Artigo de método

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

DOI:

10.3791/56497

⸱

24 de novembro de 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

Neste artigo

Resumo

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Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Resumo

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Principais processos celulares tais como a replicação do DNA e segregação, síntese proteica, biossíntese da parede celular e divisão celular dependem a função das proteínas que são essenciais para a sobrevivência bacteriana. Uma série de corantes de destino específico pode ser usada como sondas para melhor compreender estes processos. Coloração com corantes lipofílicos permite a observação da estrutura da membrana, visualização de lipídios microdomains e detecção de bolhas de membrana. Uso de fluorescentes-d-amino ácidos (FDAAs) para sondar os locais da biossíntese do peptidoglicano pode indicar potenciais defeitos na parede celular biogênese ou padronização do crescimento celular. Finalmente, as manchas de ácidos nucleicos podem indicar possíveis defeitos na segregação de replicação ou cromossomo de DNA. Cianina DNA manchas rótulo células vivas e são adequado para microscopia de lapso de tempo permitindo observações em tempo real de morfologia nucleoide durante o crescimento celular. Protocolos para a rotulagem de célula podem ser aplicados para os mutantes de depleção de proteína para identificar defeitos na estrutura da membrana, parede celular biogênese ou segregação do cromossomo. Além disso, a microscopia de lapso de tempo pode ser usada para monitorar alterações morfológicas como uma proteína essencial é removida e pode fornecer insights adicionais em função da proteína. Por exemplo, o esgotamento das proteínas essenciais a divisão celular resulta em filamentação ou ramificação, Considerando que a depleção das proteínas de crescimento celular pode causar células tornar-se mais curtos ou mais redondo. Aqui, os protocolos para crescimento celular, destino-específico marcação e microscopia de lapso de tempo são fornecidos para o patógeno bacteriano planta Agrobacterium tumefaciens. Juntos, alvos tintas e microscopia de lapso de tempo permitem a caracterização de processos essenciais em a. tumefaciens. Finalmente, os protocolos fornecidos podem ser facilmente modificados para sondar os processos essenciais em outras bactérias.

Introdução

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Progressão através do ciclo celular bacteriano requer a coordenação de muitos processos, incluindo a biossíntese de membrana e parede celular, replicação do DNA e segregação e divisão celular. Para compreender a complexidade da biologia da célula bacteriana, é necessário estudar esses eventos essenciais; no entanto, essa é uma tarefa não trivial desde a viabilidade celular fica comprometida quando componentes-chave destas vias são mutagenized. Microscopia de epifluorescência juntamente com corantes de destino específico é uma poderosa abordagem para investigar estes processos essenciais em sua e estirpes de bactérias mutantes.

Corantes de peptidoglicano específicos incluem fluorescente-d-amino ácidos (por exemplo, 7-Hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina e fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) , NADA; diversos-3-amino-d-alanina; TADA). Em bactérias gram-positivas, o uso de concentrações subletais de análogos de antibióticos fluorescentes para sondar sites da biossíntese do peptidoglicano tem sido uma estratégia eficaz para revelar o peptidoglicano inserção padrões1,2, 3,4. Enquanto rotulagem fluorescente vancomicina tem sido usada para obter insights sobre o peptidoglicano padrões de inserção em bactérias Gram-negativas fixa5, a membrana externa geralmente fornece uma barreira de permeabilidade que impede o uso de fluorescentes antibióticos como uma sonda para a biossíntese do peptidoglicano em células vivas. Em contraste, pulsos de fluorescente-d-amino ácidos ou d-amino ácidos com grupos funcionais de biorthogonal covalentemente rotulam regiões de inserção de peptidoglicano recentes em uma ampla gama de vida células bacterianas6,7. Padrões de inserção de peptidoglicano que têm sido observados com d-aminoácidos sintéticos incluem punctate e septal (Escherichia coli e Bacillus subtilis), polar e septal (Agrobacterium tumefaciens e Listeria monocytogenes), único do septo (Staphylococcus aureus) e apical (Streptomyces venezuelae)6,7. Estas observações indicam que as bactérias apresentam diversos padrões de biogênese de parede celular e que o uso de ácidos d-aminoácido sintéticos como sondas para examinar a padronização de crescimento é uma estratégia valiosa em muitas bactérias.

Corantes que rotulam cromossomos bacterianos incluem o fichário de sulco menor específicas do Ácido desoxirribonucleico (DNA) (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) e corantes de cianina de alta afinidade (verde e laranja; consulte a lista de materiais). DAPI coloração de células fixas auxilia na enumeração de bactérias a partir de amostras ambientais8, Considerando que a DAPI coloração de células vivas é usada para indicar a viabilidade bacteriana9. Em contraste, cianina corantes tais como laranja e verde são frequentemente descritos como manchas de célula "morto" impermeant de membrana para enumerar as células não-viáveis9. Notavelmente, quando estes reagentes são usados para sondar a morfologia de nucleoide bacteriana durante o crescimento celular, DAPI, laranja e verde foram todos mostrado membrana permeant e capaz de rotulagem de células vivas10. Em células de Escherichia coli vivas, DAPI coloração de DNA aparece difusa devido a autofluorescência de citoplasma e repetidas exposições de células manchadas de DAPI à luz ultravioleta (UV) perturba o nucleoide estrutura10. Coloração de e. coli ou b. subtilis com laranja revela que este corante é membrana permeant e fornece fluorescência de longa duração com ligação ao DNA em células vivas, sem afetar o crescimento da pilha, o replication do DNA ou segregação do cromossomo10 . Estas observações sugerem que cyanine tinturas de DNA podem ser usadas para monitorar a morfologia da nucleoids durante o crescimento celular de muitas bactérias.

Phospholipid-specific stryl corantes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibrometo de piridínio (4-64; consulte a lista de materiais) são compostos catiônicos e associar preferencialmente com carga negativa fosfolípidos como cardiolipina e fosfatidilglicerol11. Padrões distintos são observados quando 4-64 é usado para rotular a membrana de bactérias diferentes. Em Escherichia coli, 4-64 é enriquecido nos polos, em faixas ao longo da parede lateral e nos sites de divisão de tarde pre-divisional células12. Em Bacillus subtilis, 4-64 rotulagem permite a visualização de lipídios espirais13. Em Agrobacterium tumefaciens, 4-64 rotula a membrana externa e é observado em um padrão característico "ferradura" no qual o polo de crescimento é desprovido de rotulagem de14,15. Estas observações indicam que essas bactérias apresentam distribuições de lipídios heterogênea devido à presença de domínios de lipídios que contribuem para a assimetria celular. Mudanças nos padrões de rotulagem 4-64 como a presença de rotulagem difusa, bolhas ou vesículas, invaginações ou encolhimento de membrana pode ser informativo em caracterizando mutantes que impactam a distribuição ou a biossíntese de lipídios.

Além da coloração de células, é necessário determinar a função das proteínas que participam em processos essenciais. A caracterização das proteínas essenciais é tecnicamente desafiador, porque não é possível excluir genes essenciais e estudar as consequências fenotípicas. Assim, surgiram a abordagens alternativas que empobrecem a proteína. Por exemplo, um gene essencial pode ser colocado sob o controle de um promotor inducible, ao invés de seu promotor nativo. Promotores inducible são sensíveis a pequenas moléculas, tais como; 16, isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, de zinco e xilose23, assim, a transcrição do gene alvo cessa e a proteína de interesse é empobrecida quando o indutor é removido. Abordagens alternativas para esgotar as proteínas essenciais de interesse incluem riboswitches sintético24 que utilizam interações pequena molécula-RNA para dificultar a transcrição dos genes-alvo, CRISPR interferência25,26 para bloco de transcrição dos genes-alvo e Proteína inducible degradação27,28 que usa etiquetas de peptídeos de proteínas alvo para degradação pela ClpXP protease. Cepas de depleção fornecem apenas um curto período de tempo para caracterização antes que as células perdem a viabilidade, portanto, imagens microscópicas de células ao longo do tempo durante a depleção de proteína é uma poderosa abordagem para caracterização. Com efeito, microscopia das células bacterianas vivas permitiu aos pesquisadores obter insights sobre os processos biológicos fundamentais, incluindo os mecanismos de manutenção de forma celular, secreção e compartimentalização29.

A. tumefaciens é uma planta bacteriana patógeno30 e natural engenheiro genético31,32. Assim, os mecanismos relacionados a patogenicidade, incluindo3534,33,do interações patógeno-hospedeiro, secreção36e anfitrião transformação30,31, 37 tem sido extensivamente investigada. Para a concepção de estratégias que impedem a. tumefaciens mediada por doença ou reforçar a transformação da planta, os processos essenciais para a sobrevivência da . tumefaciens precisam ser melhor compreendida. O uso de corantes de destino específico e o recente desenvolvimento de uma estratégia de depleção de proteína pela . tumefaciens18 fornece um meio para investigar os processos essenciais.

Aqui, protocolos detalhados para análise microscópica de cepas de depleção de proteína, mutante e sua da . tumefaciens são fornecidos. Os dois primeiros protocolos descrevem como preparar células e rotulá-los com corantes de destino específico. O terceiro Protocolo fornece instruções passo a passo para preparar pastilhas de agarose (Figura 1) e imagem latente as células bacterianas (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Esses protocolos também podem ser adequados para outras bactérias com adaptações adicionais para condições de diferentes mídias, taxas de crescimento, exigências de oxigênio e estruturas celulares.

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Protocolo

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1. crescimento de cepas da . tumefaciens

  1. Cultivo de cepas da . tumefaciens
    1. Use uma ponta de madeira estéril da vara ou pipeta para inocular 1 mL de meio de crescimento ATGN (ver lista de materiais para a receita) com uma única colônia da estirpe desejada.
      Nota: Para as estirpes de depleção da . tumefaciens , o ATGN deve conter 1 mM IPTG como um indutor para manter a biossíntese da proteína essencial.
    2. Crescem as cepas da . tumefaciens pernoite em ATGN a 28 ° C, com agitação a 225 rpm.
    3. Medir a densidade óptica das células em 600 nm (OD600), utilizando um espectrofotômetro. Diluir a cultura de pilha para uma OD600 = ~0.2 e continuar a crescer até OD600 = ~0.6 é alcançado. Para cepas de depleção, continuar a crescer com indutor até OD600 = ~0.6 é alcançado.
    4. Use sua e mutante cepas da . tumefaciens em OD600 = ~0.6 para mancha alvo-específica e/ou microscopia de lapso de tempo (ver as seções 2 e 3.1). Para cepas de depleção, lavar o indutor (ver ponto 1.2).
  2. Remoção de indutor para caracterização de cepas de depleção de proteína a. tumefaciens
    1. 1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga desktop à temperatura ambiente.
    2. Para lavar, remover o sobrenadante e resuspenda o pellet em mídia fresca sem indutor da pelota e as células conforme descrito acima (1.2.1). Lave as células de um total de 3 vezes na nova mídia.
    3. Resuspenda o pellet final na mídia fresca e concentrar-se as células de uma OD600 = ~0.8 para coloração imediata com corantes específicos do alvo (secção 2 e Figura 4B-D) ou microscopia de lapso de tempo ( Figura 4Ae seção 3.2) . Alternativamente, pre-empobrecem as células para a quantidade de tempo desejada pelo crescimento de células em meios sem indutor antes da coloração e da imagem latente das células.

2. destino-específicos de coloração de células da . tumefaciens

  1. Parede celular d-amino ácido de fluorescente rotulagem
    Nota: FDAAs são tóxicos fluorescentes d-aminoácidos prontamente incorporadas o . tumefaciens peptidoglicano. Este procedimento simples rotulagem sondas crescimento padronização em células vivas6. Protocolos para a síntese de quatro FDAAs estão disponíveis38.
    1. 500 µ l de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho. Resuspenda o pellet de células em 100 µ l de mídia fresca.
    2. Adicione 5 µ l de 5mm FDAA para lavado e concentrado de células e incuba por 2 min no escuro.
      Nota: Limitar a exposição à luz FDAA. O tempo de incubação irá variar dependendo da taxa de crescimento da tensão. Normalmente, tempos de incubação devem ser de 5-10% do tempo dobrando6.
    3. Pelotas as células por centrifugação e lavar pelotas de célula com solução salina tamponada fosfato (PBS) três vezes.
    4. Resuspenda o pellet em ~ 50 µ l PBS.
      Nota: O volume de PBS usado para ressuspensão pode variar com base no tamanho da pelota.
    5. Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente (ver secções 3.1 e 3.2).
      1. Como alternativa, pare mais incorporação de rótulo, fixando as células com etanol a 70% gelado. Ressuspender as células em 1 mL de etanol a 70% gelado e incubar no gelo por 15 minutos.
      2. Coletar as células por centrifugação e Resuspenda em um pequeno volume de PBS para a imagem latente em um momento posterior. Loja de suspensões celulares a 4 ° C e imagem dentro de 48 horas.
  2. DNA de coloração com DAPI ou mancha laranja
    Nota: Observar DNA estrutura, as células são rotuladas com DAPI ou laranja (mancha de célula morta). Embora classicamente descrita como uma "mancha de mortos-célula", o laranja é permeant, fotoestável e não afeta o crescimento de células bacterianas, permitindo viver-pilha DNA imagem10. Em a. tumefaciens, laranja rotulagem funciona bem em células vivas e é adequada para microscopia de lapso de tempo (Figura 3). Em contraste, o ultravioleta (UV) luz ambiente necessário para células de imagem manchada de DAPI é fototóxico (Figura 3) e assim DAPI coloração é o mais adequado para a coloração de células vivas para imediata de imagem ou manchando pilhas fixas.
    1. DAPI coloração de células
      1. 1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho.
      2. Opcionalmente, para corrigir as células antes da coloração, resuspenda o pellet de células em 1 mL de etanol a 70% gelado. Incube no gelo por 10-15 min.. coletar as células por centrifugação como descritas em 2.2.1.1.
      3. Ressuspender as células em 1 mL de PBS contendo 1 µ l de solução-mãe de DAPI (1 mg/mL; Veja a Tabela dos materiais). Misture suavemente pipetando e incubar durante 5 minutos no escuro.
      4. Células de pelotas por centrifugação a 7.000 x g durante 5 min e ressuspender em 1 mL de PBS para remover o excesso DAPI. Lavar as células mais duas vezes e resuspenda o pellet em 50 µ l PBS ou mídia.
      5. Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente. Consulte as seções 3.1 e 3.2.
        Nota: Este protocolo não é ideal para microscopia de lapso de tempo observar a dinâmica do cromossomo (Figura 3). Considere o uso de coloração laranja como alternativa (ver secção 2.2.2).
    2. Coloração laranja de células vivas
    3. 1 mL de cultura exponencial de Pelotas (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugação a 7.000 x g por 5 min em uma centrífuga de área de trabalho. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS contendo 1 µ l de solução-mãe de laranja (veja a lista de materiais). Misture suavemente pipetando e incubar durante 5 min no escuro.
    4. Células de pelotas por centrifugação e ressuspender em 1 mL de PBS para remover excesso laranja. Lavar as células mais duas vezes e resuspenda o pellet em 50 µ l PBS.
    5. Aplicar 0,8-1 µ l de células para uma almofada de agarose e imagem usando microscopia de epifluorescência imediatamente. Consulte as seções 3.1 e 3.2.
      Nota: Este protocolo funciona bem com células vivas e é adequado para microscopia de lapso de tempo observar a dinâmica do cromossomo (Figura 3). Se não for conveniente para a imagem imediatamente, as células podem ser fixadas em etanol a 70% gelada (consulte a seção 2.2.1.2).
  3. Rotulagem de membrana
    Nota: A tintura fluorescente lipofílico styryl 4-64 tem sido amplamente utilizada para observar a membrana das células bacterianas. Em contraste com muitas bactérias, 4-64 rotulado a. tumefaciens células não rotular uniformemente, mas prefiro frequentemente exibem um padrão de "ferradura"14,15. Notavelmente, o polo de crescimento é quase desprovido de mancha, enquanto que o antigo poste intensamente é rotulado. Assim, 4-64 permite a visualização de ambos os padrões de crescimento celular e a estrutura da membrana na . tumefaciens.
    1. Adicionar FM 4-64 para uma concentração final de 8 µ g/mL em 1 mL de cultura de células de fase exponencial e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos no escuro.
    2. Pelota pilhas etiquetadas por centrifugação a 7.000 x g durante 5 minutos em uma centrífuga de área de trabalho e resuspenda o pellet de células em 1 mL de PBS. Lave as células de um total de três vezes para remover o corante em excesso.
    3. Ressuspender as células em um pequeno volume de PBS e local sobre uma almofada de agarose a imagem imediatamente. (Consulte as seções 3.1 e 3.2)
      Atenção: As células devem ser fotografadas imediatamente para observar padrões característicos de rotulagem.

3. imagem latente da . tumefaciens células

  1. Preparação de almofada de agarose
    Nota: Figura 1 contém uma sequência de imagens (painel A) e esquema (painel B) de uma almofada de agarose típicos preparada para microscopia de lapso de tempo. Almofadas de agarose são tipicamente preparadas conforme necessário.
    1. 3.1.1. use uma lamela como guia e corte uma 22 x 22 mm quadrada do laboratório de cinema (veja lista de materiais) executando um bisturi em torno das bordas.
    2. Corte um quadrado do centro do filme laboratório deixando um ~ 2-5 fronteira mm para servir como uma junta para a almofada de agarose. Descarte o recorte do centro.
    3. Coloque a gaxeta do filme numa lâmina de vidro (75 x 25 mm) limpada com uma amônia e líquido de limpeza sem álcool (ver lista de materiais) e aqueça até que o filme é ligeiramente derretido sobre vidro (imagem superior na figura 1A). Para derreter o filme do laboratório, use a borda de um bloco de calor conjunto a 70 ° C ou derreter levemente sobre uma flama.
    4. Preparar a solução de agarose misturando ~0.075 g agarose (veja a lista de materiais) em 5 mL de mídia em um pequeno frasco. Aqueça a solução em um microondas com agitação periódica para misturar até que a agarose é dissolvido e a solução é clara. Manter a solução de agarose em 55-70 ° C e usar para construção de várias almofadas de agarose em 48 horas.
    5. Pipeta de mídia contendo 1,2-1,5% de agarose no centro da gaxeta.
      Nota: O volume de mídia é tipicamente 50-60 µ l mas irá variar com base no tamanho da gaxeta. Adicionando mídia a um slide frio pode causar o agarose solidificar demasiado rapidamente, assim o slide deve ser mantido sobre uma superfície quente. A borda de um bloco de calor bem definido para obras de 70 ° C. Agarose de água ou soluções de agarose em buffer como salina tamponada fosfato (PBS) podem ser usadas em vez de mídia contendo agarose para aplicações em que o crescimento contínuo da célula não é necessário. Para cepas de depleção de imagem, pode ser indutor de presentes ou ausentes na mídia. Presença do indutor pode ser usada como um controle, Considerando que a ausência de indutor irá revelar o fenótipo de depleção.
    6. Coloque uma lamela sobre a gaxeta para distribuir uniformemente o agarose.
    7. Coloque slide sobre uma superfície fresca, nível para solidificar por ~ 2 min. Evite excessos da agarose almofada, pois isso resultará em uma superfície enrugada sobre a almofada de agarose e pool de suspensão de célula quando aplicados à superfície.
    8. Deslize cuidadosamente a lamela a esponja de agarose.
      Atenção: Não se apresse este passo. A almofada de agarose pode facilmente rasgar e uma almofada de agarose desigual pode dificultar a imagem latente.
    9. Permitir que a almofada de agarose ao ar seco para 1-2 min à temperatura ambiente até que a superfície da almofada parece seca. Usando um bisturi, remover uma pequena faixa de agarose para criar uma bolsa de ar (meio imagem, figura 1A); a bolsa de ar é tipicamente ~ 2 x 7-10 mm e a. tumefaciens células tendem a crescer melhor perto da bolsa de ar (Figura 1).
      Nota: Para a imagem latente de células fixas ou em condições onde o crescimento não é monitorizado, uma bolsa de ar não é necessária.
    10. Ponto 1-0,8 µ l de células sobre a almofada de agarose e cobrir com uma lamela de nova. Coloque delicadamente a lamela por cima da almofada do agarose para distribuir as células em toda a superfície da almofada do agarose.
    11. Selar as bordas da lamela usando VALAP derretida (consulte a Tabela de materiais para a receita; Figura 1A, imagem de fundo). A vedação ao longo de todas as bordas e cantos da lamela pode causar secagem do pad agarose, que levará para a derivação de células durante a imagem latente. Nota: A selagem da lamela é necessária somente para a imagem latente de lapso de tempo a longo prazo.

figure-protocol-1
Figura 1: preparação de almofada Agarose. (A) sequência do protocolo de preparação de almofada de agarose de imagem. Imagem 1 é um slide com a junta de filme de laboratório. Na imagem 2, a almofada de agarose e a bolsa de ar são visualizados. Finalmente, a imagem 3 mostra a almofada de agarose completa com as células sob uma lamela e selado com VALAP. (B), um diagrama esquemático de uma almofada de agarose para microscopia de lapso de tempo é fornecido. Características-chave do pad agarose são etiquetadas no esquema. (C), a bolsa de ar promoveu o crescimento da . tumefaciens em almofadas de agarose. São mostradas imagens de sua a. tumefaciens células cultivadas em uma almofada de agarose para 20 horas. Imagens foram tiradas em posições cada vez mais distantes da bolsa de ar. A distância da borda mais próxima da imagem para o bolso de ar é mostrada acima de cada imagem. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Imagem latente
    Nota: Contraste de interferência diferencial, contraste de fase e imagem latente de epifluorescência é realizada com um microscópio invertido equipado com focagem automática baseada em hardware, um palco automatizado, filtros padrão, uma fonte de luz LED, imersão de óleo 60 X objectivos (at 1.4) para contraste de fase ou contraste de interferência diferencial (DIC) e uma câmera de-acoplado-dispositivo de carga (EMCCD) de elétrons-multiplicação de 1K. O microscópio deve ser colocado em uma sala de temperatura controlada. Alternativamente, um palco mais quente ou câmara pode ser usada para manter temperaturas consistentes durante a imagem latente.
    1. Microscopia de epifluorescência
      Nota: Para a imagem latente de fluorescência das células vivas, é necessário limitar o número de aquisições de imagem e otimizar o tempo de exposição, para minimizar o fotobranqueamento e fototoxicidade. Para a imagem latente de cada corante, é aconselhável encontrar um tempo de exposição ideal que fornece detecção de fluorescência suficientes, mas não conduz à fotobranqueamento ou fototoxicidade. Nas figuras 2-4, tempos de exposição de 200 ms foram usados para todas as imagens de fluorescência. Para as sequências de lapso de tempo mostradas na Figura 3, imagens foram adquiridas a cada 10 min para 3h.
      1. Coloque óleo de imersão em atingir o objectivo pretendido e o slide invertido no suporte do slide no palco. Use os botões de focalização para colocar as células em foco.
      2. Adquira imagens em fase (ou DIC) e o filtro de fluorescência desejado.
        Nota: Os máximas excitação e emissão de comprimentos de onda para as manchas usados na Figura 2, Figura 3e Figura 4 são os seguintes: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), laranja (547/570).
    2. Microscopia de lapso de tempo
      Nota: Durante a microscopia de lapso de tempo os seguintes recursos são controlados pelo computador: x, y e z filtros de posição, obturadores e fluorescência. Um sistema de foco automático baseado em hardware é ideal para manter o foco durante a imagem latente de lapso de tempo. Alternativamente, pode ser usado um loop de auto-foco baseados em software.
      1. Coloque óleo de imersão em atingir o objectivo pretendido e o slide invertido no suporte do slide no palco. Use os botões de focalização para colocar as células em foco.
      2. Opcionalmente: Adquirir múltiplas (x, y) posições. Selecione aleatoriamente 10 campos de células em estreita proximidade com o bolso de ar das almofadas do agarose.
      3. Set-up a tempo sequência aquisição de imagem em fase ou DIC no intervalo de tempo desejado.
        Nota: Para a lapso de tempo sequência mostrada na Figura 4, DIC imagens foram adquiridas com a exposição de 30 ms cada 10min para 14 h. Quando utilizando imagens de fluorescência durante a microscopia de lapso de tempo, ajuste o tempo de exposição e intervalo de aquisição para minimizar fotobranqueamento e fototoxicidade.

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Resultados

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Destino-específico marcação de sua A. tumefaciens células
A fim de ilustrar essa morfologia celular não é afetada pelas etapas de lavagem ou tratamento com 1% de DMSO (que é usada para diluir os corantes fluorescentes), as células foram fotografadas diretamente da cultura (Figura 2A, painel de extrema-esquerdo), depois de lavar as células por centrifugação conforme descrito no ponto 1.2 (

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo contém uma série de procedimentos para a investigação de cepas da . tumefaciens sua, mutante e esgotamento. É interessante notar que todos os procedimentos listados na seção de protocolo podem ser facilmente adaptados para outras cepas bacterianas com modificações adicionais para dar conta de mídia de crescimento, temperaturas e taxas de crescimento.

O uso de corantes de destino específico é uma ferramenta valiosa para fornecer uma caracterização detalhada dos eventos d...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos o dom dos FDAAs usado na Figura 2 e Figura 4-Michael VanNieuwenhze (Universidade de Indiana). Agradecemos a membros do laboratório marrom para feedback durante a preparação deste manuscrito. Pesquisa no laboratório de marrom na divisão e crescimento de células da . tumefaciens é suportada pela National Science Foundation (IOS1557806).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cepas bacterianas
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmídeo necessário para virulência de Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA Δ ctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. A inserção de mini-Tn7 em um local artificial attTn7 permite a depelação do regulador mestre de cauda essencial CtrA no fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários<
strong>Media Components
ATGN Minimal MediumA 1 L de água esterilizada adicione 50 ml de tampão 20X, 50 ml de sais 20X, 12,5 ml de glicose a 40%. Para pratos, adicione 15 g de Bacto Agar a 1 L de água e autoclave. Esfriar a 55 &graus; C e adicione 50 ml de tampão 20X, 50 ml de sais 20X, 12,5 ml de glicose a 40%.
20X AT BufferAdicione 214 g/L KH2PO4 à água e ajuste o pH para 7,0 com hidróxido de sódio. Autoclave.
NaOHFisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT SaisAdicione 40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4• 7H2O, 0,2 g/L CaCl2• 2H2O e 0,024 g/L MnSO4• H2O à água. Autoclave.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4• 7H2OBioReagentes FisherBP213
CaCl2• 2H2OBioReagentes FisherBP510
MnSO4• H2OFisher ChemicalM114
GlucoseFisher ChemicalD16Prepare 40% de caldo em água. Esterilize por filtro.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423Adicione 15 g a 1 L de água ao preparar pratos.
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Aditivos de mídia opcionais
KanamycinGoldBioK-120Prepare como uma solução estoque de 100 mg/ml em água e filtre esterilizar. Use na concentração final de 200 µ g/ml.
IPTGGoldBioI2481C5Preparar como uma solução estoque 1 M em água e esterilizar por filtro. Use na concentração final de 1 mM conforme necessário para a indução.
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais de microscopiaLâminas de
microscópioFisherbrand12-550D25 X 75 X 1,0 mm. Limpe com limpador de vidros Sparkle.
Vidro de cobertura do microscópioFisherbrand12-541-B22 X 22 mm. No. 1.5. Limpe com o limpador de vidros Sparkle.
Limpa Vidros Sparkle HomeDepot203261385Sem amônia e álcool.
Agarose Ultra PuraInvitrogen16500-100Adicione à água, PBS ou meio a uma concentração final de 1 - 1,5%. Derreta no micro-ondas e coloque em 70 C
PBSFisher BioReagentsBP399500solução 10X a ser diluída para 1X com água estéril.
ParafilmBemisPM-999Filme de laboratório usado como junta na preparação da almofada de agarose.
VALAPAdicione pesos iguais de lanolina, cera de parafina e vaselina a um tubo cônico. Tubo de calor em 70 > C seco, talão ou banho-maria para derreter e misturar. Aplique VALAP ainda fundido.
Manteiga de lanolinaSAAQINSQ-LAB-R1
VaselinaTarget Corp.06-17644
Velas artesanais decera de parafina263012
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Corantes específicos do alvo
DMSOFisher BioReagentsBP231-1Use para diluir soluções de estoque de corantes conforme necessário.
FDAAs (NADA, HADA, TADA)OsFDAAs podem ser sintetizados ou adquiridos por meio de acordo com Mike VanNieuwenhze (Universidade de Indiana). Preparar a solução-mãe a 100 mM em DMSO. Use a uma concentração final de 5 mM.
DAPIThermoFisher Scientific62247Prepare 1 mg / ml de solução estoque em DMSO. Use na concentração final de 1 µ g/ml.
InvitrogenS11368mancha do ácido nucleico de SYTOXé 5 mM em DMSO. Utilizar na concentração final de 5 µM.
FM4-64InvitrogenT3166Preparar 8 mg/ml de solução-mãe em DMSO. Use na concentração final de 8 µ g/ml.
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Banho secoSheldon Manufacturing, Inc.52120-200
Grânulos térmicos metálicosLab Armor42370-002
Microscópio de epifluorescência equipado com uma câmeraNikon Eclipse TiE equipado com uma câmera QImaging Rolera em-c2 1K dispositivo de multiplicação de elétrons (EMCCD) é usado neste trabalho.
A concentração conservada em estoque alaranjada de da EMCDD

Referências

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