Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

Este protocolo descreve as várias técnicas necessárias para microscopia eletrônica de transmissão incluindo coloração negativa, seccionamento ultrafinos de estrutura detalhada e imuno-ouro rotulagem para determinar as posições de proteínas específicas em exosomes.

Resumo

Exosomes são nanométricas vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporais e são conhecidos para representar as características das células que secretam-los. O conteúdo e a morfologia das vesículas secretadas refletem o comportamento celular ou estado fisiológico, por exemplo, crescimento celular, migração, decote e morte. Papel do exosomes pode dependem altamente tamanho e o tamanho de exosomes varia de 30 a 300 nm. O método mais utilizado para tratamento de imagens exossomo é coloração negativa, enquanto outros resultados baseiam-se na microscopia de elétron de Cryo-transmissão, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. Morfologia do exossomo o típico avaliada através de coloração negativa é uma em forma de taça, mas ainda mais detalhes ainda não estão claras. Um exossomo bem caracterizado por meio de estudo estrutural é especialmente necessário nas áreas médicas e farmacêuticas. Portanto, a morfologia função dependente deve ser verificada por técnicas de microscopia eletrônica, por exemplo marcando uma proteína específica da estrutura detalhada do exossomo. Para observar a estrutura detalhada, imagens secionadas ultrafinos e imagens negativas manchadas, de exosomes foram comparadas. Neste protocolo, sugerimos a microscopia eletrônica de transmissão para a imagem latente de exosomes incluindo coloração negativa, toda montagem imuno-coloração, preparação de bloco, seção fina e rotulagem imuno-ouro.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de bicamada lipídica secretadas pelas células, e seu tamanho varia entre 30 e 300 nm. SVE foram relatados primeiramente em 1978, com evidência de vesículas de pacientes com doença de Hodgkin¹. Essas vesículas foram relatadas para ser de 40 a 120 nanômetros de tamanho. Em 1980, foi relatado que EVs estão envolvidos no sistema de coagulação e trombose, formação de um coágulo de sangue dentro de um vaso sanguíneo no câncer pacientes². Depois de 30 anos, registaram-se um fator importante para promover a invasão do tumor, fuga imune e angiogênese³EVs. Além d....

Protocolo

1. bloco preparação, corte, coloração e imagem do exossomo

1. Pelota a exosomes do sobrenadante de cultura de células HCT116 por centrifugação a 100.000 x g durante 1,5 h²³. Remover a sobrenadante de cultura e fixar cuidadosamente a pelota exossomo purificado com 1 mL de glutaraldeído 2,5% em solução de cacodylate de sódio 0,1 M (pH 7.0) para 1 h a 4 ° C. Para cacodylate de sódio 0,1 M, dissolva ácido cacodílico 4,28 g em 160 mL de água destilada (DW). Ajuste o pH para 7,4 com 0.1 M HCl, em seguida, fazer a 200 mL com água destilada.
2. Retire o fixador e enxágue as pelotas com 1 mL de tampão de cacodylate de sódio 0,1 M à tempe....

Resultados

Atualmente, exosomes são classificados em categorias de tamanho e forma por microscopia eletrônica de transmissão. A Figura 2 mostra negativo manchado exossomo e imunológico-rotulados exossomo no monte todo status. A Figura 3 mostra exossomo secionado e imuno-rotulados exosomes após corte fino. Usando anticorpos de proteínas específicas de coloração imuno-ouro é usado positivamente identificar um exossomo e classificar os tipos d.......

Discussão

Este artigo apresenta um protocolo para observar a estrutura do exossomo a detalhada e rotulagem de suas proteínas específicas. Coloração negativa tem sido considerado como o melhor método para exossomo de imagem¹⁷. Esta técnica convencional mostrou-se estrutura de forma de Taça dos exosomes. No entanto, esta forma de xícara é uma forma de artefato que pode ocorrer devido ao processo de secagem. Cryo-TEM resultados têm mostrado que o exosomes tem uma estrutura perfeitamente esférica em solução aqu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glutaraldeído	EMS	16200
Cacodilato de sódio	EMS	12300
Tetróxido de ósmio 1 g cristal	EMS	19100	Use apenas em capela de exaustão
acetona	JUNSEI	1B2031
Meio de esporão	TED PELLA	18108
Ultra-micrótomo	Leica	UCT
Acetato de uranilo	EMS	22400	Produto químico perigoso
Citrato de chumbo	EMS	17900
	Hitachi	H7600
grade de níquel	EMS	G200-Ni
Grade de cobre	EMS	G200-
glicina	SIGMA	022K5404
Tampão fosfato salina	SIGMA	P4417
Albumina de soro bovino	Aurion	25557
1ª			manualmente
Anticorpo anti-humano purificado CD274 (B7-H1, PD-L1)	BioLegend	329710	Suporte inteiro Immumogold
Purificado Mouse IgG2b, κ Isotipo Ctrl	BioLegend	401202	Montagem inteira Immumogold (Controle)
2º Anti-mouse igG conjugado 9-11 nm partícula de ouro	sigma	G7652
Microscopia eletrônica de transmissão	JEOL	JEM2200FS
Descarregador de brilho	JEOL	JFC1100E
Grade de carbono	EMS	121119
Paraformaldeído	EMS	19210
Formvar revestido de carbono Grade de cobre (200 meh)	EMS	FCF200-
Formvar revestido de carbono  Grade de níquel (200 mesh)	EMS	FCF200-NI

Microscopia eletrônica de transmissão Purificação de anticorpos