Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.
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Artigo de método
Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral
Neste artigo
Resumo
Resumo
Norovirus humano exige considerável da saúde pública e prejuízos econômicos em todo o mundo. Emergentes em vitro avanços de cultivo não são ainda aplicáveis para rotina detecção do vírus. A atual detecção e técnicas de quantificação, que dependem principalmente de amplificação de ácidos nucleicos, não discriminamos infecciosas de partículas virais não infecciosas. O objetivo deste artigo é apresentar detalhes específicos sobre recentes avanços em técnicas usadas em conjunto a fim de adquirir mais informações sobre o status de infecciosidade de partículas virais. Uma técnica envolve avaliar a vinculação de um norovírus ssDNA aptamer para capsids. Aptamers tem a vantagem de ser facilmente sintetizado e modificado e são baratos e estável. Outra técnica, dinâmica, espalhando luz (DLS), tem a vantagem de observar o comportamento do capsídeo em solução. Microscopia eletrônica permite a visualização da integridade estrutural dos capsids do virais. Apesar de promissor, existem alguns inconvenientes para cada técnica, tais como específico aptamer ligação às moléculas de carga positiva de matrizes de amostra, exigência de capsídeo purificada por DLS e sensibilidade pobre para microscopia eletrônica. No entanto, quando estas técnicas são usadas em combinação, o corpo de dados produzidos fornece informações mais abrangentes na integridade de capsídeo norovírus, que pode ser usada para inferir a infecciosidade, informação que é essencial para a avaliação exata do métodos de inativação ou interpretação de detecção de vírus. Este artigo fornece protocolos para usar esses métodos para discriminar partículas infecciosas norovírus humano.
Introdução
Norovirus humano é responsável por um peso considerável da saúde pública globalmente, causando doenças aproximadamente 685 milhões e 212.000 mortes anualmente1, com um custo de bilhões de dólares,2,3. Hoje, quantificação e deteção de norovírus envolve a amplificação do genoma e/ou plataformas baseadas em ligante. O primeiro é geralmente preferido, pois é mais sensível, fornece informações quantitativas e tem geralmente menor risco de resultados falso-positivos4. A técnica mais comum norovírus deteção e quantificação do genoma amplificação é reação em cadeia da po....
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Protocolo
1. baseados em placa de ensaio de vinculação para avaliar perda de maior ordem norovírus capsídeo estrutura
Nota: um protocolo ELASA muito semelhante ao que aqui apresentado tem sido publicado 29, e ensaios ELASA semelhantes anteriormente foram relatados como parte da pesquisa em outro lugar artigos 17 , 18 , 22.
- Tratamento térmico de norovírus humano capsids de Sydney GII.4
- obter norovírus humano purificado da proteína de capsídeo maior (VP1) de Sydney GII.4 (adesão: JX459908) montad....
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Resultados
A integridade estrutural do norovírus humano capsids de Sydney GII.4 (VIPs) foi avaliada usando vários métodos de romance, tal como apresentado por Moore et al 17. em primeiro lugar, uma experiência foi feita que a integridade dos capsids em função da sua capacidade de se ligar um putativo do receptor/co-factor (HBGA) ou aptamer ssDNA (M6-2) foram comparados (Figura 1). Os resultados exibidos anteriormente apresentados por Moo.......
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Discussão
O protocolo e as técnicas descritas aqui fornecem um meio de avaliar o norovírus humano capsídeo integridade/funcionalidade. Esses métodos podem ser usados para obtenção de uma visão mecanicista sobre os efeitos dos tratamentos de inactivação contra o vírus e potencialmente podem complementar mais tradicionais métodos de avaliação de inactivação como RT-qPCR ou placa de ensaio. Por exemplo, a avaliação de inativação química ou física por ensaio de placa sozinho fornece uma medida do grau de inativação de vírus, mas não o.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela agricultura e comida pesquisa iniciativa competitiva Grant no. 2011-68003-30395 do departamento de agricultura dos Estados Unidos, Instituto Nacional de alimentação e agricultura, através do projeto NoroCORE. Financiamento para carga de acesso aberto foi fornecido pelo departamento de agricultura dos Estados Unidos. Gostaríamos de agradecer a Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) gentilmente fornecendo-no capsids purificados e Valerie Lapham pela sua assistência com as imagens de temperatura. Também gostaríamos de agradecer Frank N. Barry por nos ajudar a começar as experiências apresentadas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ensaio de ligação baseado em placa para avaliar a perda de estrutura do capsídeo de norovírus de ordem superior | |||
| 96 poços, placa EIA de poliestireno de ligação média | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Tampa para placa de 96 poços | Thermo Fisher | 3098 | |
| (Parafilme) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7,2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polissorbato 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polissorbato 20 | N/A | N/A | |
| Capsídeos de norovírus humano GII.4 purificados e montados | N/ | A N/A | |
| Tubos de PCR individuais de 0.2 ml | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 termocicladores | Bio-Rad | ||
| Mini centrífuga de mesa | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Sólidos de leite desnatado | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Dissacarídeo sintético do grupo sanguíneo histo-sangue, biotinilado | Glycotech | 01-017 | |
| Aptâmero biotinilado M6-2 (concentração de estoque 100 µ M em água livre de nuclease): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3' | Conjugado de | ||
| estreptavidina-rábano peroxidase (grau ELISA), usamos Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| substrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), temperatura ambiente | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M ácido fosfórico | N/A | N/A | |
| Leitor de microplacas capaz de ler 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel ou programa similar | N/A | N/A | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, ou instrumento de análise de tamanho de partícula semelhante | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Cubeta de quartzo Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Hellma | 104-002-10-40 | ||
| Cubeta descartável de pequeno volume (para reduzir o uso de VLP) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Nome | Company | Número de Catálogo | Comentários |
| Preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão | |||
| microscopia eletrônica de níquel com filme de suporte de carbono | Ladd Research | 10880-100 | |
| Pinças de microscopia eletrônica reversa de fechamento automático | Ted Pella | 5372-NM | |
| Papel de filtro qualitativo | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Vidro placas de Petri | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| solução de HEPES estoque 100 mM (pH 7,2) | N/A | N/A | |
| acetato de uranila a 2% | N/A | N/A |
Referências
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
- Scharff, R. L.
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Reimpressões e permissões
