Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.
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Artigo de método
Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1
Neste artigo
Resumo
Resumo
Anticorpos neutralizantes contra a hemaglutinina (HA) de vírus da gripe são considerados o principal mecanismo imune que se correlaciona com proteção para infecções de gripe. Ensaios de Microneutralization (MN) são frequentemente usados para medir respostas de anticorpos neutralizantes em soros humanos após vacinação gripe ou infecção. Madine Darby Canine renal (MDCK) as células são o substrato de célula comumente utilizada para ensaios de MN. No entanto, atualmente circulam 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe adquiriram o vírus alterado especificidade de ligação do receptor. A linhagem de células MDCK-SIAT1 com metades de aumento α-2,6 siálico galactose na superfície provou para fornecer melhorada infecciosidade e replicações mais fiel do que células MDCK convencionais para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Aqui, descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 que foi otimizado para quantificar os anticorpos neutralizantes para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Neste protocolo, soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para vincular aos vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir que A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada bem é quantificada por um ensaio imunoenzimático (ELISA) usando antigripe uma cadeia (NP) os anticorpos monoclonais. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece ≥ 50% de inibição de infecciosidade do vírus.
Introdução
Vírus da gripe continuam a causar morbidade e mortalidade na população humana, a cada ano. HA é a glicoproteína de superfície principal de vírus da gripe. Anticorpos neutralizantes direcionamento HA são o principal mecanismo imune que se correlaciona com a proteção da gripe infecção1,2. Ensaios de inibição (HI) de hemaglutinação e ensaios de MN são dois métodos amplamente utilizados para medir respostas de anticorpos no soro humano após gripe infecção ou vacinação3. O ensaio de HI mede anticorpo da inibição da hemaglutinação vírus das células vermelhas do sangue e é considerado um ensai....
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Protocolo
Todos os vírus da gripe devem ser tratados de acordo com requisitos de nível de biossegurança adequado (BSL-2 ou superior) como definido na Biossegurança na microbiológicas e Biomedical Laboratories (BMBL)12.
1. preparação dos reagentes e matérias-primas
-
Preparar células MDCK-SIAT1 e meio de cultura celular estéril
- Preparar o meio de cultura de células MDCK-SIAT1 usando de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) de 500 mL com glicose alta, inactivados por calor de v/v de 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, sulfato 1mg/....
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Resultados
Determinação da infectividade das populações de vírus é o primeiro passo no ensaio de MN. A Figura 2 ilustra o layout da placa para determinar a TCID50 das populações de vírus. Para reservas de vírus com infecciosidade desconhecida, o vírus pode ser titulado de várias pre-diluições, por exemplo 10-2 e 10-3, a fim de capturar a melhor curva de titulação para calcular a infectividade do vírus. A quantidade de vírus utilizada no .......
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Discussão
O ensaio de MN é um dos principais ensaios utilizados para sorologia de gripe para detectar respostas de anticorpos após a infecção da gripe ou vacinação. Títulos gerados a partir de ensaios de MN são usados frequentemente como o resultado primário de muitos estudos de gripe hematológicas. Ensaios de MN são também amplamente utilizados para sero-diagnóstico e avaliação da imunogenicidade da vacina. Internacionais interlaboratório estudos têm sido realizados para comparar os ensaios de MN, realizados em vários laboratório.......
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Divulgações
Os autores não relatam nenhum conflito de interesses. Os resultados e conclusões contidas nesta publicação são as dos autores e não representam necessariamente as opiniões dos centros para controle de doenças e prevenção e a agência de financiamento.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu e MS. Ashley Burroughs da divisão da gripe do CDC para sua revisão crítica e assistência na preparação deste manuscrito. Agradecemos o Dr. Adrian Reber da divisão da gripe do CDC por sua assistência na preparação os gráficos da Figura 3. Por último, agradecemos o Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemanha para fornecer as células MDCK-SIAT1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) com alta glicose | Ciência da Vida | 11965 | Um componente crítico da Cultura de Células Estéril, Propagação de Vírus e Meio Diluente de Vírus |
| Soro fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) Fração V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamina | Ciência da Vida | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Life Science | 15140-122 | |
| Acetona | VWR | 67-64-1 | Usado a uma concentração de 80% |
| Tampão de Fosfato-Citrato com Perborato de Sódio | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Fenilenodiamina Dicloridrato | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 comprimido por 100ml de água de grau de cultura celular |
| Ácido sulfúrico | Fisher Scientific | A510-P500 | Usado 0,5M concentração final |
| Etanol, Desnaturado, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Usado a uma concentração de 70% |
| Tripsina-EDTA | Life Science | ||
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| Placas de fundo plano de 96 poços | Thermo Scientific | 3455 | |
| Leitor de placas | Dispositivo molecular | Spectromax 384 plus | |
| Frasco de cultura de células 162 cm2/Tampa de ventilação | Corning/VWR | 3151 |
Referências
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....
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Reimpressões e permissões
