Artigo de método

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

DOI:

10.3791/56482

⸱

4 de janeiro de 2018

 , 
1Department of Convergence Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 2Synaptic Circuit Plasticity Laboratory, Department of Structure and Function of Neural Network, Korea Brain Research Institute

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve as várias técnicas necessárias para microscopia eletrônica de transmissão incluindo coloração negativa, seccionamento ultrafinos de estrutura detalhada e imuno-ouro rotulagem para determinar as posições de proteínas específicas em exosomes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes são nanométricas vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporais e são conhecidos para representar as características das células que secretam-los. O conteúdo e a morfologia das vesículas secretadas refletem o comportamento celular ou estado fisiológico, por exemplo, crescimento celular, migração, decote e morte. Papel do exosomes pode dependem altamente tamanho e o tamanho de exosomes varia de 30 a 300 nm. O método mais utilizado para tratamento de imagens exossomo é coloração negativa, enquanto outros resultados baseiam-se na microscopia de elétron de Cryo-transmissão, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. Morfologia do exossomo o típico avaliada através de coloração negativa é uma em forma de taça, mas ainda mais detalhes ainda não estão claras. Um exossomo bem caracterizado por meio de estudo estrutural é especialmente necessário nas áreas médicas e farmacêuticas. Portanto, a morfologia função dependente deve ser verificada por técnicas de microscopia eletrônica, por exemplo marcando uma proteína específica da estrutura detalhada do exossomo. Para observar a estrutura detalhada, imagens secionadas ultrafinos e imagens negativas manchadas, de exosomes foram comparadas. Neste protocolo, sugerimos a microscopia eletrônica de transmissão para a imagem latente de exosomes incluindo coloração negativa, toda montagem imuno-coloração, preparação de bloco, seção fina e rotulagem imuno-ouro.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de bicamada lipídica secretadas pelas células, e seu tamanho varia entre 30 e 300 nm. SVE foram relatados primeiramente em 1978, com evidência de vesículas de pacientes com doença de Hodgkin1. Essas vesículas foram relatadas para ser de 40 a 120 nanômetros de tamanho. Em 1980, foi relatado que EVs estão envolvidos no sistema de coagulação e trombose, formação de um coágulo de sangue dentro de um vaso sanguíneo no câncer pacientes2. Depois de 30 anos, registaram-se um fator importante para promover a invasão do tumor, fuga imune e angiogênese3EVs. Além disso, as funções de EVs têm sido estudadas como reguladores em interacções celulares nas áreas de inflamação, distúrbio imunológico, doenças neurológicas e câncer4. Desde EVs contêm biomoléculas específicas tais como proteínas e RNAm microRNA5, sua potencial aplicação no diagnóstico e terapêutica tem sido analisados6,7. Sve é uma categoria composta por subgrupos, incluindo exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartículas, promininosomes, argosomes e exossomo como vesículas, dependendo da sua origem celular e função biológica3. Além disso, com base na sua biogênese, esses EVs podem ser divididos em aumentada (galpão aumentada, 100-1000 nm) e exosomes (30-300 nm)8,9. Entre estes, o exossomo tem sido relatado como um comunicador de célula para resposta imune10, câncer11,12e doenças infecciosas13.

Interesse no exosomes como um biomarcador para o diagnóstico precoce está a aumentar rapidamente, e a purificação e caracterização de exosomes devem ser acompanhados com técnicas de imagem moleculares. Os diferentes tamanhos e morfologias de exosomes, dependendo de sua origem e função14, podem ser distinguidas por técnicas de microscopia de alta resolução, tais como a microscopia eletrônica. Exosomes maioria dos foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) negativo manchada15,16,17, e esses resultados foram confirmados por immunolabeling de uma proteína específica em toda montagem vesículas 18. diversos grupos de pesquisa relataram a estrutura através de microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica19,20e21,de Cryo-TEM22. No entanto, enquanto estas técnicas são úteis para estudar a estrutura do exossomo, eles são insuficientes para observar a posição de proteínas específicas, localizado no interior do exossomo. Portanto, nós introduzimos um protocolo para exosomes com uma proteína específica rotulagem de imagem. Nós aplicamos a preparação do bloco, seccionamento ultrafinos e imunocoloração para determinar a localização detalhada da proteína do exossomo. Isso foi comparado com coloração negativa e todo imunocoloração de montagem, que é tradicionalmente utilizada para a caracterização do exossomo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bloco preparação, corte, coloração e imagem do exossomo

  1. Pelota a exosomes do sobrenadante de cultura de células HCT116 por centrifugação a 100.000 x g durante 1,5 h23. Remover a sobrenadante de cultura e fixar cuidadosamente a pelota exossomo purificado com 1 mL de glutaraldeído 2,5% em solução de cacodylate de sódio 0,1 M (pH 7.0) para 1 h a 4 ° C. Para cacodylate de sódio 0,1 M, dissolva ácido cacodílico 4,28 g em 160 mL de água destilada (DW). Ajuste o pH para 7,4 com 0.1 M HCl, em seguida, fazer a 200 mL com água destilada.
  2. Retire o fixador e enxágue as pelotas com 1 mL de tampão de cacodylate de sódio 0,1 M à temperatura ambiente. Repita três vezes com cada alteração de duração de 10 min.
  3. Fixar as amostras com 1 mL de tetróxido de ósmio de 2% para 1 h a 4 ° C.
  4. Retire o fixador e lavar três vezes com cacodylate de sódio 0,1 M buffer cada 10 min.
  5. Incubar durante 10 min com uma série de classificados acetona (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectivamente) no agitador.
  6. Remover a acetona e incubar a solução da mistura incorporação de 3:1 acetona: baixa viscosidade durante 30 min. A pelota exossomo está no tubo.
  7. Remover o meio e adicionar médio de encastre mistura 1:1 acetona: baixa viscosidade, e incube por 30 min.
  8. Remover o meio e adicione 3:1 acetona: baixa viscosidade encastre mistura média e, em seguida, incube durante 30 min.
  9. Remover o meio e adicione 100% baixa viscosidade, incorporando a mistura e incubar durante uma noite em temperatura ambiente.
  10. Incorporar a amostra em pura baixa viscosidade, incorporando a mistura usando o molde de encastre e asse por 24 h a 65 ° C.
  11. Prepare-se seções com espessura de 60 nm através de um ultramicrótomo.
  12. Duplo-mancha com 2% de acetato de uranilo por 20 min e levar citrato por 10 min.
    Para solução de chumbo de Reynolds, adicione 1,33 g de nitrato de chumbo e 1,76 g de citrato de sódio para um total de 50 mL de água destilada.
  13. Observar a grade sob microscopia eletrônica de transmissão em 80 kV.
  14. Clique em "Adquirir" e clique em "Arquivo" e "Salvar como" sistema de câmera CCD sob o microscópio de elétron em 80 kV. Siga as configurações automáticas para o tempo de exposição.

2. imuno-coloração de seções e de imagem (Figura 1)

  1. Corte 60 seções ultra-finas nm usando um ultramicrótomo e recolher a grelha de níquel.
  2. Incube grades em 50 gotas de µ l de glicina de 0,02 M por 10 min saciar os grupos aldeído livre.
  3. Enxague em 100 μL de DW três vezes cada 10 min. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h em PBS contendo 1% de BSA.
  4. Incubar as grades em gotas de 50-100 µ l de anti KRS anticorpo24 (1: 100 em PBS contendo 0,1% BSA) para 1h (se for necessário, que nesta etapa deve ser efectuada a 4 ° C durante a noite.)
  5. Lave as grades com cinco gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada.
  6. Transferência de grades para gotas de 2nd anticorpo por 1h (anti-coelho IgG conjugada com partículas de ouro nm 10 (1: 100) em PBS contendo 0,1% BSA).
  7. Grades de lavagem com cinco separam gotas (50 μL) de PBS contendo 0,1% BSA cada 10 min.
  8. Duplo-mancha com acetato de uranilo 2% por 20 min em condições escuras e com citrato de chumbo de Reynold para 10 min, respectivamente.
  9. Clique em "Adquirir" e clique em "Arquivo" e "Salvar como" no sistema de câmera CCD sob uma temperatura de 80 kV. Tempo de exposição seguido configurações automáticas.

Processo de cromatografia sequencial em tubos e ferramentas; experimento de purificação de proteínas.
Figura 1: processo de preparação da amostra e imunocoloração. (A) duplo fixo exossomo é desidratado e infiltrado com baixa viscosidade, incorporação de resina de mistura. (B) a incorporação de resina. (C) seção ultra fina com faca de diamante. (D) configuração para rotulagem de imuno-ouro. As grades com as seções ultra-finas são colocadas sobre as gotas de líquido em um parafilm, que é colocado com a toalha de papel molhada. Cada seção é incubada com gotículas de anticorpo de 50-100 µ l e, em seguida, lavada com tampão. (E) dupla coloração com acetato de uranilo e citrato de chumbo. A tampa é coberta com papel alumínio para a coloração de heavy metal. (F) solução de coloração é removido pelo filtro de papel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. coloração negativa

  1. Brilho da descarga-a película fina formvar/carbono revestido 200 grades de EM malha de cobre para 1 min de descarregador de brilho.
  2. Fix exosomes purificado com 1ml de 2% paraformaldeído (PFA) por 5 min.
    Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada.
  3. Carregar 5-7 µ l exossomo suspensão solução da grelha e incubar durante 1 min. Se a concentração do exossomo é muito elevada, dilua a concentração de 1/2 - 1/5.
  4. Imediatamente a mancha com as ~ 20 gotas de solução de acetato (UA) de uranilo 1% filtrada na superfície da grade EM por seringa.
  5. Remova a excesso solução UA na grelha entrando em contato com a borda de grade com papel de filtro.
  6. Rapidamente lave a grelha com uma gota de água. Esta etapa irá remover a solução de coloração em excesso.
  7. Coloque a grelha na mesa, segurando com uma pinça e cobrir a grade parcialmente com um prato de cultura para secar por 10 minutos em temperatura ambiente.
  8. Armazenar a grade em uma caixa de grade EM para futura observação por um TEM 80 kV.

4. toda montagem para imunocoloração

  1. Brilho da descarga-a película fina formvar/carbono revestido 200 grades de EM malha de cobre por 30 s.
  2. Fix exosomes purificado com 1ml de 2% paraformaldeído (PFA) por 5 min.
    Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada.
  3. Carga de 5 a 7 µ l solução de exossomo fixo na grade e incubar por 5 min. enxaguar com 100 µ l de PBS três vezes cada um por 10 min.
  4. Trate de grades com 50 µ l de glicina de 0,05 M para 10 min saciar os grupos aldeído livre.
  5. Transferência de grades a uma queda do tampão de bloqueio (PBS contendo 1% de BSA) por 30 min.
  6. Incube as grades com 50-100 µ l anti anticorpo PD-L1 (1: 100 em PBS contendo 0,1% BSA) por 1h (se for necessário, que nesta etapa deve ser efectuada a 4 ° C durante a noite).
  7. Lave a grade com 5 gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada.
  8. Transferi a grade para uma gota de anticorpo dend 2 por 1h.
Anti-mouse IgG conjugada com partículas de ouro nm 9-11 diluído a 1: 100 em PBS contendo 0,1% de BSA.
  • Lave a grade com 5 gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada. Lave a grade com duas gotas separadas (50 μL) de DW. Execute a coloração negativa com 2% de acetato de uranilo, conforme descrito de 3,4 para 3,8.
  • Armazenar a grade em uma caixa de grade EM para futura observação por um TEM 80 kV.

    • Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

    Resultados

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Atualmente, exosomes são classificados em categorias de tamanho e forma por microscopia eletrônica de transmissão. A Figura 2 mostra negativo manchado exossomo e imunológico-rotulados exossomo no monte todo status. A Figura 3 mostra exossomo secionado e imuno-rotulados exosomes após corte fino. Usando anticorpos de proteínas específicas de coloração imuno-ouro é usado positivamente identificar um exossomo e classificar os tipos d...

    Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

    Discussão

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Este artigo apresenta um protocolo para observar a estrutura do exossomo a detalhada e rotulagem de suas proteínas específicas. Coloração negativa tem sido considerado como o melhor método para exossomo de imagem17. Esta técnica convencional mostrou-se estrutura de forma de Taça dos exosomes. No entanto, esta forma de xícara é uma forma de artefato que pode ocorrer devido ao processo de secagem. Cryo-TEM resultados têm mostrado que o exosomes tem uma estrutura perfeitamente esférica em solução aqu...

    Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

    Divulgações

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Agradecimentos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Esta pesquisa foi apoiada pelo Bio & programa de desenvolvimento de tecnologia médica da Fundação Nacional de pesquisa (NRF) & financiado pelo governo coreano (MSIP & MOHW) (n º 2016M3A9B6904244). Agradecemos também a membros do centro de pesquisa Bioconvergence de medicamentos para a purificação do exossomo.

    Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    GlutaraldeídoEMS16200
    Cacodilato de sódio EMS12300
    Tetróxido de ósmio 1 g cristalEMS19100Use apenas em capela de exaustão
    acetonaJUNSEI1B2031
    Meio de esporãoTED PELLA18108
    Ultra-micrótomoLeicaUCT
    Acetato de uraniloEMS22400Produto químico perigoso
    Citrato de chumboEMS17900
    HitachiH7600
    grade de níquelEMSG200-Ni
    Grade de cobreEMSG200-
    glicinaSIGMA022K5404
    Tampão fosfato salinaSIGMAP4417
    Albumina de soro bovinoAurion25557
    1ªmanualmente 
    Anticorpo anti-humano purificado CD274 (B7-H1, PD-L1)BioLegend329710Suporte inteiro Immumogold
    Purificado Mouse IgG2b, κ Isotipo CtrlBioLegend401202Montagem inteira Immumogold (Controle)
    2º Anti-mouse igG conjugado 9-11 nm partícula de ourosigmaG7652
    Microscopia eletrônica de transmissãoJEOLJEM2200FS
    Descarregador de brilhoJEOLJFC1100E
    Grade de carbonoEMS121119
    ParaformaldeídoEMS19210
    Formvar revestido de carbono Grade de cobre (200 meh)EMSFCF200-
    Formvar revestido de carbono  Grade de níquel (200 mesh)EMSFCF200-NI
    Microscopia eletrônica de transmissão Purificação de anticorpos

    Referências

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
    2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
    3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
    4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
    5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
    6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
    7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
    8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
    9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
    10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
    11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
    12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
    13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
    14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
    15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
    16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
    17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
    18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
    19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
    20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
    21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
    22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
    23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
    24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
    25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
    26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
    27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
    28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
    29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
    30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).

    Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

    Reimpressões e permissões

    Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

    Solicitar permissão

    Etiquetas

    Exosome ImagingTransmission Electron MicroscopyNegative StainingImmunogold LabellingExosome PurificationUltrathin SectioningProtein LocalizationExosome MorphologyWhole Mount StainingBlock Preparation

    Artigos relacionados