Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Resumo

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Resumo

Anticorpos monoclonais (mAbs) são poderosas ferramentas úteis para ambas as pesquisas fundamentais e em biomedicina. Sua alta especificidade é indispensável quando o anticorpo precisa distinguir entre estruturas altamente relacionadas (por exemplo, uma proteína normal e uma versão mutante respectivas). A maneira atual de gerar tais discriminatórios mAbs envolve extensa seleção de várias células B produtoras de Ab, que é caro e demorado. Propomos aqui um método rápido e econômico para a geração de discriminativa, mAbs plenamente humano a partir de sangue humano circulam os linfócitos B. A originalidade desta estratégia é devido a seleção de células de ligação B antígeno específico combinado com a Counter-seleção de todas as outras células, usando prontamente disponível periférico sangue mononucleares células (PBMC). Uma vez que células B específicas são isoladas, sequências de cDNA (complementar ácido desoxirribonucleico) que codifica para o mAb correspondente são obtidas usando a tecnologia de célula única reverso transcrição-cadeia da polimerase (RT-PCR) e posteriormente expressos em humanos células. Dentro de menos de 1 mês, é possível produzir miligramas de mAbs humana altamente discriminativa, dirigido contra praticamente qualquer antígeno desejado naturalmente detectado pelo repertório de células B.

Introdução

O método descrito aqui permite a produção rápida e versátil de totalmente humanas-anticorpos monoclonais (mAbs) contra um antígeno desejado (Ag). Celia é ferramentas essenciais em muitas aplicações de investigação fundamental em vitro e em vivo: fluxo cytometry, histologia, mancha ocidental, bloqueio e experimentos, por exemplo. Além disso, mAbs estão sendo usados cada vez mais na medicina para tratar doenças auto-imunes, câncer e controle de rejeição de transplante¹. Por exemplo, mAbs anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) foram recentemente usados como inibidores de ponto de verificação imune em tratamentos de câncer

Protocolo

Todas as amostras de sangue periférico humano foram obtidas de doadores anônimos adultos após consentimento informado, em conformidade com o Comitê de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimento PLER NTS-2016-08).

1. isolamento de células mononucleares de sangue periférico humano

Nota: A partir de material pode ser sangue periférico humano total ou cytapheresis amostras. As amostras não devem ter mais de 8 h e suplementado com anticoagulantes (por exemplo, heparina).

1. Dilua o sangue com 2 volumes (sangue periférico humano) ou 5 volumes (cytapheresis exemplo) de meio RP....

Resultados

Partir de PBMC de doadores saudáveis, presentes neste projeto a geração de mAbs humana, que reconhece o peptídeo Pp65₄₉₅ (Pp65, do citomegalovírus humano) apresentado pela classe complexo principal de histocompatibilidade I (MHC-eu) molécula HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Esses mAbs podem discriminar entre este complexo e complexos que representam outros peptídeos carregados no mesmo MHC-eu molécula.

PBMC foram corados com.......

Discussão

O protocolo proposto é um método poderoso para a geração de mAbs humano diretamente de células B Ag específicos circulantes no sangue. Ele combina três aspectos importantes: (i) a utilização de um enriquecimento magnético tetrâmero-associados, que permite um isolamento ex vivo de mesmo raras células B Ag-ligação; (ii) uma estratégia associada que usa três tetrâmeros de Ag (dois entes relevantes e um irrelevante) rotulados com três diferentes fluorochromes para isolar, por citometria de fluxo, apenas as células B.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular HEK 293A	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Fosfato Tampolado Salino (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Soro fetal bovino (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll - separação de linfócitos médio	EuroBio	CMSMSL01-01	densidade 1,0777+/-0,001
estreptavidina R-ficoeritrina conjugado	Invitrogen da Life Technologies	S21388	premiun grau 1mg/ml contém 5mM azida sódica
Estreptavidina, conjugado aloficocianina	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azida grau premium Violeta
brilhante 421 estreptavidina	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
MicroBeads magnéticos conjugados Anti-PE	Miltenyi Biotec	130-048-801
MicroBeads magnéticos conjugados Anti-APC	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs ou QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Colunas	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Diluição usada 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Diluição usada 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Diluição usada 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Diluição usada 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Diluição usada 1:1000
FACS ARIA III Classificador de células Citômetro	BD Biosciences
Tubos de PCR de 8 tiras	Axygen	321-10-061
Racks para 96 microtubos	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Inibidor de ribonuclease (recombinante)	Invitrogen por thermoFisher scientific	10777-019	qtd:5000U (40U/ul)
Água Destilada Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Hexâmeros aleatórios	Invitrogen por thermoFisher scientific	N8080127	quantidade: 50uM, 5nmoles
Superscript III Transcriptase reversa	Invitrogen por thermoFisher scientific	18080-044	qtd: 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polimerase	Promega	M7805
dNTP Set, grau de biologia molecular	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos -Primers reversos para Ig humana - Triagem de PCR de bactérias
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers externos - Primers reversos para Ig humana
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos - Primers diretos
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos - Primers diretos
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers diretos
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias pesadas - Primers internos -Primers reversos
5' LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers diretos
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers externos -Primers reversos- Triagem de PCR de bactérias
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers avançados
5'AgeIVk1_9_1– 13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves k - Primers internos -Primers diretos
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Primers diretos
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	Primeira rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers externos -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -primers diretos
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Segunda rodada de PCR - Amplificação de cadeias leves λ - Primers internos -Primers reversos - Triagem de PCR de bactérias
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Triagem de PCR de bactérias
QA Agarose-TM, Biologia Molecular Grau	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzima Idade I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzima SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzima Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzima BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (número de acesso FJ475055 do Genbank)
LCk (número de acesso ao Genbank FJ475056
LCl (acesso ao Genbank número FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen por thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT médio	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicilina	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Caldo (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA e purificação de proteínas	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA reagente de transfecção PolyPlus		101-40
Fundo planoPlaca de 96 poços	Falcon	353072
Placa de 96 poços	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 frascos	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT tampão de revestimento	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp fundo plano 96 poços placas ELISA	Nunc / Thermofisher	44-2404-21	alta ligação a proteínas
IgG anti-humano Ab conjugado à peroxidase de rábano (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
substrato TMB	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap proteína A coluna HP	GE Healthcare	17-0402-01
Ä KTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 coluna 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus	BioRad	7880003

) Sistema de cromatografia