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Artigo de método

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

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DOI:

10.3791/56508

⸱

6 de fevereiro de 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

Neste artigo

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Resumo

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Resumo

Anticorpos monoclonais (mAbs) são poderosas ferramentas úteis para ambas as pesquisas fundamentais e em biomedicina. Sua alta especificidade é indispensável quando o anticorpo precisa distinguir entre estruturas altamente relacionadas (por exemplo, uma proteína normal e uma versão mutante respectivas). A maneira atual de gerar tais discriminatórios mAbs envolve extensa seleção de várias células B produtoras de Ab, que é caro e demorado. Propomos aqui um método rápido e econômico para a geração de discriminativa, mAbs plenamente humano a partir de sangue humano circulam os linfócitos B. A originalidade desta estratégia é devido a seleção de células de ligação B antígeno específico combinado com a Counter-seleção de todas as outras células, usando prontamente disponível periférico sangue mononucleares células (PBMC). Uma vez que células B específicas são isoladas, sequências de cDNA (complementar ácido desoxirribonucleico) que codifica para o mAb correspondente são obtidas usando a tecnologia de célula única reverso transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) e posteriormente expressos em humanos células. Dentro de menos de 1 mês, é possível produzir miligramas de mAbs humana altamente discriminativa, dirigido contra praticamente qualquer antígeno desejado naturalmente detectado pelo repertório de células B.

Introdução

O método descrito aqui permite a produção rápida e versátil de totalmente humanas-anticorpos monoclonais (mAbs) contra um antígeno desejado (Ag). Celia é ferramentas essenciais em muitas aplicações de investigação fundamental em vitro e em vivo: fluxo cytometry, histologia, mancha ocidental, bloqueio e experimentos, por exemplo. Além disso, mAbs estão sendo usados cada vez mais na medicina para tratar doenças auto-imunes, câncer e controle de rejeição de transplante1. Por exemplo, mAbs anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) foram recentemente usados como inibidores de ponto de verificação imune em tratamentos de câncer2.

Os primeiros mAbs foram produzidos por imunoglobulinas (Ig)-secretoras de hibridomas obtidos a partir das células no baço de ratos imunizados ou ratos. No entanto, a forte resposta imune contra murino ou rato mAbs dificulta seu uso terapêutico em humanos, devido a sua rápida liberação e a provável indução de reações de hipersensibilidade3. Para resolver este problema, sequências de proteína animal de mAbs foram parcialmente substituídas por dos humanos para gerar anticorpos chamados de rato-humano ou humanizados quiméricoes. No entanto, esta estratégia apenas parcialmente diminui imunogenicidade, aumentando substancialmente tanto o custo e o tempo-escala de produção. Uma solução melhor é gerar mAbs humano diretamente de células humanas de B e várias estratégias para isso estão disponíveis. Um deles é o uso do fago ou fermento de exibição. Isto envolve exibindo domínios variáveis de uma biblioteca combinatorial de Ig humana aleatória pesado e luz encadeia no fago ou leveduras e realização de uma etapa de seleção usando o antígeno específico de interesse. Uma grande desvantagem dessa estratégia é que correntes pesadas e claras são aleatoriamente associadas, levando a um aumento muito grande na diversidade de anticorpos gerados. Anticorpos obtidos são improváveis corresponder a aqueles que surgem de uma resposta imune natural contra um particular Ag. Além disso, dobradura de proteína humana e modificações borne-translational não são sistematicamente reproduzidas em procariontes ou mesmo em leveduras. Um segundo método de produção humana mAb é o immortalization de células B humanas naturais, pela infecção do vírus Epstein - Barr ou expressão dos fatores anti apoptótica BCL-6 e BCL-XL4. No entanto, este método é aplicável apenas às células de memória B e ineficiente, que exige triagem de numerosos mAb imortalizado B células que produzem a identificar os clones mAb poucos (se houver) com a especificidade antigênica desejada. O método é, portanto, caro e demorado.

Recentemente foi descrito um novo protocolo para produção de mAbs humano isolado único B células5. Baseia-se em um otimizado monocelulares reverter transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) para amplificação de ambos os pesados e luz-cadeia codificação segmentos a partir de uma única célula B classificada. Isto é seguido pela clonagem e expressão desses segmentos em um sistema de expressão eucarióticos, permitindo assim a reconstrução de um mAb plenamente humano. Este protocolo tem sido usado com sucesso a partir de células B de doadores vacinados. As células foram colhidas várias semanas após a vacinação para obter frequências mais altas de células B dirigidas contra o Ag desejado e, portanto, limitar o tempo necessário para a seleção de6. Também foram produzidos outros mAbs plenamente humanos de infectados pelo HIV+ (vírus de imunodeficiência humana) pacientes7 e melanoma pacientes8. Apesar destes avanços, ainda não há nenhum procedimento disponível que permite o isolamento de células B Ag específico independentes de seu fenótipo de memória ou frequência.

O procedimento descrito aqui leva a isolamento eficiente ex vivo de células humanas de B circulantes, com base na sua especificidade BCR, seguida pela produção de plenamente humano mAbs antígeno-específicas em alto rendimento e com um tempo de rastreio de baixo. O método não está restrita a células B de memória ou pilhas de B de desegregação induzidas após uma resposta imune, mas também pode ser aplicado ao repertório B célula humana ingênua. Que funciona mesmo a partir de células B Ag específicos presentes em muito baixas frequências é uma boa indicação de sua eficiência. O princípio do método é como segue: células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estão manchadas com dois tetrâmeros apresentando o antígeno de interesse, cada um marcado com um fluorocromo diferente (por exemplo, ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e um terceiro tetrâmero apresentando um antígeno estreitamente relacionado conjugados com um fluorocromo terceiro (por exemplo, Brillant violeta 421 (BV421)). Para enriquecer para ligação de antígeno de células, as células então são incubadas com pérolas revestidas com anti-PE e Abs anti-APC e classificada em colunas de separação de células. A fração de célula APC PE+ + é selecionada, manchadas com uma variedade de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir a identificação de células B e sujeito a classificação de célula de citometria de fluxo. Células B, que são PE+ e APC+, mas violeta brilhante-, são isoladas. Esta etapa Counter-seleciona as células que não são células B ou que não se ligam ao antígeno tetramerized, mas vincular a PE ou APC (estas células serão PE+ APC– ou PE– APC+) ou a parte não-antígeno dos tetrâmeros usado (estas as células serão BV421+). Células B não altamente específicas para o epítopo de interesse também são Counter-Selecionadodas para esta etapa (estas células também será BV421+). Assim, este método pode purificar altamente específicas B celulas que expressam receptores de células B (BCRs) capazes de discriminar entre dois antígenos muito aparentados. Única células B específicas são colhidas em tubos e suas PCR amplificados Ig cDNAs (os ácidos desoxirribonucleico complementares) clonado e expressa por uma linhagem de células humanas como secretada mAbs IgG.

Como uma prova de conceito, este estudo descreve a geração eficiente de mAbs humana, que reconhecem um peptídeo apresentado por uma classe de complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula e podem discriminar entre este peptídeo e outros peptídeos carregados na mesma MHC-eu alelo. Embora o nível de complexidade deste Ag é importante, esse método permite que (i) recuperação de alto rendimento de mAbs Ag-específicos; (ii) produção de mAbs capaz de discriminar entre dois estruturalmente fechar Ags. Esta abordagem pode ser estendida para pacientes infectados ou vacinados sem qualquer modificação do protocolo e também já foi implementada com sucesso em um rato humanizado sistema9. Assim, este estudo descreve uma abordagem versátil e eficiente para gerar mAbs totalmente humana que pode ser usado em pesquisa básica e imunoterapia.

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Protocolo

Todas as amostras de sangue periférico humano foram obtidas de doadores anônimos adultos após consentimento informado, em conformidade com o Comitê de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimento PLER NTS-2016-08).

1. isolamento de células mononucleares de sangue periférico humano

Nota: A partir de material pode ser sangue periférico humano total ou cytapheresis amostras. As amostras não devem ter mais de 8 h e suplementado com anticoagulantes (por exemplo, heparina).

  1. Dilua o sangue com 2 volumes (sangue periférico humano) ou 5 volumes (cytapheresis exemplo) de meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  2. Cuidadosamente camada 35 mL de suspensão de células diluído em 15 mL de meio de gradiente de densidade em um tubo cónico de 50 mL. Faça como muitos tubos conforme necessário para distribuir o sangue diluído. Centrifugar a 1.290 x g, durante 25 min à temperatura ambiente em um rotor balançando-balde com freio fora.
  3. Cuidadosamente Aspire a camada de células mononucleares na interface entre o meio de gradiente de densidade e a camada de plasma e as células de transferência para um novo tubo cónico de 50 mL.
  4. Encha o tubo com meio RPMI, misturar e centrifugar a 1.290 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
  5. Ressuspender as células em 20 mL de meio RPMI e centrifugar a 200 x g durante 10 minutos remover as plaquetas. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
  6. Ressuspender as células em meio RPMI com 10% soro Fetal bovino (FBS).
    Nota: Proceda diretamente a rotulagem do tetrâmero ou manter células a 4 ° C durante a noite em uma concentração de 107 células/mL.

2. tetrâmero associada magnético enriquecimento das células B Ag-específicos

  1. Prepare Ag-tetrâmeros, acrescentando qualquer PE ou prêmio APC-rotulados classe streptavidin ou BV421-rotulado streptavidin em uma relação molar de 1:4 para monômeros de antígeno biotinilado. Adicione a quantidade apropriada de streptavidin-conjugado em três partes separadas, adicionando uma alíquota de cada 10 min à temperatura ambiente.
  2. Distribuir as células (até 3 x 108 por tubo) em tubos de 15ml cónico e centrifugar a 460 x g por 5 min.
    Nota: O seguinte protocolo é para um tubo.
  3. Ressuspender as células em 200 µ l de PBS (fosfato Buffered Saline) com 2% FBS. Adicione PE - APC- e BV421-conjugados tetrâmeros, cada um a uma concentração final de 10 µ g/mL. Misture bem e incube por 30 min à temperatura ambiente.
  4. Preparar o buffer de separação de células gelada (SB) usando PBS com 0,5% de BSA (albumina de soro bovino) e EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 2 mM.
  5. Adicione 10 mL de células SB da pelota por centrifugação a 460 x g durante 5 min.
  6. Ressuspender as células em 500 µ l de gelada SB adicionar 50 μl, de anti-PE e 50 µ l de anti-APC microbeads magnéticos.
  7. Misture bem e incube por 20 min a 4 ° C.
  8. Repita a etapa 2.5 duas vezes.
  9. Eliminar o sobrenadante cuidadosamente andresuspend o centrifugado em uma concentração de 2 x 108 células/mL em gelo frio SB.
  10. Equilibrar uma grande coluna de magnética posicionada sobre um ímã com 3 mL de SB.
  11. Suspensão de células de transferência de 2,9 na parte superior da coluna equilibrada e permitir que ele seja completamente. PASSO fundamental: Para evitar a aglutinação da coluna, passe as células através de uma malha de nylon 70 µm.
  12. Enxaguar o tubo que continha as células com 3 mL de gelo frio SB e transferir a reserva diretamente sobre a coluna (em caso de filtração, engranzamento de nylon enxaguar a 70 µm).
  13. Quando o buffer foi completamente drenado na coluna, adicione mais 3 mL de gelo frio SB à coluna.
  14. Repita a etapa 2.13 para outra lavagem de 3 mL.
  15. Remova a coluna o ímã e coloque sobre um tubo de coletando cônico de 15 mL.
  16. Adicionar 5 mL de gelo frio SB na parte superior da coluna e lave imediatamente as células da coluna usando o êmbolo. Repita este passo uma vez.
  17. Centrifugar as células coletadas (fração de células positivas enriquecido tetrâmero relevantes) a 460 x g por 5 min e prossiga para anticorpos adicionais.
    Nota: Piscina coletadas células de todos os tubos, se for o caso.

3. coloração de células humanas B Ag-específicos e classificação de célula

  1. Ressuspender as células com um coquetel de anticorpos anti-humanos CD3 (diluição final: 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50) e 7AAD (1: 1000) em um volume final de 100 µ l de PBS com 2% FBS. Incubar durante 30 min a 4 ° C.
  2. Adicionar 10 mL de PBS para células, centrifugar 460 x g por 5 min e eliminar o sobrenadante. Repita este passo uma vez. Ressuspender as células em 200 µ l de PBS, filtro em malha de nylon 70 µm.
  3. Proceda para classificar células B específicas a nível de célula única sobre um citômetro de classificador de célula com um 100 µm-bocal e uma pressão de 20 psi sem exceder 1.000 eventos/s9.
    Nota: A estratégia associada usada é mostrada na Figura 1. As células foram primeiro condomínio fechadas no CD14–CD16 7AAD–– células para excluir os monócitos, NK e células mortas (não mostradas na Figura 1). Então CD19+ B células foram Selecionadodas antes gating no duplas células coradas pelo PE e APC relevantes Ag-tetrâmeros. As células B não-específicos foram excluídas por retenção na BV421 de células negativas (inocente por Ag-tetrâmero irrelevante).
  4. Colete células únicas B em 8-tira da polimerase anteriormente preenchida com 10 µ l de 1X PBS e 10 unidades de inibidor de RNAse e colocado em um rack para 96 microtubos. Congelar imediatamente os tubos PCR a-80 ° C.
    Nota: As máscaras do tipo escolhidas no citômetro instrumento são máscara de rendimento: 0, máscara de pureza: 32 e máscara de fase: 0. este depósito de célula única poderia ser ajustado para um prato PCR de 96 ou 384 poços, se necessário. Pilhas de B única devem ser congeladas tão rapidamente quanto possível e podem ser deixadas a-80 ° C durante várias semanas, se necessário.

4. única célula RT-PCR

  1. Lyse pilhas diretamente aquecendo as amostras congeladas em tiras PCR a 70 ° C por 5 min em um banho seco.
  2. Transferi as tiras para gelo e proceder ao reverter a transcrição (RT) pela adição de 10 µ l pelo tubo de um 2x buffer de mestre mistura contendo 1 mM dNTP, 25 µ g/mL oligod(T) as primeiras demão, 5 µM aleatório hexâmeros, 20 unidades de inibidor de RNAse e 400 unidades de transcriptase reversa.
    Nota: Após o descongelamento de células, RT deve ser executado rapidamente para evitar a degradação do RNA.
  3. Incube a 25 ° C por 5 min permitir hexâmeros aleatórios cruzar, então incubar durante 1 h a 50 ° C e terminar com uma incubação a 95 ° C por 3 min parar a reação.
  4. Proceda com duas rodadas de amplificação por PCR aninhada para cada uma das regiões de codificação para variável pesado (vH) e kappa (vLκ) ou cadeias leves lambda (vLλ).
    Nota: Como alternativa, RT amostras podem ser congeladas a-20 ° C e mantidas por uma semana.
    1. Para a primeira rodada de PCR, adicionar 3 µ l de cDNA para um volume final de 40 µ l contendo 1,5 mM MgCl2, dNTPs de 0,25 mM, 2,5 unidades de DNA polimerase e 200 nM de primers externas (ver Figura 2 e Tabela de materiais para sequências da primeira demão).
      Nota: Composição do mix de cartilhas exterior. Para a amplificação da cadeia pesada: 4 encaminhar as primeiras demão (mistura de hve 5') e 2 reverter primeiras demão (mistura CµCγ de 3'). Para a amplificação de cadeia leve kappa, 3 encaminhar as primeiras demão (5' LV | misturar) e 1 reverso da primeira demão (3' Cκ543-566). Para a amplificação de cadeia leve lambda, 7 encaminhar Cartilhas (5' mistura de LVl) e 1 reverso da primeira demão (3' Cl).
      Nota: Os Primers foram desenhados por leme et al . para amplificação de toda a cadeia leve e pesada família genes5.
    2. Aplicam-se as seguintes condições de ciclismo: 94 ° C por 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 58 ° C para 55 e VLκ (60 ° C para VLλ) e VH s a 72 ° C, com um alongamento final passo a 72 ° C por 7 min.
    3. Para a segunda rodada PCR, use 3 µ l do primeiro produto de amplificação para um volume final de 40 µ l contendo 1,5 mM MgCl2, dNTPs de 0,25 mM, 2,5 unidades de DNA polimerase e 200 nM de primers internas contendo sites de enzima de restrição para clonagem em expressão vetores (veja a Figura 2 e Tabela de materiais para sequências da primeira demão).
      Nota: A composição do mix de primeiras demão interna. Para a amplificação da cadeia pesada: 9 encaminhar Cartilhas (5' AgeIVH mistura) e 3 reverter primeiras demão (3' SalIJH mix). Para a amplificação de cadeia leve kappa, 9 encaminhar as primeiras demão (5' AgeIV | misturar) e 3 reverter primeiras demão (3' BsiWIJκ mix). Para a amplificação de cadeia leve lambda, 6 encaminhar as primeiras demão (5' AgeIVl mix) e 1 reverso da primeira demão (3' XhoICl).
      Nota: Os Primers foram desenhados por leme et al, para a amplificação de toda a família de genes de cadeia leve e pesada5.
    4. Aplicam-se as seguintes condições de ciclismo: 94 ° C por 4 min, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94° C, 30 s a 58 ° C para VH e LCκ (60 ° C para LCλ) e 45 s a 72 ° C, com um alongamento final passo a 72 ° C por 7 min.
  5. Identifica poços positivos por migração 5 μL de produtos PCR de vH, vLκ e vLλ em um gel de agarose 1,5% (500 produtos de bp para segmentos de codificação de variável da cadeia pesada) e um produto bp 350 para variável cadeia leve codificação segmentos.
  6. Purifica os restantes 35 µ l produtos do PCR remanescentes de poços positivos usando membranas de ultrafiltração, projetadas para a purificação de produtos PCR.
  7. Eluir os produtos de PCR com 60 µ l de H2O.

5. a expressão clonagem

  1. Preparar as inserções
    Nota: Digerir 60 µ l de cada PCR purificado produto em um volume final de 100 µ l contendo o buffer de enzima de restrição apropriada.
    1. Para os produtos PCR vH, adicione 50 unidades da AgeI e 50 unidades de SalI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
    2. Para vLλ os produtos de PCR, adicione 50 unidades da AgeI e 50 unidades de XhoI e incubar durante 1 h a 37 ° C.
    3. Para vLκ os produtos de PCR, adicionar 50 unidades da AgeI e incubar durante 1 h a 37 ° C. Purificar o digere usando 96 PCR de membranas e eluir com 60 µ l de H2O. Digest o eluato de 60 µ l em um volume final de 100 µ l de tampão de enzima de restrição BsiWI, adicionar 50 unidades de BsiWI e incubar durante 1 h a 55 ° C.
    4. Inactivar as enzimas por aquecimento a 80 ° C por 15 min.
  2. Preparação de expressar vetores
    Nota: os produtos de PCR vH são clonados em um vetor de expressão (HCγ1) que contém a cadeia pesada constante Cγ1 de IgG1. vLκ produtos PCR são clonados em um vetor de expressão (LCκ) que contém a cadeia de luz constante Cκ. vLλ produtos PCR são clonados em um vetor de expressão (LCλ) que contém a cadeia de luz constante Cλ.
    1. Execute as digestões seguintes:
      1. Misturar 1 µ g de expressão vetorial HCγ1 com 10 unidades de AgeI e 10 unidades de SalI endonucleases em um volume total de 20 µ l de tampão de restrição recomendado pelo fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C.
      2. Misturar 1 µ g de vetor de expressão LCκ com 10 unidades de enzima de restrição AgeI em um volume total de 20 µ l de tampão de restrição recomendado pelo fabricante e incubar durante 1 h a 37° C. Adicionar 10 unidades de BsiWI enzima de restrição e incubar durante 1 h a 55 ° C.
      3. Misturar 1 µ g de vetor de expressão LCλ com 10 unidades de AgeI e 10 unidades de endonucleases XhoI em um volume total de 20 µ l de tampão de restrição recomendado pelo fabricante e incubar durante 1 h a 37 ° C
    2. Aqueça cada mistura de digestão a 65 ° C por 10 min inactivar as enzimas de restrição.
    3. Realizar a ligadura de 5 µ l de produto PCR digerido com 2 µ l (100 ng) do correspondente vetor de expressão linear em um volume total de 20 µ l de tampão de DNA ligase 1x com 1 unidade de T4 DNA-Ligase por incubação durante a noite a 4 ° C.
      Nota: Como alternativa, a ligadura é executada por 3 h a 4° C.
  3. Clonagem
    1. Electroporate 1 µ l da mistura de ligadura de 20 µ l em 45 µ l de electrocompetent caseiro TOP10 Escherichia coli (protocolos atuais em Biologia Molecular, seção 1.8.4-1.8.8). Imediatamente adicione 500 µ l de 2 médias X YT e incubar em banho-maria a 37 ° C por 30 min. bactérias propagação transformada em 2 x placas de ampicilina YT. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
    2. Para cada transformação, tela oito colônias pelo PCR.
      1. Configurar um premix de reação como segue no gelo: 45 µ l de 5 x tampão de PCR, 12 µ l de MgCl2 (25 mM), 4 µ l de dNTPs (a partir de uma estoque contendo 10 mM de cada um), 10 µ l de primer para a frente (estoque 10 µM) hybridizing à sequência de vetor (cartilha Ab-vec-sentido) e 10 µ l de primer reverso (estoque 10 µM) visando a região constante da cadeia leve ou pesado (consulte Tabela de materiais para sequências da primeira demão). Perfaz-se um volume final de 200 µ l com H2O. Em seguida, adicione 4 µ l da enzima DNA polimerase (5 U / µ l).
      2. Distribua 25 µ l de pré-mistura de reação por tubo PCR 8-tira no gelo.
      3. Use um palito de dente estéril para pegar colônias individuais. Marcam o palito em um prato de ampicilina 2 x TY por constituir uma placa replicar e em seguida mergulhá-lo em um tubo de reação de PCR.
      4. Realizar a triagem do PCR, sob as seguintes condições de ciclismo: 94 ° C por 10 min, seguido de 25 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 55 ° C e 50 s a 72 ° C.
      5. Identifica as bactérias positivas por migração 5 µ l dos produtos PCR em um gel de agarose 1,5%.
        Nota: Colônias positivos dão um produto PCR por volta de 850 bp para o vetor de cadeia pesada e 600 bp para o vetor de cadeia leve.
    3. Inocular a quatro colônias positivas da placa de replicar em 2 mL de meio LB e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação a 200 rpm.
    4. Extrai o plasmídeo de culturas líquidas usando um kit de purificação de plasmídeo, conforme indicado pelo fabricante.
    5. Verificar a correcta inserção dos domínios variáveis por Sanger sequenciamento do plasmídeo com o primer Ab-vec-sentido.
      Nota: Plasmídeos com a inserção correta (codificação o HC e a LC correspondente) devem ser cotransfected em 293A células de secreção. A especificidade de pequena escala-produzido mAbs é analisada por ELISA. Então, a produção em larga escala é executada se aplicável.

6. produção de mAbs

  1. Produção de pequena escala para a verificação da especificidade
    1. No dia anterior o transfection, rim embrionário humano 293A de semente 15.000 (HEK 293A) em 200 µ l de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de células FBS por bem em placas de 96 poços. Incubar durante uma noite em uma incubadora de CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
    2. Cotransfect 293A células em meio DMEM contendo 10% FBS usando um derivado o polyethylenimine linear como reagente de transfeccao.
      Nota: Execute o transfeccao triplica. O seguinte protocolo é para um bem de uma placa de 96 poços de fundo plano.
      1. Dilua 0,5 µ l de reagente de Transfeccao de DNA em 10 µ l de 150 mM de NaCl. Dilua a 0,125 µ g de vH e 0,125 µ g de vetores expressando vL em 10 µ l de 150 mM de NaCl. Vórtice cada diluição por 10 s.
      2. Adicione 10 µ l diluída reagente de Transfeccao de DNA em solução do ADN de 10 µ l. Vórtice 15 s e incube por 15 min à temperatura ambiente. Adicione a mistura de 20 µ l de drop-wise em células 293A e misturar suavemente agitando a placa.
    3. Substitua o médio 16 h após transfection e células de cultura durante 5 dias em meio livre de soro.
      Nota: Use meio livre de soro para evitar soro Igs contaminando os anticorpos produzidos.
    4. Elimine as células e restos por centrifugação a 460 x g durante 5 min.
    5. Sobrenadantes de colheita por aspiração com uma pipeta multicanal e transferi-los para uma placa de 96 V-fundo.
    6. Casaco Ag relevante durante a noite a 4 ° C, em 100 µ l por alvéolo de revestimento de ELISA/ELISPOT reconstituído buffer 1x em uma concentração final de 2 µ g/mL em placas de 96 poços ELISA. Consulte exemplos de 9.
    7. Bloco de poços com meio DMEM FBS de 10% para 2 h a 37 ° C
    8. Adicionar 50 µ l de sobrenadantes de células transfectadas 293A de passo 6.1.5 e incubar durante 2 h em RT
    9. Adicione 100 µ l de um anti-humano Conjugado IgG Ab a enzima peroxidase (HRP) de rábano 1 µ g/ml e incubar por 1h à temperatura ambiente. Adicionar o substrato cromogênico de 50 µ l (TMB) e incube por 20 min.
    10. Leia as densidades ópticas a 450 nm em um espectrofotômetro.
      Nota: Os mAbs específicos revelados pelo ensaio de ELISA pode ser ainda mais produzido em larga escala e purificado na proteína uma coluna apresentando afinidade com IgG humana.
  2. Produção em larga escala e purificação de mAbs específicos
    1. No dia anterior o transfeccao, semente 6 x 106 embrionárias rim humano 293A (HEK 293A) células em frascos de2 175 cm, contendo 25 mL DMEM suplementado com 10% FBS. Incubar durante uma noite em uma incubadora de CO2 (5% CO2) a 37 ° C.
      Nota: As células devem ser 70% confluente quando transfectadas.
    2. Cotransfect 293A células em meio DMEM contendo 10% FBS usando um derivado o polyethylenimine linear como reagente de transfeccao.
      1. Dilua 50 µ l de reagente de Transfeccao de DNA em 450 µ l de 150 mM de NaCl. Dilua 10 µ g de vH e 10 µ g de vetores expressando vL em 500 µ l de 150 mM de NaCl. Vórtice 10 s cada diluição.
      2. Adicione o reagente de Transfeccao de DNA diluído para a solução de DNA. Vórtice 15 s e incube por 15 min à temperatura ambiente. Adicione a mistura de 1 mL de drop-wise para as células e misturar suavemente agitando o balão.
    3. Substitua o médio 16 h após transfection e células de cultura durante 5 dias em meio livre de soro.
    4. Médio de colheita por aspiração com uma pipeta de 25 mL.
    5. Elimine as células e restos por centrifugação a 460 x g durante 5 min.
    6. Purificar os anticorpos usando uma coluna de 1 mL revestida com proteína A, em um sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida a 4 ° C.
      1. Equilibrar a proteína uma sepharose coluna com 20 mM de tampão de fosfato (pH 7).
      2. Filtre o meio de cultura celular de 6.2.5 usando um filtro de 1,22 µm e, em seguida, um filtro de 0,45 µm.
      3. Carrega o meio filtrado na coluna.
      4. Lavar com 20 mM de tampão de fosfato (pH 7) e eluir com um tampão de citrato de 0,1 M (pH 3,5).
      5. Leia as densidades ópticas em 280 nm em um Espectrofotômetro de absorção e imediatamente neutralizar proteicos fracções com 1 M Tris tampão (pH 9).
    7. Dialize Ab purificado durante a noite a 4 ° C, em uma gaveta com um peso molecular de 3,5 K corte contra tampão PBS (pH 7,4).
    8. Esterilize por pureza de filtragem e controle de 0,2 µm por cromatografia de exclusão de tamanho, conforme indicado pelo fabricante.

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Resultados

Partir de PBMC de doadores saudáveis, presentes neste projeto a geração de mAbs humana, que reconhece o peptídeo Pp65495 (Pp65, do citomegalovírus humano) apresentado pela classe complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Esses mAbs podem discriminar entre este complexo e complexos que representam outros peptídeos carregados no mesmo MHC-eu molécula.

PBMC foram corados com...

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Discussão

O protocolo proposto é um método poderoso para a geração de mAbs humano diretamente de células B Ag específicos circulantes no sangue. Ele combina três aspectos importantes: (i) a utilização de um enriquecimento magnético tetrâmero-associados, que permite um isolamento ex vivo de mesmo raras células B Ag-ligação; (ii) uma estratégia associada que usa três tetrâmeros de Ag (dois entes relevantes e um irrelevante) rotulados com três diferentes fluorochromes para isolar, por citometria de fluxo, apenas as células B...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a facilidade de citometria "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) por assistência técnica especializada. Agradecemos também toda a equipe de produção de proteína recombinante (P2R) e de plataformas de impacto (1232 INSERM, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) pelo apoio técnico. Agradecemos-Emmanuel Scotet e Richard Breathnach comentários construtivos sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projecto IHU-Cesti, financiado pelo programa de governo francês «Investissements d'Avenir», gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire. Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO programa apoiado pela Agência de investigação nacional, através do investimento do futuro programa ANR-11-LABX-0016-01.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Linha celular HEK 293AThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Fosfato Tampolado Salino (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 0,5M pH=8Invitrogen by Life Technologies15575-020
Soro fetal bovino (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - separação de linfócitos médioEuroBioCMSMSL01-01densidade 1,0777+/-0,001
estreptavidina R-ficoeritrina conjugadoInvitrogen da Life TechnologiesS21388premiun grau 1mg/ml contém 5mM azida sódica
Estreptavidina, conjugado aloficocianinaInvitrogen by thermoFisher scientificS323621mg/ml
2mM azida grau premium Violeta
brilhante 421 estreptavidinaBiolegend405225conc : 0,5mg/ml
MicroBeads magnéticos conjugados Anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801
MicroBeads magnéticos conjugados Anti-APCMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs ou QuadroMACS separotorMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
LS ColunasMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Diluição usada 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Diluição usada 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Diluição usada 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Diluição usada 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Diluição usada 1:1000
FACS ARIA III Classificador de células CitômetroBD Biosciences
Tubos de PCR de 8 tirasAxygen321-10-061
Racks para 96 microtubosDominique Dutscher45476
RNAseOUT Inibidor de ribonuclease (recombinante)Invitrogen por thermoFisher scientific10777-019qtd:5000U (40U/ul)
Água Destilada Dnase/Rnase FreeGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Hexâmeros aleatóriosInvitrogen por thermoFisher scientificN8080127quantidade: 50uM, 5nmoles
Superscript III Transcriptase reversaInvitrogen por thermoFisher scientific18080-044qtd: 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polimerasePromegaM7805
dNTP Set, grau de biologia molecularThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos -Primers reversos para Ig humana - Triagem de PCR de bactérias
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Primers reversos para Ig humana
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos - Primers diretos
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos - Primers diretos
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers reversos- Triagem de PCR de bactérias
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers avançados
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Forward primers
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Forward primers
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -Primers reversos - Triagem de PCR de bactérias
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Triagem de PCR de bactérias
QA Agarose-TM, Biologia Molecular GrauMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlateMacherey Nagel743.100.100
Enzima Idade I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzima SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzima Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzima BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (número de acesso FJ475055 do Genbank)
LCk (número de acesso ao Genbank FJ475056
LCl (acesso ao Genbank número FJ517647)
T4 DNA ligaseInvitrogen por thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT médioSigma AldrichY1003-500ML
AmpicilinaSigma Aldrich10835242001
LB (Luria Bertani) Caldo (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA e purificação de proteínasMacherey Nagel740588.250
Jet PEI DNA reagente de transfecção PolyPlus101-40
Fundo planoPlaca de 96 poçosFalcon353072
Placa de 96 poçosNunc/Thermofisher055142
Nunc easy 175 cm2 frascosNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT tampão de revestimentoeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp fundo plano 96 poços placas ELISANunc / Thermofisher44-2404-21alta ligação a proteínas
IgG anti-humano Ab conjugado à peroxidase de rábano (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
substrato TMBBD Biosciences555214
StreptavidinSigmaS0677
1 mL-HiTrap proteína A coluna HPGE Healthcare17-0402-01
Ä KTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 coluna 10/300 GLGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 PlusBioRad7880003
) Sistema de cromatografia

Referências

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  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

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