Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Bailey Simon; Matthew Bucher; Alina Maloyan

doi:10.3791/56484

Artigo de método

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

DOI:

10.3791/56484

⸱

27 de setembro de 2017

Bailey Simon^*¹ , Matthew Bucher^*² , Alina Maloyan¹

¹Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, ²Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.

Resumo

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Obesidade materna está associada com um risco aumentado de resultados perinatais adversos que são provavelmente mediadas por comprometido função placentária que pode ser atribuída, em parte, a desregulação de autofagia. Aberrantes alterações na expressão dos reguladores de autofagia nas placentas de gestações obesas podem ser regulamentadas por processos inflamatórios associados com obesidade e gravidez. Descrito aqui é um protocolo para a recolha de amostras de tecido das vilosidades e isolamento de cytotrophoblasts das vilosidades da placenta humana termo para cultura de células primárias. Isto é seguido por um método para simular o milieu inflamatório no ambiente intra-uterino obeso, tratando trophoblasts primários de gravidezes magras com fator de necrose tumoral alfa (TNFa), uma citocina proinflammatory que é elevada na obesidade e no gravidez. Através da implementação do protocolo descrito aqui, encontra-se que a exposição a exógena TNFa regula a expressão do Rubicão, um regulador negativo de autofagia, em trophoblasts de magras gravidezes com fetos do sexo femininos. Embora uma variedade de fatores biológicos no ambiente intra-uterino obeso manter o potencial de modular caminhos críticos no trophoblasts, este sistema ex vivo é especialmente útil para determinar se os padrões de expressão observada na vivo na placenta humana com obesidade materna são um resultado direto de TNFa sinalização. Em última análise, essa abordagem oferece a oportunidade de analisar as implicações regulamentares e moleculares da inflamação associada com obesidade materna na autofagia e outras vias celulares críticas no trophoblasts que têm o potencial de impacto função da placenta.

Introdução

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A obesidade é um estado inflamatório, caracterizado por inflamação crônica de baixo grau, decorrentes de excesso de tecido adiposo e disponibilidade de nutrientes. Na obesidade, cytokines proinflammatory são elevados em tecidos metabólicos, bem como sistemicamente em circulação. Um conjunto robusto de provas demonstrou que TNFa é significativamente elevada no cenário da obesidade com implicações na resistência à insulina e disfunção metabólica¹. Ativação de TNFa também contribui para a patogênese da doença em condições tais como câncer e auto-imunidade, tornando-se uma atraente alvo terapêutico².

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Protocolo

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placentas foram coletadas a partir do trabalho e entrega unidade hospital universitário sob um protocolo aprovado pela institucional Review Board da Oregon Health and Science University, em Portland, Oregon, com consentimento informado da pacientes.

1. coleção de tecido placentário

preparação
Nota: todos os equipamentos que encontra o tecido devem ser estéril.
1. Esterilizar o equipamento dissecação por autoclavagem durante 60 minutos a 121 ° C.
2. Use equipamentos de proteção individual (EPI): laboratório casacos/vestidos/avental, luvas e máscara com um protetor facial ou óculos de proteção.....

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Resultados

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Prazo placenta humana de magra (índice de massa corporal de pré-gravidez (IMC) < 25) mães com gestações sem complicações carregando prole feminina foram coletadas e amostradas dentro de 15 minutos da entrega por cesariana (sem trabalho). As placentas foram examinadas para a ausência de calcificações e desenvolvimento típico: pesando entre 300-600 g com o cordão umbilical e membranas removidas, rodada em forma, entre 15-25 cm de diâmetro e o cordão umbilical inserido no meio da placenta.......

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Discussão

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A placenta, responsável pela regulação do crescimento do feto, exibe a função comprometida no ambiente obesos⁶. Apesar da alta demanda metabólica de trophoblasts, placenta com obesidade materna apresentam respiração mitocondrial disfuncional⁶^,¹⁹. Alterações no metabolismo da placenta podem contribuir para o aumento da incidência de complicações e resultados de fetais adversos observados em gravidezes obesos³^,

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores agradecer as mulheres que doaram suas placentas para este estudo. Agradecemos também o departamento de entrega na OHSU e materno e Fetal equipe de pesquisa e trabalho para coordenar a coleção de placenta. Nós estamos gratos ao Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD para apoio e ajuda com métodos experimentais e otimização.

Este trabalho foi financiado pelo NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo
10X HBSS	Gibco	14185-052
CaCl2 (anhyd.)	Sigma-Aldrich	C1016-100G
MgSO4 (anhyd.)	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
Tripsina	Gibco	15090-046
DNAse	Worthington Biochemical Corp.
Inibidores de protease / fosfatase	Thermofisher Scientific	88668
Tris HCl	Invitrogen	15506-017
EDTA	Invitrogen	15576-028
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
SDS	Fisher Scientific	BP166-600
Desoxicolato de sódio.	Fisher Scientific	AAJ6228822
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Iscove' s Dulbecco modificado ' s Médio (IMDM)	Gibco	12440-046
Soro Fetal Bovino (FBS)	Corning	35-010-CV
Soro Neonatal de Bezerro (NCS)	Gibco	26010-074
Penicilina/Estreptomicina (Pen/Strep)	Gibco	15140-122
10% Formalina	Fisher Scientific	23-427-098
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
TNFα	Sigma-Aldrich	SRP3177-50UG
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	70013-032
K_{2< / sub>EDTA tubos de coleta de sangue vacutainer}	BD	366450
Percoll (Mídia de gradiente de densidade, DGM)	GE Healthcare	17-0891-01
Placas de 6 poços	Corning	353046
Cell strainers	Fisher Scientific	22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural	Fisher Scientific	22363352
Trypan Blue	Corning	25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System	Bio-Rad	1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell	Bio-Rad	1658033
TGX FastCast Kit de Acrilamida, 12%	Bio-Rad	1610175
Mini-Protean 3 Câmara Multi-Fundição	Bio-Rad	1654112
4X Laemmli Tampão de Amostra	Bio-Rad	1610747
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148-100ML
Glicina	Bio-Rad	1610718
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949-500ML
Leite em pó desnatado instantâneo	cravo
Rubicon (D9F7) Tecnologia	de sinalização celular	8465S
Anti-beta; - Anticorpo monoclonal de actina produzido em camundongo	Sigma-Aldrich	A2228-100UL
Anti-coelho IgG, HRP-ligado Anticorpo	Celular Tecnologia de sinalização	7074S
Anti-mouse IgG, anticorpo	ligado a HRPTecnologia de Sinalização Celular	7076S
SuperSignal West Pico PLUS Substrato Quimioluminescente	Thermo Scientific	34578

LS002139 mAb de coelho

Referências

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Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
Yogev, Y., Catalano, P. M.

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Isolamento de Trofoblastos Amostragem de Tecido Viloso Tratamento com TNF Alfa Cultura de C lulas Prim rias Western Blotting An lise Imunocitoqu mica Centrifuga o por Gradiente de Densidade Express o de Rubicon Modelo de Obesidade Materna Regula o da Autofagia

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