Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

No ciclo celular, as células sofrem uma série de eventos altamente regulamentados e temporalmente controlados para a duplicação exata do seu genoma e proliferação. Nos mamíferos, o ciclo celular consiste em interfase e fase M. Na interfase, que consiste em três fases - G1, S, e G2, a célula duplica seu genoma e sofre o crescimento que é necessário para o ciclo celular normal progressão^1,2. Na fase M, que consiste de mitose (prófase, prometafase, metáfase, anáfase e telófase) e citocinese, uma célula parental produz duas células-filhas geneticamente idênticas. Em mitose, irmã cromátides irmãs de duplicação do genoma são condensado (prófase) e são capturados em seus cinetócoros por microtúbulos do fuso mitótico montado (prometafase), que dirige o seu alinhamento na placa metafásica (metáfase) seguida por seus igual a segregação quando irmã cromátides irmãs são divididos em direção e transportados para eixo oposto polos (anáfase). As duas células-filhas são fisicamente separadas pela atividade de um anel contrátil actina-baseado (telófase e citocinese). O cinetócoro é uma estrutura especializada proteicas que monta na região centromérica de cromátides irmãs e servem como locais de fixação para os microtúbulos do fuso. Sua principal função é conduzir a captura do cromossomo, alinhamento, e ajuda na correção de acessório do microtubule imprópria do eixo, enquanto mediando o checkpoint de montagem do eixo para manter a fidelidade do cromossoma segregação^3,4.

A técnica de sincronização do celular serve como uma ferramenta ideal para compreender os eventos moleculares e estruturais envolvidos na progressão do ciclo celular. Esta abordagem tem sido usada para enriquecer as populações de células em fases específicas para vários tipos de análises, incluindo a criação de perfil de expressão gênica, análises de processos bioquímicos celulares e detecção de Localização subcellular das proteínas. Células de mamíferos sincronizadas podem ser usadas não só para o estudo de produtos de genes individuais, mas também para abordagens envolvendo análise de genomas inteira, incluindo análise de microarray de gene expressão⁵, miRNA expressão padrões⁶, Regulamento de translação⁷e análise proteômica de proteína modificações⁸. Sincronização também pode ser usada para estudar os efeitos da expressão do gene ou a proteína knock-down ou mata-mata, ou de produtos químicos na progressão do ciclo celular.

As células podem ser sincronizadas em diferentes fases do ciclo celular. Métodos físicos e químicos são amplamente utilizados para sincronização do celular. Os critérios mais importantes para a sincronização de célula são que a sincronização deve ser fotoefeito e reversível. Devido as potenciais consequências celulares adversas de Sincronizando pilhas por agentes farmacológicos, métodos químico-dependente podem ser vantajosos para estudar eventos chave ciclo celular. Por exemplo, Hidroxiureia, amphidicolin, mimosine e lovastatina, podem ser usados para sincronização de célula na fase G1/S, mas, por causa de seu efeito sobre as vias bioquímicas que eles inibem, eles ativar mecanismos de ponto de verificação do ciclo celular e matar um importante fração das células^9,10. Por outro lado, feedback inibição da replicação do DNA pela adição de timidina para a mídia de crescimento, conhecida como "bloco" de timidina, pode prender o ciclo celular em certos pontos^11,12,13. As células também podem ser sincronizadas na fase G2/M, tratando com nocodazole e RO-3306^9,14. Nocodazole, que impede a montagem de microtúbulos, tem uma relativamente elevada citotoxicidade. Além disso, as células nocodazole-preso podem retornar para interphase precocemente por deslizamento mitótico. Dupla timidina bloco prisão células na fase G1/S e após o lançamento do bloco, as células encontram-se proceder de forma síncrona G2 e mitose. A normal progressão do ciclo celular por células liberado do bloco de timidina pode ser observada sob microscopia confocal de alta resolução por fixação da pilha ou imagens ao vivo. O efeito da perturbação das proteínas mitóticas pode ser estudado especificamente quando células entram e prosseguir através de mitose, após o lançamento do bloco de timidina duplo. Cdt1, uma proteína multifuncional, está envolvido em licenciamento de origem de replicação do DNA na fase G1 e também é necessária para anexos do microtubule cinetócoro durante a mitose¹⁵. Para estudar a função de Cdt1 durante a mitose, é necessário adoptar um método que evita o efeito de sua redução na replicação de licenciamento durante a fase G1, enquanto ao mesmo tempo efetuar sua redução especificamente na fase G2/M apenas. Aqui, apresentamos protocolos detalhados baseados no bloco de timidina duplo para estudar o papel mitótico das proteínas executar múltiplas funções durante as diferentes fases do ciclo celular de imagens fixas e viver-pilha.

1. double bloco de timidina e lançamento: preparações de reagente

1. Fazer 500 mL que Dulbecco modificado suplementado com 10% FBS, penicilina e estreptomicina médio (DMEM) águia.
2. Fazer estoque de 100 mM do thymidine em água estéril e loja em alíquotas a-80 ° C.

2. protocolo para a imagem latente de célula fixa de progressão mitótica (figura 1A)

1. No dia 1, semente ~ 2 x 10⁵ células de HeLa em poços de uma placa de 6 com uma lamela (esterilizados com 70% de etanol e irradiação UV) e 2 mL do meio DMEM. Crescem as células em uma incubadora umidificada por 24 h a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. 1 bloco de timidina^st : no dia 2, misture bem o volume necessário de timidina midiático DMEM fresco (100mm estoque, 2mm concentração final).
3. Adicionar 2 mL de timidina-contendo mídia para as células em cada poço do poço 6-placa e incubar por 18 h.
4. No dia 3, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco; desenvolvem-se células em meio fresco de DMEM escaldado para 9h às células do bloco de lançamento.
5. 2^nd timidina bloco: novamente, adicione 2 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células em cada poço da placa de 6-poços.
6. Encube por outro 18 h.
7. No dia 4, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.
8. SiRNAs diluído (controle e Cdt1) e reagente de transfeccao em meio de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.
9. Incubar as células a 37 ° C para 9-10 h para liberação de bloqueio e fixe as células sobre as lamínulas com 4% PFA por 20 min no RT
   Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.
10. Células de delgados, depois permeabilizing com detergente de 0,5% (v/v) durante 10 minutos a RT e lavar as células duas vezes com PBS 1x por 5 min cada.
    1. Bloquear células com BSA 1% (p/v) em 1X PBS por 1h no RT, seguido por tratamento de células com 50 µ l de anticorpos primários (anticorpo anti-α-tubulina rato diluído a 1:1, 000, anticorpo anti-Zwint1 diluído a 1: 400 e mouse antifosfo-ɣ H2AX diluído a 1: 300) em 1% (p/v) BSA em PBS 1x por 1h em 37 ^oC.
    2. Depois de lavar as células com 1X PBS três vezes, tratar as células com 50 µ l de anticorpos secundários para cada vidro de tampa (Alexa 488 e vermelho rodamina em diluições de 1: 250 em 1% (p/v) BSA em 1X PBS) por 1h no RT
    3. Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, tratar as células com DAPI (0.1µg / mL de 1X PBS) durante 5 min à RT
    4. Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, coloque a lamínula enfrentando as células para a mídia de montagem apropriado em um slide clara microscópica.
11. Imagem das células para as proteínas immunostained com 60 X ou 100 objectivo de imersão de óleo X 1.4 at plano-apocromático DIC montadas em um microscópio confocal invertido de alta resolução, equipado com uma câmera apropriada conforme necessário para a qualidade das imagens necessárias.
12. Adquira imagens em temperatura ambiente como z-pilhas de 0,2 µm de espessura utilizando software apropriado para o microscópio.

3. protocolo para a imagem latente de célula viva de progressão mitótica (Figura 3A)

1. No dia 1, cerca de 0,5-1 x 10⁵ células de HeLa estàvel expressando mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (ligeiramente variável com base no tipo de célula e as proteínas que eles expressam) em pratos de fundo de vidro de 35 milímetros com 1,5 mL de DMEM meio de sementes e cultivá-las em um umidificado incubadora para 24 h a 37 ^oC e 5% de CO₂.
2. 1 bloco de timidina^st : no dia 2, adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia às células no prato (timidina 100mm, concentração final de 2 mM,).
3. Incube por 18 h.
4. No dia 3, Aspire o meio contendo timidina e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.
5. SiRNAs diluído (controle e Hec1) e reagente de transfeccao, com média de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.
6. Desenvolvem-se células em 1,5 mL de meio fresco de DMEM escaldado para 8h às células do bloco de lançamento.
7. bloco de timidina^nd 2: adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células no prato.
8. Encube por outro 18 h.
9. No dia 4, Aspire o meio e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco. Desenvolvem-se células em fresca escaldada Leibovitz é (L-15) meio suplementado com 10% FBS e 20 mM HEPES pH 7.0 para 8h às células do bloco de lançamento.
10. Coloca o prato na câmara de controle de temperatura definida na alta resolução do microscópio confocal que já tem ligado pelo menos 30 min antes de iniciar a geração de imagens para estabilizar as temperaturas no palco e experimentais.
11. Concentre-se em campo claro, com o objectivo de 60 x até que as células são visíveis e, em seguida, manualmente, Peneire o palco para a região de escolha.
12. Configure a luz e energia/exposição do laser, parâmetros de aquisição de imagem e duração do experimento usando o software de aquisição de imagem do microscópio de escolha. Use filtros de GFP (488 excitação; 385 emissão nm) e mCherry (561 excitação nm e 385 nm de emissão) para adquirir imagens.
13. Realizar o experimento de lapso de tempo adquirindo separadamente a transmissão da luz pulsada e fluorescência imagens cada 10 min por um período até 16 h.
14. Adquira imagens como doze 1.0 separada µm z-aviões às 9 horas após o lançamento do bloco duplo timidina usando o software apropriado para o microscópio.
15. Analisar as imagens de rastreamento células individuais para progressão mitótica e finalmente montar o filme correspondente com o software de fonte Fiji/ImageJ.

Estudo de progressão mitótica e estabilidade de microtúbulos nas células fixo após o lançamento do bloco de timidina dobro
Cdt1 está envolvido no licenciamento das origens de replicação do DNA na fase G1. Ela é degradada durante a fase S, mas re-acumula-se na fase G2/M. Para estudar o seu papel na mitose, o Cdt1 endógeno precisa estar esgotado especificamente na fase de G/M, usando a técnica de sincronização de célula mais adequada, o dobro de timidina bloco15. As células foram transfectadas com siRNAs imediatamente após o lançamento do bloco 2nd timidina, quando as células são no S fase e época em que o licenciamento das origens de replicação no G1, que também requer a função de Cdt1, há muito tempo foi concluído. A depleção de Cdt1 após 9 h de Transfeccao de siCdt1 e duplo lançamento de bloco de timidina foi validada pela mancha ocidental (figura 1B). Fixação de células 9 h após o lançamento do bloco duplo timidina mostra que a maioria das células estão na fase de metáfase em controle e Cdt1 siRNA transfectadas células. Mas a fixação das células 10h após o lançamento do bloco duplo timidina mostra que siRNA-Tratado de Cdt1 maioria das células são ainda preso na fase tardia prometafase enquanto células controle digite anáfase e normalmente segregam os cromossomas como esperado (Figura 1 ). Para entender o efeito de depleção de Cdt1 na estabilidade do cinetócoro-microtubule (kMT), células foram fixadas às 9 horas após o lançamento do bloco de timidina dobro seguido de tratamento pelo frio, que apenas mantém estáveis cinetócoro-microtúbulos (kMTs). Os kMTs de células Cdt1 empobrecido são relativamente menos robustos após tratamento pelo frio comparado com a de células de controle (Figura 1). Assim, usando essa abordagem, a progressão das células mitóticas normais após a perturbação da função de somáticas mitóticas de interesse pode ser estudada efetivamente, mesmo sem o uso de imagens de células vivas.

A Figura 2 mostra que licenciamento de origem de replicação do DNA não é perturbado quando as células estão esgotadas de Cdt1 na fase G2/M usando nosso protocolo, que também foi observado em células de controle. Células empobrecidas de Cdt1 na fase G2/M não induz a acumulação de ɣH2AX fosforilada, um marcador de dano do ADN, durante a fase G2 subsequente; Considerando que a transfeccao siRNA de culturas assíncronos para esgotar Cdt1 induzidas pelo acúmulo de focos de fosfo-ɣH2AX-positivos, possivelmente devido a danos no DNA induzidos pelo licenciamento de replicação de DNA impróprio.

Estudo de progressão mitótica nas células após o lançamento do bloco duplo timidina por imagens de células vivas
Após o colapso do envelope nuclear (NEB), as células normais (na ausência de perturbação por uma proteína funcional mitótica) digite mitose e passam por início da anáfase para sair da mitose dentro de cerca de 30-60 min (Figura 3B). Mas encontra-se mediada por RNAi nocaute de Hec1, uma proteína chave cinetócoro que é necessária para a formação de apego de kMT robusto, para atrasar a progressão mitótica normal. Nesse cenário, a maioria das células entrar mitose após o NEB, mas não se submeter a início da anáfase ou sair da mitose mesmo após várias horas de atraso na mitose (Figura 3). Da mesma forma, o efeito do knockdown RNAi-mediada de qualquer outra proteína que localiza aos cinetócoros ou tendo uma função durante a mitose, portanto, observam efetivamente usando imagens de células vivas após lançamento de blocos de timidina duplo. Além de estudar a natureza da progressão mitótica, atraso e prisão, alguns dos outros principais mitóticos fenômenos que podem ser analisados usando este método incluem cromossomo alinhamento, formação do fuso mitótico e a ativação de posicionamento e silenciamento do posto de montagem do eixo.

Figura 1: análise de progressão mitótica e a estabilidade dos microtúbulos cinetócoro nas células fixas após a sincronização de timidina dobro. (A), A representação esquemática de imunofluorescência, fixação e sincronização de célula. (B) borrão ocidental para derrubada de Cdt1 após 9 h de lançamento do 2º bloco de timidina. (C) micrografias de imunofluorescência para mostrar as células mitóticas fixo 9 e 10 h após a liberação do bloco duplo timidina e tratamento com controle (topo) ou Cdt1 siRNA (parte inferior). Α-tubulina coloração em vermelho, DNA está em verde, como células expressam GFP-histona H2B. Barra de escala = 10 µm. células Prometaphase e metáfase são indicadas usando amarelo e branco pontas de seta, respectivamente. (D) HeLa células após tratamento com controle siRNA (painel superior) e depleção de Cdt1 (painel inferior) para 9 h após a saída da dupla bloco de timidina seguido por tratamento com Leibovitz gelada (L-15) médio e fixação. As células foram manchadas imunológico para eixo MT (verde) e um marcador do cinetócoro, Zwint1 (vermelho) e DAPI para DNA em preto e branco. Barra de escala = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Cdt1-esgotamento durante a fase G2/M não está no caminho da replicação licenciamento. Cdt1 siRNAs (painel central) ou dupla timidina sincronizado células HeLa tratadas com siRNA cdt1 durante a lavagem de timidina 2nd -out seguida de fixação às 10 h ou assíncronas células HeLa tratadocom com controle do luciferase (painel superior) após o lançamento (painel inferior) foram corados com DAPI (pseudo cor verde) e anticorpo antifosfo-ɣH2AX (vermelho). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: análise de progressão mitótica por célula viva imagem em sincronizado células. (A), A representação esquemática da sincronização de célula e imagens de células vivas. Células de HeLa estàvel expressando mCherry-histona H2B e GFP-α-tubulina foram liberados de bloco de timidina duplo para 8 h para deixá-los continuar em fase G2/M, de detenção de fase S. Imagem ao vivo foi realizada usando um microscópio confocal de alta resolução, começando 8 h após a liberação das células do bloco de timidina e continuando para até 16 h a partir desse ponto. Aqui são mostrados as imagens estáticas do vídeo capturado a cada 10 min para células de controle sem perturbação de qualquer proteína mitótica (B) ou células empobrecidas de subunidade Hec1 do Ndc80 complex (C). Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro concorrente.