Correntes sinápticas podem ser gravadas focally de boutons sinápticas visualizados na drosófila terceiro ínstar larvas junção neuromuscular. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único bouton sináptica.
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Artigo de método
Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila
Neste artigo
Resumo
Resumo
Drosófila junção neuromuscular (JNM) é um sistema excelente modelo para estudar a transmissão sináptica glutamatérgico. Descrevemos a técnica de macropatch focal gravações das correntes sinápticas de boutons visualizados no MNJ larvas de Drosophila . Esta técnica requer a fabricação personalizada de micropipetas, bem como um microscópio composto, equipado com uma alta ampliação, objectivo de imersão de água de longa distância, óptica de interferência diferencial (DIC) de contraste e uma fluorescente de gravação acessório. O eletrodo de gravação está posicionado no topo de um selecionado bouton sináptica visualizado com óptica DIC, epi-fluorescência ou ambos. A vantagem desta técnica é que permite monitorar a atividade sináptica de um número limitado de sítios de lançamento. O eletrodo de gravação tem um diâmetro de vários micra, e os locais de lançamento posicionados fora da borda do eletrodo não afetam significativamente as correntes gravadas. As correntes sinápticas gravadas tem cinética rápida e podem ser facilmente resolvidas. Estas vantagens são especialmente importantes para os estudos de linhas de mosca mutantes com maior atividade sináptica espontânea ou assíncrona.
Introdução
Drosófila é um sistema excelente modelo para estudar os mecanismos moleculares de controle da transmissão sináptica. O sistema neuromuscular em Drosophila é glutamatérgico, e portanto a drosófila de junção neuromuscular (JNM) pode ser usada para estudar as características conservadas de lançamento glutamatérgico. Desde Jan e de Jan estudo1, as terceiro ínstar larvas tem sido amplamente costumava estudar evocado e espontânea transmissão sináptica monitorando potenciais de junção excitatória (EJPs) ou correntes (EJCs). EJPs são comumente registrados intracelular com um microeléctrodo de vidro afiado, e refletem a ativid....
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Protocolo
1. fabricação de eletrodos de gravação
- puxando os eletrodos de vidro
- uso o seguinte protocolo para o extrator de microeletrodos (ver Tabela de materiais):
- linha 1: calor 510 puxar - velocidade 30 hora 250; Linha 2: Aqueça 490 Pull - velocidade 30 hora 250.
Nota: As unidades de tempo correspondem a 0,5 ms por unidade; as outras unidades são relativas. O valor do calor deve ser ajustado para cada filamento após o teste de rampa é executado.
- linha 1: calor 510 puxar - velocidade 30 hora 250; Linha 2: Aqueça 490 Pull - velocidade 30 hora 250.
- Usar um microscópio (ampliação de x 35) para garantir que o diâmetro interno do eletrodo puxado é na faixa de 7 a 10 µm (....
- uso o seguinte protocolo para o extrator de microeletrodos (ver Tabela de materiais):
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Resultados
Macropatch focal gravações permitem monitoramento atividade sináptica de boutons sinápticas selecionados (Figura 5). Quando o eletrodo é posicionado na parte superior uma bouton synaptic (Figura 5A, site 1), os mEJCs gravados (Figura 5, local 1) têm uma amplitudes exceda significativamente o nível de ruído e em ponto de aumentação fases (em uma escala do milissegundo sub). Quando o eletrodo gravação .......
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Discussão
Drosófila representa um organismo modelo vantajoso para estudar a transmissão sináptica. Várias configurações de gravação foram usadas no MNJ larval, incluindo gravações intracelulares de potenciais sinápticos, gravações das correntes sinápticas com dois eletrodos tensão braçadeira33,34e macropatch focal gravações das correntes sinápticas descritas aqui. A última técnica permite a quantificação precisa da transmissão sináptica em boutons visualizados.
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Com a subvenção de NIH R01 MH 099557
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sutter P-97 | Instrumento Sutter | P-97 | Extrator de microeletrodos |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone para preparação de placas de dissecção |
| Pinos | de B00J5PMPJA | Amazon | Pinos para posicionamento de larvas |
| Pinças | WPIINC | 500342 | Pinças para colocação de pinos, remoção de vísceras e traqueias. |
| Tesoura | WPIINC | 501778 | Tesoura para cortar a cutícula das larvas e nervos. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Microscópio vertical |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Objetiva de microscópio 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Objetiva de microscópio 10X |
| Micromanipulador Narishige | MHW-3 | Micromanipulador hidráulico de água de três eixos | |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Amplificador eletrofisiológico |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Estimulador elétrico |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolador |
| TMC mesa antivibração TMC | 63-9090 | Mesa antivibração | |
| TMC Gaiola de Faraday | TMC | 81-333-90 | Gaiola de Faraday |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A Digidata | |
| Computador | Dell | Dimension 5150 | com Win XP |
| OS Suporte de eletrodo | WPI | MEH3SW | Suporte de eletrodo |
| Filtro óptico | Omega óptico | XF 115-2 | Cubo de filtro para detecção de proteína fluorescente verde (GFP) |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software para gravação de sinal |
| Quantan | Software interno | - | Software para processamento de sinal |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Linha de controle cpx |
| SH1 | Presente generoso de J.T. Littleton-Complexin | knock-out linha de mosca com exocitose espontânea aumentada | |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Linha de mosca com fluorescência neuronal (GFP) Tag |
Referências
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181
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Reimpressões e permissões
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