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Artigo de método

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

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DOI:

10.3791/56453

⸱

6 de fevereiro de 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

Resumo

Meiótica progressão nos machos é um processo que exige a acção concertada de uma série de eventos celulares altamente regulamentados. Erros que ocorrem durante a meiose podem levar à infertilidade, perda de gravidez ou defeitos genéticos. Começando no início da puberdade e ao longo da vida adulta, contínuas ondas semisíncronas de espermatócitos submetido a espermatogênese e, finalmente, formam espermatozoides haploides. A primeira onda de espermatócitos de rato em fase meiótica iniciação aparecem no 10º dia pós-parto (dpp 10) e são liberados no lúmen dos túbulos seminíferos como esperma madura no dpp 35. Portanto, é vantajoso utilizar ratos dentro desta janela de tempo do desenvolvimento, a fim de obter populações altamente enriquecidas de interesse. Análise dos estágios de célula rara é mais difícil em ratos mais velhos devido à contribuição das sucessivas ondas espermatogênico, que aumentam a diversidade das populações celulares dentro dos túbulos. O método descrito aqui é uma técnica facilmente implementada para a avaliação citológica das células encontradas nos túbulos seminíferos dos ratos, incluindo espermatogónias espermatócitos e espermátides. A técnica de abóbora túbulo mantém a integridade das células germinativas masculinas isoladas e permite a análise das estruturas celulares que não são facilmente visualizados com outras técnicas. Para demonstrar as possíveis aplicações desta técnica de abóbora do túbulo, montagem do eixo foi monitorada em espermatócitos progredir através da prófase para metáfase que eu transição (transição G2/MI). Além disso, duplicação centrossoma, inativação do cromossomo meiótico de sexo (MSCI) e formação de cromossomo buquê foram avaliados como exemplos das estruturas citológicas que podem ser observadas usando esse método de abóbora do túbulo. Esta técnica pode ser usada para identificar defeitos específicos durante a espermatogênese causadas por mutação ou perturbação exógena, e assim, contribui para a nossa compreensão molecular da espermatogênese.

Introdução

Meiose é um evento complexo celular em que uma única rodada de replicação do DNA é seguida por duas rondas sucessivas de divisão celular. Vários eventos de meiose específicos devem ser coordenados durante os estágios iniciais da meiose para garantir a segregação do cromossomo precisos. Estes eventos incluem a conclusão de recombinação homóloga, co a orientação da irmã cinetócoros durante a primeira divisão meiótica e a perda gradual de cohesin complexos para resolver chiasmata entre homologs. Regulamento preciso destes processos é necessário para manter a fertilidade e evitam que podem levar a disfunções no desenvolvimento genéticas e aborto espontâneo1cromossoma missegregation eventos.

Enquanto os principais eventos da meiose ocorrem em machos e fêmeas, existem diferenças significativas de temporais e mecanicistas entre espermatogênese e a ovogênese2. Por exemplo, durante a meiose feminina, prófase I ocorre durante o desenvolvimento embrionário e prende no estágio de Dictióteno até a puberdade. Em contraste, a espermatogênese começa na puberdade e progride em ondas por toda a vida adulta, sem prisão. As diferenças entre masculino e feminino meiose enfatiza a necessidade de desenvolver métodos que são servidos especificamente para avaliar estes processos em espermatócitos e oócitos. Atualmente, avaliar progressão meiótica em grande parte se baseia na utilização de cromatina se espalha3,4,5. Enquanto cromatina spreads são úteis para o estudo de cromossomos meióticos, eles falham preservar a integridade celular, impedindo a avaliação de estruturas celulares como os microtúbulos do fuso, centrossomas, o envelope nuclear e anexos dos telômeros. Ao vivo de imagens e técnicas de cultivo a longo prazo avançaram muito nossa compreensão da meiose feminina; abordagens semelhantes para visualizar toda a célula intacta, no entanto, são menos frequentemente implementadas para o estudo da espermatogênese6,7. A fim de Visualizar eventos dinâmicos durante a meiose masculina, adaptaram-se técnicas de abóbora túbulo estabelecido para avaliar rapidamente as características citológicas de desenvolver rato espermatócitos8,9. O método descrito aqui mantém a integridade da célula, permitindo o estudo de várias estruturas celulares durante diferentes estágios da espermatogênese.

Esta técnica de abóbora do túbulo é uma abordagem de célula inteira, o que permite a avaliação de estruturas celulares através de microscopia de imunofluorescência. Abordagens histológicas comuns Visualizar meiótica progressão em ratos masculinos como hematoxilina e eosina mancha de parafina incorporado testículos e rotulação de imunofluorescência de cryosections permitem uma visão ampla da progressão meiótica. No entanto, essas técnicas não conseguem resolver células únicas na medida do necessário para uma análise detalhada dos eventos ocorridos durante a meiose10,11. Técnicas alternativas para visualizar processos meióticos dependem quimiosmótica significativa perturbação para a maturação para isolar e corrigir materiais nucleares3,4,5. Estes tratamentos químicos dificultam a observação dos tipos de célula diferentes espermatócitos primários. Um método recentemente descrito por Namekawa permitiu que a comunidade de pesquisa preservar a arquitetura nuclear de espermatócitos isolados, mas requer o uso de um cytospin e acessórios que podem não estar prontamente disponíveis para alguns laboratórios4. Em contraste, a técnica de abóbora túbulo requer apenas o equipamento que é geralmente padrão na maioria dos laboratórios de biologia celular.

O método de abóbora túbulo descrito aqui pode ser usado para visualizar os tipos de célula diversos encontrados dentro do túbulo seminífero, incluindo células de sertoli, espermatogónias, espermatócitos primários e secundários, espermátides e. Por esta técnica de engate com a primeira onda perto-síncrono de espermatogênese em camundongos juvenis, é possível obter populações enriquecidas de células espermatogênico medida que progridem através de de meiose12. Este processo permite a análise detalhada dos processos em toda a espermatogênese, como primeiros eventos da prófase, metáfase, a anáfase transições e acridina e G2/MI. Além disso, preparações de abóbora túbulo podem ser usadas para visualizar características citológicas dos cromossomas (por exemplo, domínios interchromatid (ICDs) e cinetócoros) e centrossomas (centríolos e pericentriolar material/matrizes). O método de abóbora pode ser prontamente executado em paralelo com outras abordagens experimentais, tais como cromatina spreads e extração de proteínas. Além disso, esta técnica foi modificada com sucesso para depositar as células espermatogênico em lâminas para visualização directa13.

O método descrito aqui envolve uma técnica de abóbora de tubo seminífero células inteiras para analisar a transição G2/MI em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem. As características citológicas de espermatócitos primários, entrando a primeira divisão meiótica foram visualizadas com microscopia de imunofluorescência para observar o fuso meiótico. Esta técnica versátil pode ser facilmente modificada para visualizar outros estágios meióticos e diferentes tipos de células. A técnica também é passível de estratégias de visualização alternativos, tais como o DNA e RNA peixe abordagens.

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Protocolo

O uso de ratos foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e usar o Comitê da Universidade Johns Hopkins. Experimentos foram realizados no juvenil (20-26 dias pós-parto, dpp) camundongos C57BL/6J, aproveitando-se da primeira onda semisíncrona de espermatogênese. No entanto, esta técnica também pode ser realizada usando ratos adultos.

1. dissecção e o isolamento dos túbulos seminíferos do mouse

  1. Prepare o reparo/solução e anticorpo diluição do lysis (ADB) descrito na tabela 1 e tabela 2.
  2. Prepare um prato de Petri 35mm com 3 mL de 1x tampão fosfato solução salina (1X PBS, pH 7,4) e um outro prato de 35 mm com 2 mL da solução de correção/lise por rato.
  3. Sacrificar o mouse através de deslocamento cervical ou CO2 asfixia e pulverizar o abdômen ventral com etanol a 70%. Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Então remova os testículos puxando a epidídimo almofada gorda usando fórceps e evitar perturbar a túnica albugínea. Coloque os testículos em um prato de Petri 35mm contendo 1X PBS.
    Nota: Utilize a primeira onda de espermatogênese para observar uma população celular enriquecido de interesse14. Estágios específicos da espermatogênese são enriquecidos em idades diferentes do rato (tabela 3).
  4. Remova o testicular túnica albugínea , perfurando o tecido com pinças com pontas afiadas e coletar túbulos seminíferos soltos. Transferi os túbulos para um novo 35mm placa de Petri contendo 2 mL de solução de Lise/fix.
  5. Incube os túbulos na solução fix/lise durante 5 min à temperatura ambiente.

2. preparação dos túbulos seminíferos

  1. Prepare um slide de vidro revestido de poli-L-lisina, delineando as bordas da lâmina com uma caneta de bloqueador de líquido.
  2. Aplicam-se 100 µ l de solução de Lise/fix para o centro da lâmina de vidro.
  3. Usando Pinças esterilizadas e tesoura suavemente arreliar distante dos túbulos seminíferos. Corte de tempo individual túbulo segmentos aproximadamente 20 mm de comprimento.
    Nota: Para visualizar estruturas que são sensíveis à exposição prolongada de fixador, tais como as centrossomas, primeiro, separar os túbulos na PBS 1x e, em seguida, picar diretamente os túbulos na superfície dos slides de poli-lisina revestido em 100 µ l de solução de Lise-fix.
  4. Transferência de cinco segmentos de tubo seminífero longo de 20mm para o slide de vidro revestido de poli-L-lysine preparados contendo solução fix/Lise.
  5. Usando a tesoura estéril carne moída tubules seminiferous em segmentos de 1,5 a 3,0 mm.
  6. Usando Pinças esterilizadas organizar os segmentos do túbulo sobre a lâmina de vidro para que o tecido não se sobrepõe, e os túbulos são distribuídos uniformemente.
    Nota: O número ideal de segmentos do túbulo sobre uma lâmina de vidro é entre 20 e 40 anos.

3. esmagamento dos túbulos seminíferos

  1. Transferi a lâmina de vidro que contém segmentos de tubo seminífero dispersos em uma bancada. Remova o excesso de líquido utilizando um laboratório para evitar a perda de tecido durante a etapa de abóbora.
  2. Uma lamela (22 x 60-1,5 mm) na parte superior da lâmina de vidro e aplicar pressão com o calcanhar da palma por 10 a 20 segundos. É importante aplicar força suficiente para dispersar espermatócitos de túbulos seminíferos.
    Nota: Observe os túbulos usando um microscópio de dissecação, a fim de otimizar a etapa de caça aos bugs, para que todos os segmentos do túbulo são rompidos.
  3. Usando o slide fórceps, imediatamente flash congelar a lâmina de vidro em um pequeno dewar de líquido N2 por 15 segundos, ou até o líquido deixa de bolha. Se immunolabeling imediatamente, remova a lamela com uma lâmina de barbear borda reta, ótimo dica fórceps ou agulha de 21.
    Nota: Para obter melhores resultados, immunolabel os slides imediatamente (ver passo 4). No entanto, neste ponto slides podem ser preservados a-80 ° C por até duas semanas. Para maximizar a vida útil de proteínas e estruturas celulares, imediatamente armazena os slides em gelo seco ou transferência para um freezer-80 ° C e mantém a lamela no slide. Quando immunolabeling armazenados slides, remova a lamela imergindo os slides no líquido N2 por 15 segundos, conforme descrito na etapa 3.3.

4. Immunolabeling de túbulos seminíferos montados

  1. Mergulhe o slide em 1X PBS e lavar três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.
    Nota: Nunca permita que os slides completamente seco durante immunolabeling.
  2. Aplica 1 mL de tampão de diluição de anticorpo a lâmina de vidro para bloquear por 1-2 h em uma câmara umidificada.
  3. Retire o tampão de diluição de anticorpo e aplicar 100 µ l de anticorpo primário, diluído em tampão de diluição de anticorpo em uma câmara umidificada.
    Nota: Para melhores resultados, incubar os anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm. Validar e otimizar os anticorpos primários15.
  4. Enxague slides três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.
    Nota: Para aprimorar a lavagens, agitar frascos de Coplin usando uma barra de agitação magnética pequena e coloque em um prato de agitação magnética em baixa velocidade ou coloque a jarra de Coplin em um misturador de mesa a baixa velocidade.
  5. Aplicam-se 100 µ l de anticorpo secundário diluído em tampão de diluição de anticorpo para 1 a 1,5 h em uma câmara humidificada à temperatura ambiente. Incube os slides em uma caixa escura para evitar foto branqueamento de anticorpos fluoróforo conjugado.
    Nota: Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm.
  6. Enxague slides duas vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.
  7. Montar as lâminas no meio de montagem contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µ g/mL) e aplique as lamelas (22 x 60-1,5 mm).
  8. Sele as lamelas para os slides com esmaltes claros para preservar os slides e evitar as lamelas de mover-se.

5. análise e preparações de abóbora túbulo de imagem

  1. Use um microscópio de epifluorescência com palco automatizado que permite o movimento preciso do eixo z e uma câmera de alta resolução para captura de imagem. Como alternativa, use um microscópio confocal a laser.
    Nota: Use qualquer software e hardware disponíveis para esta etapa. Por exemplo, imagens exibidas na Figura 1 e Figura 2 foram capturadas usando uma célula de Zeiss observador Z1 ligado a uma câmera CMOS de ORCA-Flash 4.0 e analisados com o software de imagem de edição de Zeiss ZEN 2012 azul.
  2. Avalie os slides usando um objectivo X 20 para determinar a qualidade da preparação da polpa. Slides de boa qualidade tem uma monocamada de núcleos que são uniformemente distribuídos.
    Nota: Algumas seções do slide podem ser melhores do que outros, é útil observar as coordenadas de onde as melhores regiões do slide podem ser encontradas para posterior análise utilizando a maior ampliação.
  3. Usando a maior ampliação objectivo (por exemplo, 63 X ou 100 X), regiões de captura do slide que têm um monolayer consistente dos núcleos. Uma vez que uma região está selecionada, definir a parte superior e menor Z-pilhas para garantir que toda a luz em foco é capturada.
    Nota: O número ideal de Z-pilhas capturado entre o limite superior e inferior é geralmente designado pelo software de aquisição de imagem e é diferente para cada objetivo.
  4. Use a software de processamento de imagem para compilar uma imagem de foco estendido de profundidade. O software combina a luz em foco de cada pilha-Z e é essencial para a imagem ideal de preparações de abóbora do túbulo.

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Resultados

Aqui, nós usamos o método de abóbora do túbulo para visualizar populações de células transitória em fase da prófase para metáfase eu (G2/MI) transição, que foram enriquecidos por colheita testículos de juvenis selvagem-tipo ratos submetidos à primeira onda de espermatogênese (24 DPP). A Figura 1 retrata imagens representativas das diversas fases de célula que podem ser visualizadas usando o método de abóbora do túbulo. Enriquecido com populações da metafase e...

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Discussão

Os ratos têm provado para ser um organismo modelo útil para estudar os eventos celulares que regulam a progressão meiótica durante a espermatogénese. Além disso, é necessário desenvolver ferramentas servidas para o estudo da espermatogênese porque muitos eventos, como sair da prófase meiótica, são sexualmente dimórfico. Este protocolo descreve um método de abóbora tubo seminífero para visualização e estudo de diferentes estágios da espermatogênese de rato. Este método preserva a integridade celular e desse modo permite a...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J. e uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para S.R.W. e J.H.
 

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
16% ParaformaldeídoAquoso Microscopia Eletrônica Sciences (EMS)15710
10xPBS Qualidade Biológica119-069-161
Triton X-100SigmaT8787
BSASigmaA1470
Sorode Cavalo SigmaH-1270
35mm x 10mm Placa de Petri, Estéril, não tratadaCellTreatP886-229638
Lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisinaSigmaP0425-72EA
Microscopia eletrônica Sciences (EMS)71310
Caixa úmidaEvergreen240-9020-Z10
Wheaton Coplin Prato de coloração de vidro para 5 ou 10 slidesFisher08-813E
VECTASHIELD Montagem antidesbotamento Médio com DAPIVector LabsH-1200
Lâminas de Cobertura para Microscópio (22mmx60mm)Esmalte Transparente Fisher12-544-G
AmazonN/A
Microsopes
NomeEmpresaNúmero de Catálogo Comentários
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000 
Observador Z1Zeiss4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 edição azul software de imagemZeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS câmeraHamamatsu
Anticorpos primários
NomeEmpresa<strong>Número de catálogoComentários
Mouse anti-SYCP3Santa Cruzsc-745691 em 50
Coelho anti-SYCP3Fisher (Novus)NB300-2311 em 1000
Cabra anti-SCP3Santa Cruzsc-208451 em 50
Anticorpos de proteína anti-centrômero humanoincorporados15-2351 em 100
Camundongo anti-alfa tubulinaSigmaT90261 em 1000
Camundongo anti-AIM1BD Biosciences6110821 em 200
Camundongo anti-gama; H2AXThermo FisherMA1-20221 em 500
Mouse anti-CENT3AbnovaH00001070-M011 em 200
Coelho anti-pericentrinoAbcamab44481 em 200
Coelho anti-REC8Cortesia de  Dra. Karen SchindlerN/A1 em 1000
Caneta bloqueadora de líquidos

Referências

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Reimpressões e permissões

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Espermatogênese de CamundongoIsolamento de Células GerminativasPreparação de TúbulosSolução de Lise FixadoraLâmina de Poli-L-LisinaColoração por ImunofluorescênciaMicroscopia de EpifluorescênciaFormação do Bouquet Cromossômico
Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse
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