Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

O objetivo geral desta abordagem baseada em microscopia é observar um processo central durante o crescimento de células bacterianas. Este método nos permite abordar questões importantes em bacteriologia, como como os processos essenciais são coordenados durante o crescimento e divisão das células bacterianas. A principal vantagem dessa técnica é que podemos usar reagentes fluorescentes para visualizar superfícies e estruturas celulares bacterianas em células vivas.

Aqui, usamos esse método para fornecer informações sobre processos essenciais em Agrobacterium tumefaciens. No entanto, esse processo também pode ser adotado por outras bactérias para estudar seu crescimento. Para começar, use um bastão de madeira estéril ou ponta de pipeta para inocular três mililitros de meio de crescimento ATGN, com uma única colônia de uma cepa selvagem ou mutante de A.Tumifaciens.

Cultive a cultura a 28 graus Celsius e 225 RPM durante a noite. No dia seguinte, use um espectrofotômetro para medir o OD600. Em seguida, dilua a cultura de células para um OD600 de aproximadamente 0,2 e continue a cultivar as células para um OD600 de 0,6.

Dispense um mililitro de cultura exponencial em três tubos de microcentrífugas. E coloque as células em uma centrífuga de mesa a 7.000 x g por cinco minutos. Ressuspenda cada pellet celular em um mililitro de PBS e, em seguida, adicione um microlitro de solução estoque DMSO Orange ou solução estoque DAPI.

Misture delicadamente pipetando e incube as células ressuspensas no escuro por cinco minutos. Pulverizar as células por centrifugação a 7 000 x g durante cinco minutos e ressuspender o sedimento num mililitro de PBS para remover o excesso de reagente. Em seguida, lave as células mais duas vezes e ressuspenda o pellet em 50 microlitros de PBS ou meio.

Para imagens simultâneas de lapso de tempo, combine dez microlitros de células de cada tratamento em um novo tubo de microcentrífuga. Para preparar almofadas de agarose para imagens celulares, use uma lamínula como guia e corte um quadrado de 22 por 22 milímetros de filme de laboratório passando um bisturi nas bordas. Corte um quadrado do centro do filme de laboratório, deixando uma borda de aproximadamente dois a cinco milímetros para servir de junta para a almofada de agarose.

Em seguida, descarte o recorte central. Coloque a junta de filme em uma lâmina de vidro, limpa com um limpador sem amônia e álcool. E use um bloco de calor ajustado para 70 graus Celsius ou uma chama para aquecer a lâmina até que o filme derreta levemente no vidro.

Em seguida, prepare a solução de agarose misturando aproximadamente 0,075 gramas de agarose e cinco mililitros de meio em um frasco pequeno. Aqueça a solução no micro-ondas com agitação periódica para misturar, até que a agarose se dissolva e a solução esteja límpida. Mantenha a solução de agarose a 55-70 graus Celsius e use-a para a construção de várias almofadas de agarose dentro de 48 horas.

Pipete o meio de agarose quente no centro da junta. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a junta para distribuir uniformemente a agarose. Coloque a lâmina em uma superfície plana e fria para solidificar por aproximadamente dois minutos.

Agora, deslize cuidadosamente a lamínula da almofada de agarose e, em seguida, deixe-a secar ao ar por um a dois minutos em temperatura ambiente, até que a superfície da almofada pareça seca. A construção adequada da almofada de agarose é crucial para a aquisição de imagens de alta qualidade. Não tente criar imagens em um bloco ruim.

Se a almofada de agarose secar, ondular ou rasgar, é melhor não ser preguiçoso e, em vez disso, fazer uma nova almofada. Em seguida, usando um bisturi, remova uma pequena tira de agarose para criar uma bolsa de ar de aproximadamente dois por sete a dez milímetros. A. As células tumefacien tendem a crescer melhor perto da bolsa de ar.

Localize 0,8 a 1 microlitro de células na almofada de agarose. Em seguida, coloque suavemente uma lamínula sobre a parte superior da almofada de agarose para distribuir as células pela superfície da almofada. Para imagens de lapso de tempo de longo prazo, use Valap derretido para selar as bordas da lamínula.

Certifique-se de selar ao longo de todas as bordas e cantos da lamínula com Valap. Não fazer isso pode resultar em deriva durante a imagem de lapso de tempo da almofada de agarose. Para realizar a microscopia de epifluorescência, coloque óleo de imersão na objetiva desejada e coloque a lâmina invertida no suporte da lâmina no palco.

Use os botões de foco para colocar as células em foco. Adquira imagens em Fase, ou DIC e fluorescência, usando o filtro de fluorescência desejado para imagens de fluorescência. Opcionalmente, adquira várias posições x, y selecionando aleatoriamente dez campos de células próximos à bolsa de ar das almofadas de agarose.

Configure a aquisição de sequência de tempo para imagem em fase, ou DIC, no intervalo de tempo desejado. Como mostrado aqui, as células foram fotografadas diretamente da cultura após a lavagem por centrifugação e após incubar as células com 0,1% de DMSO, os resultados mostraram que o DMSO sozinho não afeta a morfologia celular. Tanto o DNA marcado com laranja quanto o DAPI dentro de células vivas de A.Tumefaciens.

Nas células pré-divisionais tardias, dois nucleolóides distintos são observados com a coloração Orange, enquanto a marcação do DNA parece mais difusa com a coloração DAPI. Neste experimento de lapso de tempo com uma proporção igual de A.Tumefaciens de tipo selvagem não marcado, marcado com DAPI e marcado com laranja, todas as células cresceram quando fotografadas com microscopia de contraste de fase, indicando que nenhuma das manchas prejudicou o crescimento celular. As células também cresceram sob contraste de fase em microscopia de epifluorescência usando o filtro TRITC.

Quando fotografadas com o filtro DAPI, no entanto, as células pararam de crescer em uma hora. Seguindo métodos semelhantes, outros reagentes fluorescentes também podem ser usados para visualizar a parede celular ou membranas bacterianas. Além disso, muitos desses corantes fluorescentes podem ser combinados para fornecer uma imagem abrangente da superfície da célula bacteriana.

A visualização de processos essenciais em bactérias vivas é empolgante, porque abre a possibilidade de estudar esses processos em mutantes condicionais ou bactérias não modelo. Isso nos permite aprimorar nossos estudos de diversas espécies bacterianas.