Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

Summary

Este protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para pesquisadores interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro das variações números de cópia em plantas.

Abstract

Os mutantes são inestimáveis recursos genéticos para estudos de função do gene. Para gerar conjuntos de mutante, três tipos de agentes mutagénicos podem ser utilizados, incluindo biológicos tais como o T-DNA ou transposon, produto químico como Metanossulfonato de etila (EMS), ou físico, como a radiação de ionização. O tipo de mutação observada varia de acordo com o mutagênico utilizado. Para ionização radiação induzida por mutantes, mutações incluem a exclusão, a duplicação ou rearranjo. Enquanto T-DNA ou mutagénese transposon-baseado é limitado a espécies que são suscetíveis a transformação, mutagênese química ou física pode ser aplicado a uma ampla gama de espécies. No entanto, a caracterização das mutações derivadas de mutagênese química ou física tradicionalmente baseia-se numa abordagem de clonagem baseados no mapa, que é a mão de obra intensiva e demorado. Aqui, nós mostramos que uma plataforma de hibridação genômica comparativa baseada em array (protocolo) do genoma de alta densidade pode ser aplicada para eficientemente detectar e caracterizar cópia números variações (CNVs) em mutantes derivados de mutagênese de bombardeio (FNB) de neutrões rápidos em Medicago truncatula, uma espécie de vegetal. Análise de sequências do genoma inteiro mostra que existem mais de 50.000 genes ou modelos de gene em M. truncatula. No presentes, induzida pelo FNB mutantes em M. truncatula são derivadas de mais de 150.000 linhas M1, representando inestimáveis recursos genéticos para estudos funcionais de genes no genoma. A plataforma de protocolo descrita aqui é uma ferramenta eficiente para caracterizar os mutantes FNB-induzida em M. truncatula.

Introduction

Leguminosas (Fabaceae) são a terceira maior família de plantas, com muitas espécies economicamente importantes, tais como a soja (Glycine max) e alfafa (Medicago sativa). Os legumes podem interagir com bactérias fixadoras de nitrogênio solo, geralmente chamado de Rhizobia desenvolver nódulos de raiz no qual o dinitrogênio atmosférico é reduzido a amônia para uso pela planta hospedeira. Como tal, o cultivo de culturas de vegetal requer pouca entrada de fertilizantes nitrogenados e, portanto, contribui para uma agricultura sustentável. Culturas de vegetal produzem folhas e sementes com conteúdo de alta proteína, servindo como forragem....

Protocol

Nota: a Figura 1 mostra as cinco etapas para a matriz de protocolo CGH. Eles são: 1) preparação dos materiais de planta; 2) o isolamento de amostras de DNA de alta qualidade; 3) rotulagem e purificação de amostras de ADN; 4) hibridização, lavagem e varredura de matrizes de genoma inteiro; e 5) a análise dos dados CGH. Matrizes de azulejos de genoma inteiro M. truncatula contêm um total de 971.041 prova de oligo exclusivo visando a mais de 50.000 genes ou modelos de gene no genoma (ver tabela de materiais). As sondas originais são espaçadas aproximadamente cada 150 pares de bases (bp) em regiões exônicos e 261 b....

Results

A Figura 2 mostra a distribuição da proporção de₂ registo normalizado do mutante contra WT sinais em todo o genoma inteiro. A análise dos dados CGH revelou uma aproximada 22 kb exclusão no cromossomo 4 que abrange o inteiro SUNN gene³³ e diversas outras anotado genes em mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). A região de candidatos excluídos foi coberta por 73.......

Discussion

Nós desenvolvemos uma plataforma CGH baseada em array para a detecção e caracterização de bombardeamento de neutrões rápidos (FNB)-induzido mutantes em M. truncatula CV Jemalong A17. Para demonstrar o uso da matriz método CGH na detecção de mutações genéticas, realizamos análise de protocolo do mutante FN6191, que exibiu um fenótipo de hipernodulação em contraste com plantas de tipo selvagem, quando inoculados com S. tem Sm1021. Para a análise de segmentação, um segmento foi considerado significativo se.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula matriz de genoma, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutante)	In house	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (referência)	In house	A17
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
Nanodrop Espectrofotômetro	Thermo Scientific	1000D
SureTag Kit de Rotulagem de DNA	Agilent	5190-3400
Primer Aleatório	Agilent	5190-3399
Acetonitrila	Sigma-Aldrich	271004-1L
Termociclador	MJ research	PTC-200
Centrífuga	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Solução de Estabilização e Secagem	Agilent	5185-5979
Kit de Hibridização Oligo aCGH/ChIP-on-chip	Agilent	5188-5380
Lâminas de vedação da câmara de hibridização Agilent		G2505
Human Cot-1 DNA	Agilent	5190-3393
Tampão de lavagem oligo aCGH/ChIP-on-chip 1 e 2	Agilent	5188-5221
, inoxidável	Agilent	G2534A
	Agilent	G2545A
Scanner	Agilent	5190-3391
	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Mapa de Sinais Nimblegen	5225035001
1.9	Roche Nimblegen1.9