Artigo de método

Um ensaio automatizado rápida iterativo Geotaxis negativo para analisar o comportamento de adultos de escalada em um modelo de drosófila de neurodegeneração

DOI:

10.3791/56507

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12 de setembro de 2017

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1Research Center for Translational Medicine, Tongji University School of Medicine, 2Key Laboratory of Arrhythmias of the Ministry of Education of China, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Neurobiology, Tongji University School of Medicine, 4Shanghai Advanced Research Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, 5Sino-Danish College, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.

Resumo

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Doenças neurodegenerativas são frequentemente associadas a uma perda progressiva da capacidade de movimento, esperança de vida reduzida e neurodegeneração idade-dependente. Para entender o mecanismo celular esses eventos e suas relações causais com o outro, Drosophila melanogaster, com as suas sofisticadas ferramentas de genéticas e diversas características comportamentais, são usadas como modelos de doença para avaliar neurodegenerativas fenótipos. Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para analisar o comportamento de adultos geotaxis negativo de Drosophila , como uma indicação para possíveis defeitos motor associado a neurodegeneração. Uma máquina automatizada é projetada e desenvolvida para sincronização de mosca de unidade usando um impulso elétrico inicial, mais tarde, permitindo a gravação de comportamento negativo geotaxis sobre um curso de segundos a minutos. Imagens do vídeo digitalmente gravado então são processadas com o software RflyDetection concebido para manipulação de dados estatísticos. Diferente do ensaio geotaxis negativo manualmente controlado com base em uma única mosca, este protocolo preciso, rápido e alta produtividade permite a aquisição de dados de mais do que centenas de moscas simultaneamente, proporcionando uma abordagem eficiente para avançar a nossa compreensão do mecanismo subjacente de locomoção déficits associados a neurodegeneração.

Introdução

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Uma variedade de protocolos e métodos foram desenvolvidos para analisar o comportamento de escalada adulto de Drosophila . Um pouco trabalhosa, a análise tradicional principalmente envolve a colocação de uma única mosca dentro de um frasco de individual e usa uma força manual para tocar voa para baixo para a sincronização1,2,3,4. É tedioso e demorado, impróprios para grandes estudos de alta produtividade e tem potenciais variações da força manual usado para bater para baixo as moscas, bem como outras limitações. Para melhorar o ensaio, um ensaio rápido iterativo negativo Geotaxis (anel) foi desenvolvido, que permite alta produtividade análise sobre numerosas moscas no mesmo tempo5. No entanto, o ensaio ainda requer uma força exercer manualmente para sincronizar a voar para ação. Nossa versão do ensaio do anel, revisado com o ensaio anterior, inclui uma base de metal Hospedagem de vários frascos contendo mosca controlados automaticamente por um motor elétrico para conduzir a sincronização voar6. Após a gravação, a mosca subindo imediatamente após a sincronização é gravada então analisados usando um software concebido. Nosso ensaio de anel automatizado eliminou o processo tedioso e trabalho intensivo em coletar dados de uma única mosca, um de cada vez e habilitado para o processo de aquisição de dados para ser mais eficiente. Além disso, o ensaio automatizado do anel tem sido empregado em uma série de estudos para elucidar a mecanismo subjacente a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, validando a abordagem com alta eficiência7,8,9 .

Neste artigo, vamos demonstrar o ensaio automatizado de anel usando o DDC-Gal4 conduzido RNAi moscas. DDC-Gal4 é uma linha de Gal4 especificamente expressando em dopaminérgico (DA) e neurônios serotoninérgicos, representando assim uma ótima ferramenta para analisar os efeitos do gene alvo associados com déficits locomotoras neurodegeneração10de acompanhamento. Além disso, incorporamos UAS-Dicer2, uma linha de mosca que aumenta a eficiência de RNAi, para gerar o UAS-Dicer2; DDC-Gal4 ferramenta linha. As moscas de RNAi escolhemos usar é o auxilin (aux), v16182 de RNAi (auxR16182), um gene que anteriormente identificamos para expor um efeito na atividade locomotora8de voar. auxGFP moscas também são preparadas para analisar os efeitos sobre a superexpressão de aux . Vamos mostrar como usar o ensaio automatizado do anel para medir mosca geotaxis negativa, apresentar os resultados e discutir quaisquer implicações que adquiriu a partir dos resultados.

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Protocolo

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1. coleção voar

  1. manter as moscas no padrão alimentar de voar em 25 ° C, umidade de 70% e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
  2. Recolher UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder voar de dióxido de carbono (CO 2) anestesia.
  3. Atravessar estas virgens para 2 dias de idade moscas machos adultas carregando os seguintes genótipos: UAS-mCD8GFP (controle), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux superexpressão), e auxR 16182; auxGFP (rescue), com um macho: fêmea relação de 1:2.
  4. Em separado recentemente coletar eclosed machos e fêmeas em 3 frascos para cada grupo, por experiência, colocando 10 moscas em cada frasco de mosca regular com padrão alimentar em 25 ° C.
  5. Dependendo do experimento, mantenha o coletados voa até 35 dias e usá-los para análise automatizada de anel no dia 5, 15, 25 e 35.

2. Automatizado do ensaio do anel

  1. transferir 10 moscas coletadas (unisex) por genótipo em cada frasco, em seguida, fixe o frasco com um parafuso. Analisar o controle de moscas e moscas carregando diferentes genótipos juntos para cada conjunto de experimentos (até 10 frascos simultaneamente, 10 moscas em cada frasco).
  2. Ligar a câmera digital colocada na frente do aparelho, e começar a gravar uma vez moscas está carregados e prontos.
  3. Após permitir 1 min para moscas instalar-se em frascos, ligue o controlador de passo que controla o driver passo; isto conduz o pequeno motor elétrico para controlar a alavanca anexada para que consecutivamente sobe e torneiras do aparelho 4 vezes em 2 s. Veja a Figura 1.
    1. Após a batida, note que as moscas começam a subir a parede. Certifique-se de que a gravação continua.
  4. Repita a sincronização conforme descrito na etapa 2.3 em intervalo de 60-s para ensaios consecutivos de 3 a 5.
  5. Repetir o experimento para 5, 15, 25 e 35 dias de idade moscas. Realizar pelo menos 3 experimentos independentes para cada grupo, cada experimento pelo menos 30 coletados voa (3 frascos).

3. Análise de dados

  1. importar o vídeo gravado para o computador.
  2. Tirar um instantâneo do vídeo em 6 s depois da batida, para cada julgamento.
  3. Importar a imagem do instantâneo para o software RflyDetection (ver Figura 2), usando o ' arquivo ' menu.
  4. Definir as linhas de base superiores e inferiores do frasco precisamente por usando o ícone de linha de base na barra de ferramentas e, em seguida, usando o cursor para marcar as linhas de base superiores e inferiores da imagem.
  5. o número de moscas por frasco (por exemplo, aqui 10) de entrada no ' Flys em rect ' campo e frasco de comprimento (por exemplo, 14cm aqui) no ' tubo altura ' campo dentro da barra de configurações.
    1. Nota que as posições individuais de mosca são detectadas e rotuladas com pontos na tela para cada frasco.
      Nota: A Figura 2 indica as posições de todos os cliques de botão de menu.
  6. Nota que o software automaticamente determina a distância escalada para cada mosca e exibe os valores em média de 10 moscas em cada frasco em uma tabela no painel da direita. (Ver Figura 2)
  7. Processo, o número de escalada com software estatístico (por exemplo, prisma) para posterior análise estatística.
  8. Presente os dados como média ± SEM.
  9. Calcular o p-valores de importância (indicados com asteriscos, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001) usando ANOVA One-Way com Bonferroni teste de comparação múltipla

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Resultados

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Este artigo demonstra o uso de um ensaio de anel automatizado em avaliar o comportamento de voar geotaxis negativo. Ao contrário o ensaio anterior do anel, nosso ensaio inclui um aparelho automatizado que fornece uma força elétrica para sincronizar a voar para ação e analisa até centenas de moscas simultaneamente (Figura 1). Análise de Dicer2 de ; DDC > auxR16182 moscas mostraram uma diminuição de idade-dependente à distância escalada...

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Discussão

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O ensaio de anel automatizado descrito aqui permite uma análise do elevado-throughput de comportamento de voar geotaxis negativo para centenas de moscas simultaneamente. Anteriormente estratégias existentes para a análise de escalada adulto envolvem observações de uma única mosca em um frasco individual e posição voar manualmente é detectada pelo olho. Este processo um pouco tedioso às vezes pode causar má interpretação ou má interpretação de dados, bem como trabalho trabalhoso. Nosso ensaio automatizado do anel começa c...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos o centro de estoque de Bloomington e centro de RNAi Viena drosófila para estoques de voar. A patente para o aparelho de anel pertence ao Instituto de pesquisas avançadas de Xangai, da Academia Chinesa de Ciências. Pedidos de software RflyDetection deve ser feito para Fu-de Huang (ver lista de autor). Este trabalho foi apoiado por concessões do nacional básica pesquisa programa de China (973 programa 2013CB945602) e Nacional Natural Science Foundation da China (31270825 e 31171043). Agradecemos a membros de laboratório Ho para discussão e comentários.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Forma Environmental ChamberThermo3949
Carbon dioxide cylindersFuLian GAS TechnologyGB/T6052
HDR-CamcorderSONYHDR-CX220E
Binocular stereomicroscopeXin ZhenSMZ-168BL
Electronic scalesMinQiaoSL1002N
RefrigeratorHaierSC-350
Agar-agar powderSinopharm10000561
GlucoseSinopharm10010518
Corn mealSinopharm5464654
Brown sugarLiuCaiYuan45467936
Instant dry yeastAB MAURI20886
AuxR16182VDRC7187
UAS-Dicer2Bloomington24650
UAS-mCD8GFPBloomington32185
DDC-Gal4Um presente de Fude Huang
AuxGFPUm presente de Henry Chang

Referências

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  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741(2015).
  4. Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
  7. Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
  8. Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

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