha ou um eletrodo em um local pré-definido dentro do córtex auditivo. O seguinte protocolo, usamos métodos estereotáxico em uma forma nova. Podemos identificar quatro pontos de coordenadas sobre a superfície da temporal bone do rato para definir uma janela que, uma vez aberto, expõe com precisão tanto o primário (A1) e secundário (Dorsal e Ventral) córtices do AC, usando esse método, em seguida, executamos um cirúrgico ablação do AC. Depois de uma manipulação tão é executada, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão das lesões feitas no córtex. Assim, podemos também descrever um método para localizar facilmente a autópsia de ablação AC usando um mapa de coordenadas construído transferindo os limites de cytoarchitectural do AC para a superfície do cérebro. A combinação da localização guiada por estereotaxia e ablação do AC com a localização da área lesada em uma autópsia mapa coordenadas facilita a validação das informações provenientes do animal e leva a uma melhor análise e compreensão dos dados.

Introduction

O rato é um dos mais utilizados modelos animais em Neurociências auditiva. A robustez do seu comportamento torna-o capaz de trabalhar por centenas de ensaios por dia. Sua sensibilidade e acuidade espectral para audição^1,2e a organização anatômica e funcional do seu sistema central, comparável de outros mamíferos³, fazem o rato um modelo animal adequado para analisar uma ampla gama de Tópicos de pesquisa em neurociência auditivo. O córtex auditivo de ratos (AC), em particular, tem sido objecto de vários estudos anatômicos e fisiológicos que tentaram compreender sua estrutura, organização e papel no processamento de som³. Hoje em dia, o AC tornou-se popular entre os neurocientistas interessados na plasticidade de experiência-dependência, percepção auditiva, a base sináptica da organização do campo receptivo e o controle cortical do processamento de som no subcortical auditivo núcleos^4,5,6,7,8,9. Para enfrentar os desafios que representam estas novas abordagens, procedimentos que podem localizar com precisão e expor cirurgicamente o AC vão acelerar os esforços de investigação. Técnicas estereotáxica facilitam a localizar regiões específicas dentro do cérebro sem testes de fisiologia. Embora o tamanho do cérebro varia ligeiramente entre os animais, a localização de qualquer área do cérebro pode ser determinada usando coordenadas estereotáxica conjunto de marcos históricos no crânio de cérebro de ratos.

A ablação restrita do AC é a remoção cirúrgica da região sensorial do córtex mais directamente relacionado com a audição. Em contraste com outros métodos usados para bloquear a atividade do AC, como refrigeração ou locais lidocaína injeções^10,11,12, a ablação cirúrgica dos resultados AC na perda crônica de função. Assim, ablações de AC são mais adequadas para estudar os efeitos a longo prazo da privação cortical, bem como os fenômenos subsequentes da plasticidade da lesão. A combinação de métodos estereotáxica com ablações cirúrgicas do AC tem sido usado com sucesso para estudar os efeitos fisiológicos, comportamentais e moleculares de controle cortical privação^{13,14,15 ,16,17,18,19}. Por exemplo, um modelo do rato com bilaterais ablações AC serviu para estudar os efeitos da ablação cortical no reflexo de alarme auditivo e tronco cerebral auditivo respostas (ABR)¹⁶. Recentemente, comparamos os efeitos tão unilaterais contra ablações bilaterais da produção rato AC em limiares ABR, amplitudes e latências em pontos diferentes de tempo após a lesão de¹⁸. Além disso, o modelo do rato de ablação de AC restritiva também tem sido usado para estudar o efeito de degeneração de caminho corticofugal no collicus inferior^13,14,15 e o ouvido interno^{17 ,19}. Depois que tal uma manipulação é realizada no cérebro, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão das lesões feitas no córtex. Embora muito útil, a principal limitação dos mapas de tonotopic com base em respostas neuronal^20,21 são as técnicas eletrofisiológicas necessárias para localizar os campos auditivos no cérebro de ratos. Uma vez que nem todos os laboratórios têm o equipamento necessário e/ou experiência para fazer essas gravações, nós construímos o mapa coordenado com base na transferência dos limites cytoarchitectural do AC para uma imagem do cérebro de superfície¹⁸. Este mapa pode ser muito útil para localizar o AC sem testes de fisiologia.

O presente protocolo descreve um método para a localização de Estereotaxia guiada, exposição cirúrgica e ablação do AC em ratos. Ele também descreve como usar o nosso mapa coordenadas¹⁸ para localizar facilmente a extensão da lesão sobre uma foto da superfície dos cérebros ablated.

Protocol

este estudo foi realizado em estrita conformidade com os regulamentos espanholas (Real Decreto 53/2013 - lei 32/2007) e as orientações da União Europeia (Directiva 2010/63/UE) sobre os cuidados e utilização de animais na pesquisa biomédica.

1. Preparação do rato

Nota: as experiências foram realizadas em ratos machos, para evitar qualquer alteração hormonal.

1. Anesthetize o animal usando uma mistura de cloridrato de cetamina (30 mg/kg) e cloridrato de xilazina (5 mg/kg) injetada por via intramuscular; com esta dose, o rato deve ser profundamente anestesiado por cerca de 1 h.
2. Beliscar o rato ' dedo s; ausência de uma retirada reflex indica que o animal é totalmente inconsciente. Se o rato responde para o aperto, dá anestesia suplementar em um terço da dose inicial.
3. Raspar o couro cabeludo e desinfetar a área cirúrgica com iodo-povidona.
4. Colocar o animal em uma almofada de aquecimento para manter uma temperatura de 38 ° C e estabilizar o animal ' cabeça de s em uma armação estereotáxica usando duas barras de orelha e um bar de mordida. Tome cuidado para evitar perfuração da membrana timpânica com as barras de orelha.
5. Proteger os olhos, aplicando uma gota de gel oftalmológico ou soro fisiológico de soro para cada olho.

2. Localização do AC no osso Temporal do rato

1. com um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha mediana para expor o crânio e retrair o periósteo que cobre a superfície do crânio.
2. Use uma ponta de algodão estéril para remover suavemente qualquer sangue cobrindo a superfície do crânio para visualizar bregma, lambda e 0 interaural de acordo com o atlas Paxinos e Watson do rato cérebro ²².
3. Fazer uma incisão no músculo temporal perto de sua inserção dorsal no crânio com um bisturi. Puxar o músculo para fora usando um material de sutura e a agulha e corrigir o material de sutura na armação estereotáxica; Isto irá expor o osso temporal. Se o sangramento ocorre, enxaguar com soro fisiológico frio.
4. Colocar uma agulha reta estéril no micromanipulador estereotáxica, certificando-se de que ele é totalmente seguro.
5. , Lentamente, abaixe a agulha até que é bem acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha é definida como 0 interaural. Definir este ponto como zero e determinar as coordenadas deste ponto.
6. Dependendo da área do cérebro de interesse, variam as coordenadas estereotáxica. Determine as coordenadas utilizando o atlas Paxinos e Watson do rato cérebro ²². Uma vez que as coordenadas são determinadas, mover a agulha para comparar essas coordenadas.
7. -Alvo o AC usando as coordenadas dos pontos seguintes quatro: r: A / P =-5,80 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + /-8,67 mm. Abaixe a agulha para a direita acima do osso temporal para visualizar cada um destes quatro pontos. Usando uma caneta marcador, marcar os pontos no osso temporal e conectá-los para desenhar um retângulo; o retângulo irá servir como um guia para abrir uma janela no osso ( Figura 1).

3. Exposição cirúrgica do AC

1. abrir a janela usando uma furadeira elétrica e uma broca pequena bit (0,6 mm Ø). O perímetro do retângulo a 8.000 rpm da broca até o osso dá afastado. Esfrie a superfície da perfuração por lavagem com solução salina fria para evitar danos às estruturas subcorticais. Quando o osso dá jeito, pode ser detectada uma queda na resistência. Tenha cuidado para não perfurar o cérebro.
2. Quando as fronteiras estão soltas, puxe o osso coberta com pinça fina e armazená-lo em soro fisiológico estéril frio.

4. Ablação do AC

1. usando um microscópio cirúrgico (10x), gentilmente cortado as meninges com uma faca microcirúrgica e removê-los usando duas belas pontas fórceps. Se o sangramento ocorre, enxaguar com soro fisiológico frio.
2. Aspire suavemente o AC usando um dispositivo de sucção cirúrgico (bar de pressão-0.24) acoplado a uma agulha estéril de ponta romba de 20 G. Este ponto é crítico e precisa ser executada com muito cuidado: Aspire somente as seis camadas corticais e não a substância branca subjacente.
3. Aspire até Parem o sangramento das artérias perfurantes.
4. Quando a aspiração é terminada, cubra a área lesada com o osso extraído e aplicar uma gaze hemostático absorvível.
5. Deixa o músculo temporal recuperar sua posição original e em seguida de sutura da pele usando clipes de ferida (9 mm). Aplique a pomada antibiótica (consulte a Tabela de materiais). Continuar a aplicar a pomada na ferida duas vezes ao dia por três dias.
   Nota: Cada aplicativo consiste em uma fina camada aplicada na ferida.
6. Buprenorfina injectar por via subcutânea na parte de trás do rato (0,05 mg/kg), como um analgésico 1 h após a cirurgia e depois a cada 8 h durante 72 h.
7. Manter o animal sobre a almofada de aquecimento até ele acorda e devolvê-lo à sua gaiola de habitação para recuperar.
8. Animais de casa individualmente para evitar que os companheiros de gaiola tocando a área suturada e fornecer alguns itens de enriquecimento. Alterar a serragem diariamente para prevenir a infecção e verificar cuidadosamente que o animal se recupera adequadamente e não mostra sinais de desconforto.

5. Coleção de tecido

atenção: ao manusear paraformaldeído (PFA), sólido e aquoso, usar equipamentos de proteção individual (EPI) e usar um gabinete de segurança.

Nota: preparar 750 mL de solução de formaldeído, dissolvendo a 4% (p/v) PFA em 1 x solução de tampão fosfato (PBS) usando o calor (55 ° C). Filtre a solução de formaldeído com papel de filtro. Preparar o Ringer ' s solução dissolvendo 8,5 g de NaCl, 0,25 g de KCl e 0,2 g NaHCO ₃ em 1.000 mL de água (pH da solução = 6,9).

1. Deixa o animal sobreviver por enquanto é necessário para o estudo. Quando estiver concluída a pesquisa realizada com o rato ablated AC, terminal anestesiá-lo por injeção intra-peritoneal de 0,1 mL de pentobarbital de sódio (60 mg/kg). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada de dedo do pé e a ausência de reflexo de retirada.
2. Quando o animal é anestesiado profundamente, executar uma perfusão intracardíaca ²³ de 125 mL de Ringer ' s solução seguido de 750 mL de solução de formaldeído, usando um medidor de agulha de 1,8 mm de diâmetro interno.
3. Quando a perfusão é terminado, decapitar o rato na primeira vértebra cervical.
4. Tesoura uso para remover a pele e músculos da cabeça e expor o crânio. Use uma tesoura para cortar e abrir o buraco occipital e remover a parte de trás do crânio.
5. Faça um transversal corte no osso orbital usando tesoura Spencer e use ruginas para cortar ao longo das bordas superiores do crânio para expor o cérebro. Tenha cuidado para não danificar o cérebro.
6. , Uma vez que o cérebro é exposto, remova com cuidado a dura-máter usando pinça fina-apontou. Use um dedo suavemente colher sob e elevar o cérebro. Levantar o cérebro e cortar a nervos untIl é gratuito. Mergulhe o cérebro na solução de formaldeído e armazená-lo em 4 ° C por 24 h.

6. Localização das lesões AC

1. após a pós-fixação, coloque cuidadosamente o cérebro em uma matriz de cérebro de rato sagital expondo a face lateral do cérebro.
2. Coloque uma câmera 21 cm acima da superfície de córtex usando um suporte de câmera, selecionar o " super macro tiroteio " modo e tire uma foto da superfície do cérebro.
3. Colocar o cérebro em uma matriz de cérebro de rato coronal expondo a superfície dorsal do cérebro e tirar outra foto.
4. Usando um programa de editor de imagem, abra as imagens e dimensioná-los abaixo de 50% para tornar mais fácil trabalhar com eles. Identificar o bregma, lambda e interaural 0 referências sobre a imagem de acordo com Paxinos e Watson coordenadas ¹⁹ e marcar a sua posição nas fotos ( Figura 2). Desenhe o contorno da ablação sobre a imagem lateral do cérebro. Calcular o perímetro.
5. Importação a coordenada mapa onde o principal (A1) e regiões secundárias (Dorsal e Ventral córtices) de AC estão localizado ¹⁸ para o arquivo do programa editor onde você está trabalhando com as fotos. Clique no mapa e arraste-o para sobrepô-lo à fotografia lateral do cérebro ablated.
   1. Fazer o bregma e referências de lambda do mapa coordenada coincidam com as referências de bregma e o lambda identificadas na imagem do cérebro lateral.
   2. Usar a fissura rhinal como referência para ajustar a imagem do cérebro para o mapa e fazê-los coincidir ( Figura 2B).
6. Calcular a porcentagem da lesão em relação à área ocupada pela AC...

Results

Realizamos uma localização guiada estereotaxia, exposição cirúrgica e ablação unilateral do AC em três ratos Wistar. A localização da lesão confirmou que ablações realizadas nas três ratos invadiu as principais subdivisões do AC (córtices primários, dorsais e ventrais) e era composta por uma gama de 80 a 100% da área total de AC (Figura 2B).

O protocolo descrito aqui para executar ablações de AC restritivas anteriormente foi usado em nosso laboratório para estudar os efeitos a longo prazo da privação de controle cortical nos núcleos auditivos subcorticais, bem como os fenômenos subsequentes da plasticidade. Nestes estudos, o protocolo de ablações AC foi validado aplicando fisiológico (ABR), comportamentais (assustar respostas, prepulse inibição; PPI) e moleculares (DNA microarrays, qPCR e Western Blot) métodos^{13,14,15,16,17,18,19}. Aqui, para demonstrar a eficácia do nosso protocolo, deixamos os três ratos AC ablated sobreviver durante uma semana, e recolhidos os cochleae durante a coleta de tecido para estudar as alterações na expressão das subunidades Leandro mais relevantes presentes na cóclea adulta , GluA2 e GluA3, por qPCR. A comparação entre as transcrições de AC retirado de ratos e animais controle de Souza onde foi realizado todo o processo de cirurgia, mas não a ablação cortical mostraram um para baixo-regulamento para GluA2 e uma regulação para GluA3 em ambos os cochleae (Figura 3) , que é de acordo com nosso anterior estudo¹⁹.

Figura 1: imagens do rato osso temporal em três diferentes etapas cirúrgicas. (A) transferência das coordenadas estereotáxicos do AC no osso temporal. As coordenadas dos quatro pontos são: r: A/P =-5.8 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + /-8,67 mm. (B) as coordenadas são utilizadas como referência para desenhar um retângulo na superfície do osso temporal que guiarão a abertura de uma janela. (C) mostra a janela aberta no osso após a perfuração. As meninges com vasos sanguíneos podem ser observadas na superfície do cérebro. R: rostral, d: dorsal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: procedimento para a localização de lesões no cérebro de ratos. (A) fotografia da superfície dorsal de um cérebro AC ablated com agulhas Estereotaxia implantados em Lambda e Bregma (de acordo com Paxinos e Watson coordenadas¹⁹). Linhas pontilhadas marcar a posição de Bregma e Interaural 0 na grade 9 x 9 cm, bem como na superfície dorsal do cérebro. (B) fotografia da superfície lateral do cérebro ablated sobreposta ao mapa coordenado do AC. O perímetro da lesão é marcado em vermelho na foto. O perímetro da área de AC é rotulado de preto no mapa. Neste exemplo, a percentagem de ablação de AC em relação a área total ocupada pelo AC é 84.79%. AC: o córtex auditivo, IA: inter aural, FR: fissura Rhinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: alterações nos níveis de RNAm de subunidades do receptor GABA GluA2 e GluA3 depois unilateral pós-lesão ablações AC de 7 dias. Os resultados são apresentados como o média ± desvio-padrão da mudança dobra. Alterações para transcrições de GluA2 são representadas em azul. Mudanças para GluA3 transcrições são apresentadas em vermelho. Uma diminuição significativa no GluA2 e um aumento na GluA3 são observadas em ambos os cochleae (ipsi - e contralateral para a ablação) em relação a controles de farsa com nenhum ablações corticais em 7 dias após a cirurgia; Isto está de acordo com nossos anteriores resultados¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Uma cirurgia bem sucedida depende em cima de dois fatores: manter o animal vivo durante e após o procedimento e localizar com precisão a área de interesse. Garantindo que o rato é profundamente anestesiado durante a cirurgia (teste do reflexo de retirada) e recebe adequados analgésicos e antibióticos ototóxicos-não devem ajudar a sobrevivência. Além disso, o rato deve ser mantido em uma almofada de aquecimento até acorda da anestesia para evitar a hipotermia. Sutura irá diminuir a susceptibilidade à infecção, e uma técnica adequada é vital: animais vão pegar em seus clipes de ferida, então eles devem ser implantados firme o suficiente para impedir a remoção sem colocar muita tensão na ferida.

Para localizar com precisão o AC (ou qualquer outra área cortical), é importante determinar a posição de bregma, lambda e 0 interaural para usá-los como referências para calcular os limites da região alvo. Qualquer erro no cálculo as coordenadas resultará na ablação parcial de AC ou a aspiração indesejada de outras áreas circundantes. Assim, a ponta da agulha deve apenas tocar o osso em interaural 0 e em seguida traduzir as coordenadas antero-posterior e medio-lateral, de acordo com o que está descrito neste protocolo.

Neste manuscrito, também descrevemos como cirurgicamente expor e ablate o AC. Há três etapas essenciais: o processo de perfuração, a abertura e remoção das meninges e a ablação por aspiração. De perfuração deve ser realizada a baixa velocidade com pressão mínima, como uma perfuração de alta velocidade gera calor que pode afetar nas proximidades de estruturas subcorticais. No entanto, manter uma velocidade baixa e resfriamento da área de perfuração com soro fisiológico frio devem impedir qualquer dano. Além disso, a pressão mínima é essencial para evitar uma ruptura repentina do crânio e lesões subsequentes ao córtex subjacente. A abertura e remoção das meninges que cobrem o AC devem ser realizadas com cuidado para evitar a interrupção dos vasos sanguíneos. Se o sangramento ocorre, o diagnóstico precoce e tardia é geralmente desfavorável e é questionável se um animal satisfaz os critérios de inclusão para um estudo confiável. Neste caso recomendamos a eutanásia. Finalmente, a aspiração (provavelmente o aspecto mais difícil na realização de uma efetiva lesão), deve ser restrito a matéria cinzenta. Há dois indicadores que podem ajudar a detectar a presença de matéria branca: (1) uma mudança no contraste de cor, como a substância branca é mais brilhante do que a matéria cinzenta; e (2) a cessação do sangramento das artérias perfurantes.

Após qualquer manipulação realizada no cérebro, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão do procedimento feito no córtex para posterior análise e validação de dados provenientes do animal. Neste manuscrito, detalhamos como localizar a ablação realizada no córtex, usando um mapa de coordenadas descrito anteriormente pelo nosso grupo de¹⁸. Este mapa foi construído usando referências anatómicas obtidas reconstruções serial seção de cortes histológicos, correlacionados com o atlas Paxinos e Watson do rato cérebro²². Nesse sentido, o mapa diferencia-se entre o primário (A1) e córtices secundários (Dorsal e Ventral) do AC. A principal vantagem deste mapa coordenadas é que permite a rápida localização da lesão sobrepondo uma foto tirada da superfície lateral do cérebro colocado numa matriz sagital do cérebro. Outra vantagem é que laboratórios com menos experiência em anatomia podem usar o mapa pela adaptação ao seus modelos animais. Só é necessário definir as distâncias entre bregma, lambda e interaural 0 referências em um cérebro de controle perfundido e escala o mapa para cima ou para baixo em conformidade. Use a fissura Rhinal como referência para ajustar as imagens do cérebro para o mapa. A profundidade da ablação não pode ser determinada neste mapa coordenadas, então deve ser determinado em secções histológicas de cérebro.

A combinação de métodos estereotáxica com a exposição cirúrgica do AC são métodos básicos que poderiam facilmente ser adaptados por qualquer pesquisador que deseja direcionar o AC no rato. Isto pode ser para um experimento agudo ou que requer a implantação de dispositivos permanentes. Além disso, a ablação cirúrgica do AC anteriormente serviu como modelo para estudar os efeitos da privação crônica de cortical em audiência. Ablações AC também poderiam ser usadas para estudar os efeitos que unilateral ablações AC exercem em outras áreas corticais, ou servem como um modelo de acidente vascular cerebral. Assim, os projetos experimentais descritos aqui são métodos úteis que podem ser aplicados individualmente ou em combinação para uma ampla gama de projetos experimentais.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quadro estereotáxico	David Kopf Ins.	900
microscópio cirúrgico	WILD M650 Heerbrugg
Almofada de aquecimento	DAGA
Micromotor dental	W& H elco	5118
Diamond burr	B Braun	GD021R	0,6 mm
Dispositivo de sucção cirúrgica	Atmos	Atmoforte E2
Cetamina	Merial		30 mg/kg
Xylazine	Bayer		5 mg/kg
Micromanipulador	Narishige	SM-11
Bisturi	Lawton
Povidona	iodo Meda	Betadine
soro salino estéril	B.Braun
20G agulha estéril	Terumo Neolus
Pontas
Material de sutura	B.Braun
Pomada Antibiótica	Quadriderme (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough
Fórceps	dimeda	10.331.12
Agulhas cirúrgicas	World Precision Instruments	501940
Buprenorphine	Indivior UK	Buprex	0,05 mg/kg
Scissor	dimeda	08.120.15
Spencer scissor	dimeda	08.804.14
Rongeurs	Lawton
Faca microcirúrgica	MSP	7503
Gaze hemostática absorvível	Surgicel
Saggital rato Matriz cerebral	Sistemas de ativação Inc.	RBM-1000DV / RBM 4000C
Pentobarbital de sódio	Vetoquinol		60 mg/kg
Câmera	Olympus 5.1 MP	C-5060 lente zoom ampla	F2.8-4.8
Clipes de ferida	Reflex 9		9 mm
Canvas 12	ACD Systems
diâmetro do calibre			1,8 mm
Funil separatório	labbox	11409	500 mL
GluA2 primer Forward	GeneBank	NM_017261	CGGCAGCTCAGCTAAAAACT
GluA2 primer Reverse	GeneBank	NM_017261	TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA
GluA3 primer Forward	GeneBank	NM_032990	ATTGCTGATGGTGCAATGAC
GluA3 primer Reverse	GeneBank	NM_032990	TTTGCATTGTCGCAAGTCTC