Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Resumo

Migração celular é essencial para o desenvolvimento, manutenção de tecidos e reparação e tumorigênese e é regulada por citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Este protocolo descreve o ensaio de ponto, um ensaio de migração bidimensional, irrestrita para avaliar o fenótipo migratório de folhas de célula unida, coesa, em resposta a sinais microenvironmental.

Resumo

Apesar de organismos complexos aparecem estáticos, seus tecidos estão sob contínua um volume de negócios. Como células de idade morrem e são substituídas por novas células, as células mover dentro de tecidos de forma bem orquestrada. Durante o desenvolvimento do tumor, este equilíbrio é perturbado, e células tumorais deixar o epitélio de origem para invadir o local microambiente, para viajar para locais distantes e, finalmente, formar tumores metastáticos em locais distantes. O ensaio de ponto é um ensaio de migração irrestrita simples, bidimensional, para avaliar o movimento líquido de folhas de célula em uma área livre de célula e analisar parâmetros de migração celular utilizando imagens de lapso de tempo. Aqui, o ensaio de ponto é demonstrado usando um humano invasivo, formadoras de pulmão em linhagem de células de câncer de mama, MCF10CA1a, para analisar a resposta de migratória das células para fator de crescimento epidérmico (EGF), que é conhecida por aumentar o potencial maligno das células de câncer de mama e para alterar o fenótipo migratório das células.

Introdução

Ensaios de migração são amplamente utilizados para avaliar o potencial invasivo e metastático do tumor células em vitro. Mais comumente, a ferida ou ensaio zero é usado para avaliar a migração de folhas epiteliais em uma célula desmarcada área^1,2,3. Para realizar o ensaio de zero, as células são banhadas em um monolayer e uma área livre de célula ou "zero" é criada com uma ponta da pipeta. O ensaio de zero é fácil de configurar com suprimentos de cultura de tecidos comumente disponíveis e pode ser executado em placas multi bem, permitindo processamento de amostras mú....

Protocolo

1. revestimento de pratos (dia 1)

Nota: Certifique-se para não deixar impressões digitais ou sujeira na parte inferior da placa, quando manuseá-lo.

1. Descongelar o colágeno rato IV no gelo e dilui-lo com 50mm HCl (pH 1,3) para preparar 3 mL de solução 10 µ g/mL colagénio IV.
   Nota: Colágeno irá precipitar a 37 ° C. Portanto, é importante manter a solução de colágeno em uma baixa temperatura ao descongelamento e trabalhar com ele. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento por preparar alíquotas de tamanhos adequado e armazená-los a-80 ° C.
2. Adicionar solução de colágeno IV 250 µ l de cada poço de placas de vidro 12-poço fundo e co....

Resultados

O ensaio de ponto aqui apresentado (Figura 1) foi realizado utilizando invasiva, colônia de pulmão formando células de câncer de mama (MCF10CA1a) como um sistema modelo. O ensaio de ponto rende pontos de célula altamente reprodutível nem na mão de iniciantes, tornando-se um conveniente e fácil de executar o ensaio (Figura 1D). O ensaio de ponto combinado com ele mancha, ou lapso de tempo de imagem e subsequente V.......

Discussão

Durante as células de progressão do tumor migre longe do tecido de origem para invadir o tecido circundante e metástase para locais distantes¹⁵. Migração de células de uma colônia de células pode ser observada no ensaio de ponto. Aqui, o ensaio de ponto é ilustrado por analisar o fenótipo migratório de células de câncer de mama humano em resposta a EGF.

Para obter resultados precisos e replicáveis várias etapas na configuração do ponto os ensaios são críticos. Primeiro,.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células MCF10CA1a	N/A	Instituto de Pesquisa Karmanos	usadas para ensaio
de colágeno de camundongo IV	BD Biosciences	354233	usadas para revestir placas
tripsina / EDTA	Thermo Fisher	25300054	usado para remover células de placas de cultura de tecidos
DPBS	Mediatech	21-031-CV	usado para lavar células
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	usado como meio de cultura
de soro de cavalo	Thermo Fisher	26050088	usado para complementar o meio de cultura
12 bem placa de fundo de vidro	MatTek	P12G-1.5-14-F	usado para cultivar células para geração de imagens
EGF (fator de crescimento epidérmico, humano recombinante)	Peprotech	AF-100-15	usado para estimular células
livres de ácidos graxos BSA	Sigma	A8806-1G	usado para fazer tampão para hematoxilina EGF
	Sigma	HHS32	usado para corar colônias
eosina	Microscopia Eletrônica Sciences	26051-10	usado para corar colônias
37 ° C, 5% CO2 incubadora	Sanyo	modelo MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver com câmara de incubadora e platina motorizada	Zeiss	modelo Axio Observer.Z1	usado para imagens de lapso de tempo
ORCA Flash LT câmera sCMOS	BioVision	C11440-42U-KIT	usado para imagens de lapso de tempo em combinação com Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software usado para imagem de lapso de tempo
invertido	Olympus	modelo IX70	usado para contar células e verificar colônias em caixa
plástica	Lock& Fechadura	N/A	usada como câmara úmida (qualquer caixa plástica de fechamento hermético que se encaixe nas placas pode ser usada)

Células do microscópio de cultura de tecidos