Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

Resumo

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Resumo

Principais processos celulares tais como a replicação do DNA e segregação, síntese proteica, biossíntese da parede celular e divisão celular dependem a função das proteínas que são essenciais para a sobrevivência bacteriana. Uma série de corantes de destino específico pode ser usada como sondas para melhor compreender estes processos. Coloração com corantes lipofílicos permite a observação da estrutura da membrana, visualização de lipídios microdomains e detecção de bolhas de membrana. Uso de fluorescentes-d-amino ácidos (FDAAs) para sondar os locais da biossíntese do peptidoglicano pode indicar potenciais defeitos na parede celular biogênese ou padronização do crescimento celular. Finalmente, as manchas de ácidos nucleicos podem indicar possíveis defeitos na segregação de replicação ou cromossomo de DNA. Cianina DNA manchas rótulo células vivas e são adequado para microscopia de lapso de tempo permitindo observações em tempo real de morfologia nucleoide durante o crescimento celular. Protocolos para a rotulagem de célula podem ser aplicados para os mutantes de depleção de proteína para identificar defeitos na estrutura da membrana, parede celular biogênese ou segregação do cromossomo. Além disso, a microscopia de lapso de tempo pode ser usada para monitorar alterações morfológicas como uma proteína essencial é removida e pode fornecer insights adicionais em função da proteína. Por exemplo, o esgotamento das proteínas essenciais a divisão celular resulta em filamentação ou ramificação, Considerando que a depleção das proteínas de crescimento celular pode causar células tornar-se mais curtos ou mais redondo. Aqui, os protocolos para crescimento celular, destino-específico marcação e microscopia de lapso de tempo são fornecidos para o patógeno bacteriano planta Agrobacterium tumefaciens. Juntos, alvos tintas e microscopia de lapso de tempo permitem a caracterização de processos essenciais em a. tumefaciens. Finalmente, os protocolos fornecidos podem ser facilmente modificados para sondar os processos essenciais em outras bactérias.

Introdução

Progressão através do ciclo celular bacteriano requer a coordenação de muitos processos, incluindo a biossíntese de membrana e parede celular, replicação do DNA e segregação e divisão celular. Para compreender a complexidade da biologia da célula bacteriana, é necessário estudar esses eventos essenciais; no entanto, essa é uma tarefa não trivial desde a viabilidade celular fica comprometida quando componentes-chave destas vias são mutagenized. Microscopia de epifluorescência juntamente com corantes de destino específico é uma poderosa abordagem para investigar estes processos essenciais em sua e estirpes de bactérias mutantes.

Corantes de p....

Protocolo

1. crescimento de cepas da . tumefaciens

1. Cultivo de cepas da . tumefaciens
   1. Use uma ponta de madeira estéril da vara ou pipeta para inocular 1 mL de meio de crescimento ATGN (ver lista de materiais para a receita) com uma única colônia da estirpe desejada.
      Nota: Para as estirpes de depleção da . tumefaciens , o ATGN deve conter 1 mM IPTG como um indutor para manter a biossíntese da proteína essencial.
   2. Crescem as cepas da . tumefaciens pernoite em ATGN a 28 ° C, com agitação a 225 rpm.
   3. Medir a densidade óptica das células em 600 nm (OD₆₀₀), utilizando um espectr....

Resultados

Destino-específico marcação de sua A. tumefaciens células
A fim de ilustrar essa morfologia celular não é afetada pelas etapas de lavagem ou tratamento com 1% de DMSO (que é usada para diluir os corantes fluorescentes), as células foram fotografadas diretamente da cultura (Figura 2A, painel de extrema-esquerdo), depois de lavar as células por centrifugação conforme descrito no ponto 1.2 (

Discussão

Este protocolo contém uma série de procedimentos para a investigação de cepas da . tumefaciens sua, mutante e esgotamento. É interessante notar que todos os procedimentos listados na seção de protocolo podem ser facilmente adaptados para outras cepas bacterianas com modificações adicionais para dar conta de mídia de crescimento, temperaturas e taxas de crescimento.

O uso de corantes de destino específico é uma ferramenta valiosa para fornecer uma caracterização detalhada dos eventos d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
cepas bacterianas
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmídeo necessário para virulência de Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA Δ ctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. A inserção de mini-Tn7 em um local artificial attTn7 permite a depelação do regulador mestre de cauda essencial CtrA no fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários<
strong>Media Components
ATGN Minimal Medium			A 1 L de água esterilizada adicione 50 ml de tampão 20X, 50 ml de sais 20X, 12,5 ml de glicose a 40%. Para pratos, adicione 15 g de Bacto Agar a 1 L de água e autoclave. Esfriar a 55 &graus; C e adicione 50 ml de tampão 20X, 50 ml de sais 20X, 12,5 ml de glicose a 40%.
20X AT Buffer			Adicione 214 g/L KH2PO4 à água e ajuste o pH para 7,0 com hidróxido de sódio. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Sais			Adicione 40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4• 7H2O, 0,2 g/L CaCl2• 2H2O e 0,024 g/L MnSO4• H2O à água. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4• 7H2O	BioReagentes Fisher	BP213
CaCl2• 2H2O	BioReagentes Fisher	BP510
MnSO4• H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% de caldo em água. Esterilize por filtro.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Adicione 15 g a 1 L de água ao preparar pratos.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aditivos de mídia opcionais
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare como uma solução estoque de 100 mg/ml em água e filtre esterilizar. Use na concentração final de 200 µ g/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Preparar como uma solução estoque 1 M em água e esterilizar por filtro. Use na concentração final de 1 mM conforme necessário para a indução.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais de microscopiaLâminas de
microscópio	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1,0 mm. Limpe com limpador de vidros Sparkle.
Vidro de cobertura do microscópio	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Limpe com o limpador de vidros Sparkle.
Limpa Vidros Sparkle Home	Depot	203261385	Sem amônia e álcool.
Agarose Ultra Pura	Invitrogen	16500-100	Adicione à água, PBS ou meio a uma concentração final de 1 - 1,5%. Derreta no micro-ondas e coloque em 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	solução 10X a ser diluída para 1X com água estéril.
Parafilm	Bemis	PM-999	Filme de laboratório usado como junta na preparação da almofada de agarose.
VALAP			Adicione pesos iguais de lanolina, cera de parafina e vaselina a um tubo cônico. Tubo de calor em 70 > C seco, talão ou banho-maria para derreter e misturar. Aplique VALAP ainda fundido.
Manteiga de lanolina	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Vaselina	Target Corp.	06-17644
Velas artesanais de	cera de parafina	263012
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Corantes específicos do alvo
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use para diluir soluções de estoque de corantes conforme necessário.
FDAAs (NADA, HADA, TADA)Os			FDAAs podem ser sintetizados ou adquiridos por meio de acordo com Mike VanNieuwenhze (Universidade de Indiana). Preparar a solução-mãe a 100 mM em DMSO. Use a uma concentração final de 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg / ml de solução estoque em DMSO. Use na concentração final de 1 µ g/ml.
Invitrogen	S11368	mancha do ácido nucleico de SYTOX	é 5 mM em DMSO. Utilizar na concentração final de 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Preparar 8 mg/ml de solução-mãe em DMSO. Use na concentração final de 8 µ g/ml.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
Banho seco	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Grânulos térmicos metálicos	Lab Armor	42370-002
Microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera			Nikon Eclipse TiE equipado com uma câmera QImaging Rolera em-c2 1K dispositivo de multiplicação de elétrons (EMCCD) é usado neste trabalho.

A concentração conservada em estoque alaranjada de da EMCDD